引用本文： 王俊, 蔡治方, 劉堯, 兌丹華. 重癥急性胰腺炎大鼠血清高遷移率族蛋白-1對胰腺腺泡細胞死亡方式的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(3): 295-299. doi: 10.7507/1007-9424.20140071 復制
高遷移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB1）作為一種重要的晚期炎癥介質，參與了急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）的病理生理過程[1-3]，其還是決定細胞選擇死亡方式的一個關鍵信號[4]。近期更有研究[5]發現，HMGB1誘導細胞死亡的同時伴有巨大線粒體的形成，和細胞脹亡過程很相似。AP發生時，最早的病理學改變發生在腺泡細胞內，腺泡細胞對死亡信號的應答決定了AP的發生和發展[6-8]。本實驗通過建立重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠模型[9]，檢測其血清中HMGB1的濃度及胰腺腺泡細胞的脹亡百分比，并探討血清HMGB1濃度對胰腺腺泡細胞脹亡的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和設備
34只清潔級SD大鼠（雌雄不限，體質量250～300 g，8周齡，由重慶第三軍醫大學提供）；牛磺膽酸鈉（純度＞95%）、0.2%Ⅱ型膠原酶組織消化溶液及大鼠HMGB1 ELISA試劑盒（美國Sigma公司）；Annexin V-選擇性結合磷酯酰絲氨酸（FITC）細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術有限公司）。流式細胞儀（FACS calibur，美國Bio-RAD公司），高速臺式冷凍離心機（5804R，德國Eppendorf公司）。
1.2 方法
1.2.1 動物模型制備及分組
將32只大鼠按隨機數字表法隨機分為2組：假手術組（SO組）8只，SAP組24只。術前12 h禁食，不禁水。以10%水合氯醛（3.3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠（后同），于上腹部正中取一切口約2 cm長入腹。SO組大鼠開腹后僅翻動腸管后關腹。SAP組大鼠開腹后先于膽胰管內逆行注射3%牛磺膽酸鈉（1 mL/kg），見胰腺迅速出現水腫、充血、沿血管壁兩側發紅、或見點或片狀紫紅，則證實成功建立SAP模型，關腹。術后2組大鼠均皮下注射生理鹽水（40 mL/kg）行液體復蘇。建模成功后，SAP大鼠模型再按隨機數字表法隨機分為SAP-6 h組、SAP-12 h組及SAP-24 h組。分組后SAP-24 h組大鼠死亡2只，故在同批次大鼠中再抽取2只按相同標準建模補充。
1.2.2 血清HMGB1濃度的檢測
SO組大鼠于手
術后6 h麻醉取材（SO組無病理生理病程改變，幾個時間點的血液標本均可認為一致）。3個SAP亞組大鼠分別于術后6、12及24 h麻醉后，經原腹部切口入腹，用促凝管經下腔靜脈取血3～5 mL，室溫擱置片刻后，離心（3 000 r/min，r=15 cm，15 min）。用EP管收集上層血清，于-80℃冰箱內保存，備檢測血清HMGB1濃度，檢測方法按大鼠HMGB1 ELISA試劑盒說明書進行。
1.2.3 胰腺腺泡細胞脹亡百分比的檢測
取血后立即取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大的新鮮胰腺組織用生理鹽水沖洗干凈，用0.2%Ⅱ型膠原酶組織消化溶液消化40 min，制備胰腺腺泡細胞單細胞懸液[10-11]。采用流式細胞儀檢測胰腺腺泡細胞脹亡百分比：將計數合格（密度108～109個/L）的單細胞懸液在避光環境中加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色劑，操作按凋亡檢測試劑盒說明書進行，再測定脹亡細胞百分比。正常細胞：Annexin V-FITC和PI均低染；凋亡細胞：Annexin V-FITC高染、PI低染；脹亡細胞：Annexin V-FITC和PI均高染；壞死細胞：PI高染、Annexin V-FITC低染。
