引用本文： 吳驥, 管小青, 顧書成, 鄭向欣, 侍孝紅, 江小玲, 袁牧, 張旭旭. 乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67的表達及相關性分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(2): 197-201. doi: 10.7507/1007-9424.20140045 復制
近年來，乳腺癌的發病率呈持續上升的趨勢，占女性所患全部惡性腫瘤的23%，全世界每年新發乳腺癌約150萬例，尤其在大中城市漸成為女性首發的惡性腫瘤[1-2]。因此，深入研究乳腺癌發生的分子生物學機制，對于乳腺癌的防治具有重要意義。環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在惡性腫瘤，如肝癌[3]、胃癌[4-6]、大腸癌[7]、胰腺癌[8]等的發病機制中起著非常重要的作用。COX-2能通過促進腫瘤新生血管形成和腫瘤細胞增殖[9]，從而影響腫瘤患者預后。Ki-67是一種存在于增殖細胞中的核抗原，與細胞的有絲分裂有關，其表達能反映腫瘤的增殖活性。研究[10]表明，Ki-67在多種惡性腫瘤中高表達，并與惡性腫瘤的發生、發展有關。浸潤性導管癌是乳腺癌最常見的病理類型且預后差，在乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67表達的相關性臨床上少見報道。因此，我們采用免疫組織化學方法檢測乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67的表達，并分析兩者之間的相關性及其與臨床病理特征之間的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2008年1月至2013年1月期間在南京鼓樓醫院集團宿遷市人民醫院（徐州醫學院附屬宿遷醫院）甲乳外科接受乳腺癌改良根治術且病理類型為浸潤性導管癌的患者82例，均為女性；發病年齡34～66歲，（48.67±7.34）歲。絕經前患者48例，絕經后患者34例。依據2009年美國癌癥聯合會（AJCC）修訂的