1.2.4 胰腺組織的病理學改變
取血后取新鮮胰腺組織（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）用生理鹽水沖洗后，再以10%甲醛液固定，石蠟包埋切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察胰腺組織的病理學改變。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計學軟件包進行數據分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 4組大鼠血清HMGB1濃度檢測結果
3個SAP亞組大鼠的血清HMGB1濃度均高于SO組（P＜0.01），建模6 h后即升高，為SO組的2.8倍；12 h進一步升高，為SO組的4.2倍；24 h時仍然維持在SO組的4.7倍水平。3個SAP亞組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05），大鼠血清HMGB1濃度隨時點延長逐漸升高（表 1）。
表1
4組大鼠的血清HMGB1濃度和胰腺腺泡細胞脹亡百分比結果（2.2 4組大鼠的胰腺腺泡細胞脹亡百分比檢測結果
3個SAP亞組大鼠的胰腺腺泡細胞脹亡百分比均高于SO組大鼠（P＜0.01）。SAP-6 h、SAP-12 h及SAP-24 h組的胰腺腺泡細胞脹亡百分比分別為SO組的5.1、7.8及11.0倍（P＜0.01）。3個SAP亞組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.01），大鼠胰腺腺泡細胞脹亡百分比隨時點延長逐漸升高（表 1和圖 1）。
圖1
示4組大鼠胰腺腺泡細胞的流式細胞圖。Q1：死亡細胞；Q2：脹亡細胞；Q3：凋亡細胞；Q4：正常細胞；1A：SO組；1B：SAP-6 h組；1C：SAP-12 h組；1D：SAP-24 h組??圖 2??示4組大鼠胰腺組織的病理學檢查結果（HE×100）。2A：SO組；2B：SAP-6 h組；2C：SAP-12 h組；2D：SAP-24 h組
Figure1.
Flow charts of pancreatic acinar cells in rats of 4 groups. Q1: Necrosis cells; Q2: Oncosis cells; Q3: Apoptosis cells; Q4: Normal cells; 1A: SO group; 1B: SAP-6 hour group; 1C: SAP-12 hour group; 1D: SAP-24 hour group ??Figure 2?? Pathological results of pancreatic tissues in rats of 4 groups(HE×100). 2A: SO group; 2B: SAP-6 hour group; 2C: SAP-12 hour group; 2D: SAP-24 hour group
2.3 4組大鼠胰腺組織的病理學改變結果
SO組大鼠的胰腺腺泡結構完整，偶見單個炎癥細胞浸潤。SAP-6 h組可見胰腺腺泡腫脹、間質水腫，炎癥細胞浸潤；SAP-12 h組及SAP-24 h組見胰腺病理學改變加重，部分腺泡細胞壞死，間質血管瘀血，局灶壞死，且隨時間延長其病理學改變加重（圖 2）。
2.4 SAP大鼠血清HMGB1濃度與胰腺腺泡細胞脹亡百分比的相關性分析
24 h內，隨著SAP大鼠血清HMGB1濃度的升高，腺泡細胞脹亡百分比增高（圖 3）。Pearson簡單相關性分析結果顯示：24 h內血清HMGB1濃度與胰腺腺泡細胞脹亡百分比呈正相關（r=0.846，P＜0.01）。
圖3
24 h內SAP大鼠血清HMGB1濃度與胰腺腺泡細胞脹亡百分比關系的散點圖
Figure3.
The scatter diagram of concentration of serum HMGB1 and oncosis percentage of pancreatic acinar cells in rats of SAP group during 24 hours after model establishment
3 討論
自1995年Majno等[12]提出以胞質空泡形成、細胞器腫脹和細胞核溶解為特點的細胞死亡方式——脹亡以來，細胞死亡方式在疾病發生、發展及診治中的重要作用日益受到人們的關注。1997年，美國毒理病理學會細胞死亡命名委員會將壞死作為細胞死亡的一種診斷名稱，而將凋亡和脹亡作為細胞死亡的兩種方式，澄清了細胞死亡的概念[13-14]，也為人們研究細胞死亡開辟了新思路。AP時胰酶被激活，各種炎癥介質及細胞因子激活和釋放的程度決定了AP從局部損傷引起全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）及多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的速度[15]。研究[16-18]顯示，AP發生時，最早的病理學改變發生在腺泡細胞內，腺泡細胞對死亡信號的應答決定了AP的發生和發展。受創后的腺泡細胞如果以脹亡方式死亡，會伴發劇烈的炎癥反應并引起炎癥因子瀑布樣級聯反應，從而加重AP病情[19]；而如果受創后腺泡細胞發生凋亡，則腺泡細胞的凋亡率與AP癥狀嚴重程度呈負性相關[16]。
HMGB1作為一種炎癥因子，同時也與染色體的穩定性有關，并參與細胞的轉錄等生理活動[20]。HMGB1可由炎癥細胞主動分泌，也可來自壞死細胞的被動釋放[21]。現已充分證實，SAP時，HMGB1作為晚期炎癥因子，通過誘導腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、黏附因子等的表達，參與病程中的瀑布樣級聯反應，對胰腺及胰外器官構成第二次打擊，誘發并加劇SIRS，甚至導致MODS [22]。HMGB1還是決定細胞死亡方式的一個關鍵信號[23]。本實驗結果表明：SAP組大鼠的血清HMGB1濃度明顯高于SO組，術后6 h即有明顯差別（P＜0.01），12 h進一步升高達到SO組的4.2倍（P＜0.01），24 h時仍然維持在高水平（P＜0.05）。華中科技大學楊智勇等[24]通過建立SAP大鼠模型，檢測建模后大鼠的血清HMGB1濃度，結果發現，血清HMGB1濃度在建模后12 h明顯升高，24～48 h維持在較高水平。本實驗結果與其基本相符。此外，本實驗結果還提示，術后SAP各亞組大鼠胰腺腺泡細胞的脹亡百分比均明顯高于SO組，且隨著SAP病程的發展，腺泡細胞脹亡百分比增高；Pearson簡單相關分析結果顯示，24 h內血清HMGB1濃度與胰腺腺泡細胞脹亡百分比呈正相關（r=0.846，P＜0.01）。提示HMGB1在介導炎癥反應的同時，可能通過誘導胰腺腺泡細胞脹亡而參與SAP的發展。
高遷移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB1）作為一種重要的晚期炎癥介質，參與了急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）的病理生理過程[1-3]，其還是決定細胞選擇死亡方式的一個關鍵信號[4]。近期更有研究[5]發現，HMGB1誘導細胞死亡的同時伴有巨大線粒體的形成，和細胞脹亡過程很相似。AP發生時，最早的病理學改變發生在腺泡細胞內，腺泡細胞對死亡信號的應答決定了AP的發生和發展[6-8]。本實驗通過建立重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠模型[9]，檢測其血清中HMGB1的濃度及胰腺腺泡細胞的脹亡百分比，并探討血清HMGB1濃度對胰腺腺泡細胞脹亡的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和設備
34只清潔級SD大鼠（雌雄不限，體質量250～300 g，8周齡，由重慶第三軍醫大學提供）；牛磺膽酸鈉（純度＞95%）、0.2%Ⅱ型膠原酶組織消化溶液及大鼠HMGB1 ELISA試劑盒（美國Sigma公司）；Annexin V-選擇性結合磷酯酰絲氨酸（FITC）細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術有限公司）。流式細胞儀（FACS calibur，美國Bio-RAD公司），高速臺式冷凍離心機（5804R，德國Eppendorf公司）。
1.2 方法
1.2.1 動物模型制備及分組
將32只大鼠按隨機數字表法隨機分為2組：假手術組（SO組）8只，SAP組24只。術前12 h禁食，不禁水。以10%水合氯醛（3.3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠（后同），于上腹部正中取一切口約2 cm長入腹。SO組大鼠開腹后僅翻動腸管后關腹。SAP組大鼠開腹后先于膽胰管內逆行注射3%牛磺膽酸鈉（1 mL/kg），見胰腺迅速出現水腫、充血、沿血管壁兩側發紅、或見點或片狀紫紅，則證實成功建立SAP模型，關腹。術后2組大鼠均皮下注射生理鹽水（40 mL/kg）行液體復蘇。建模成功后，SAP大鼠模型再按隨機數字表法隨機分為SAP-6 h組、SAP-12 h組及SAP-24 h組。分組后SAP-24 h組大鼠死亡2只，故在同批次大鼠中再抽取2只按相同標準建模補充。
1.2.2 血清HMGB1濃度的檢測
SO組大鼠于手
術后6 h麻醉取材（SO組無病理生理病程改變，幾個時間點的血液標本均可認為一致）。3個SAP亞組大鼠分別于術后6、12及24 h麻醉后，經原腹部切口入腹，用促凝管經下腔靜脈取血3～5 mL，室溫擱置片刻后，離心（3 000 r/min，r=15 cm，15 min）。用EP管收集上層血清，于-80℃冰箱內保存，備檢測血清HMGB1濃度，檢測方法按大鼠HMGB1 ELISA試劑盒說明書進行。
1.2.3 胰腺腺泡細胞脹亡百分比的檢測
取血后立即取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大的新鮮胰腺組織用生理鹽水沖洗干凈，用0.2%Ⅱ型膠原酶組織消化溶液消化40 min，制備胰腺腺泡細胞單細胞懸液[10-11]。采用流式細胞儀檢測胰腺腺泡細胞脹亡百分比：將計數合格（密度108～109個/L）的單細胞懸液在避光環境中加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色劑，操作按凋亡檢測試劑盒說明書進行，再測定脹亡細胞百分比。正常細胞：Annexin V-FITC和PI均低染；凋亡細胞：Annexin V-FITC高染、PI低染；脹亡細胞：Annexin V-FITC和PI均高染；壞死細胞：PI高染、Annexin V-FITC低染。
1.2.4 胰腺組織的病理學改變
取血后取新鮮胰腺組織（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）用生理鹽水沖洗后，再以10%甲醛液固定，石蠟包埋切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察胰腺組織的病理學改變。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計學軟件包進行數據分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 4組大鼠血清HMGB1濃度檢測結果
3個SAP亞組大鼠的血清HMGB1濃度均高于SO組（P＜0.01），建模6 h后即升高，為SO組的2.8倍；12 h進一步升高，為SO組的4.2倍；24 h時仍然維持在SO組的4.7倍水平。3個SAP亞組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05），大鼠血清HMGB1濃度隨時點延長逐漸升高（表 1）。
表1
4組大鼠的血清HMGB1濃度和胰腺腺泡細胞脹亡百分比結果（2.2 4組大鼠的胰腺腺泡細胞脹亡百分比檢測結果
3個SAP亞組大鼠的胰腺腺泡細胞脹亡百分比均高于SO組大鼠（P＜0.01）。SAP-6 h、SAP-12 h及SAP-24 h組的胰腺腺泡細胞脹亡百分比分別為SO組的5.1、7.8及11.0倍（P＜0.01）。3個SAP亞組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.01），大鼠胰腺腺泡細胞脹亡百分比隨時點延長逐漸升高（表 1和圖 1）。
圖1
示4組大鼠胰腺腺泡細胞的流式細胞圖。Q1：死亡細胞；Q2：脹亡細胞；Q3：凋亡細胞；Q4：正常細胞；1A：SO組；1B：SAP-6 h組；1C：SAP-12 h組；1D：SAP-24 h組??圖 2??示4組大鼠胰腺組織的病理學檢查結果（HE×100）。2A：SO組；2B：SAP-6 h組；2C：SAP-12 h組；2D：SAP-24 h組
Figure1.
Flow charts of pancreatic acinar cells in rats of 4 groups. Q1: Necrosis cells; Q2: Oncosis cells; Q3: Apoptosis cells; Q4: Normal cells; 1A: SO group; 1B: SAP-6 hour group; 1C: SAP-12 hour group; 1D: SAP-24 hour group ??Figure 2?? Pathological results of pancreatic tissues in rats of 4 groups(HE×100). 2A: SO group; 2B: SAP-6 hour group; 2C: SAP-12 hour group; 2D: SAP-24 hour group
2.3 4組大鼠胰腺組織的病理學改變結果
SO組大鼠的胰腺腺泡結構完整，偶見單個炎癥細胞浸潤。SAP-6 h組可見胰腺腺泡腫脹、間質水腫，炎癥細胞浸潤；SAP-12 h組及SAP-24 h組見胰腺病理學改變加重，部分腺泡細胞壞死，間質血管瘀血，局灶壞死，且隨時間延長其病理學改變加重（圖 2）。
2.4 SAP大鼠血清HMGB1濃度與胰腺腺泡細胞脹亡百分比的相關性分析
24 h內，隨著SAP大鼠血清HMGB1濃度的升高，腺泡細胞脹亡百分比增高（圖 3）。Pearson簡單相關性分析結果顯示：24 h內血清HMGB1濃度與胰腺腺泡細胞脹亡百分比呈正相關（r=0.846，P＜0.01）。
圖3
24 h內SAP大鼠血清HMGB1濃度與胰腺腺泡細胞脹亡百分比關系的散點圖
Figure3.
The scatter diagram of concentration of serum HMGB1 and oncosis percentage of pancreatic acinar cells in rats of SAP group during 24 hours after model establishment
3 討論
自1995年Majno等[12]提出以胞質空泡形成、細胞器腫脹和細胞核溶解為特點的細胞死亡方式——脹亡以來，細胞死亡方式在疾病發生、發展及診治中的重要作用日益受到人們的關注。1997年，美國毒理病理學會細胞死亡命名委員會將壞死作為細胞死亡的一種診斷名稱，而將凋亡和脹亡作為細胞死亡的兩種方式，澄清了細胞死亡的概念[13-14]，也為人們研究細胞死亡開辟了新思路。AP時胰酶被激活，各種炎癥介質及細胞因子激活和釋放的程度決定了AP從局部損傷引起全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）及多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的速度[15]。研究[16-18]顯示，AP發生時，最早的病理學改變發生在腺泡細胞內，腺泡細胞對死亡信號的應答決定了AP的發生和發展。受創后的腺泡細胞如果以脹亡方式死亡，會伴發劇烈的炎癥反應并引起炎癥因子瀑布樣級聯反應，從而加重AP病情[19]；而如果受創后腺泡細胞發生凋亡，則腺泡細胞的凋亡率與AP癥狀嚴重程度呈負性相關[16]。
HMGB1作為一種炎癥因子，同時也與染色體的穩定性有關，并參與細胞的轉錄等生理活動[20]。HMGB1可由炎癥細胞主動分泌，也可來自壞死細胞的被動釋放[21]。現已充分證實，SAP時，HMGB1作為晚期炎癥因子，通過誘導腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、黏附因子等的表達，參與病程中的瀑布樣級聯反應，對胰腺及胰外器官構成第二次打擊，誘發并加劇SIRS，甚至導致MODS [22]。HMGB1還是決定細胞死亡方式的一個關鍵信號[23]。本實驗結果表明：SAP組大鼠的血清HMGB1濃度明顯高于SO組，術后6 h即有明顯差別（P＜0.01），12 h進一步升高達到SO組的4.2倍（P＜0.01），24 h時仍然維持在高水平（P＜0.05）。華中科技大學楊智勇等[24]通過建立SAP大鼠模型，檢測建模后大鼠的血清HMGB1濃度，結果發現，血清HMGB1濃度在建模后12 h明顯升高，24～48 h維持在較高水平。本實驗結果與其基本相符。此外，本實驗結果還提示，術后SAP各亞組大鼠胰腺腺泡細胞的脹亡百分比均明顯高于SO組，且隨著SAP病程的發展，腺泡細胞脹亡百分比增高；Pearson簡單相關分析結果顯示，24 h內血清HMGB1濃度與胰腺腺泡細胞脹亡百分比呈正相關（r=0.846，P＜0.01）。提示HMGB1在介導炎癥反應的同時，可能通過誘導胰腺腺泡細胞脹亡而參與SAP的發展。
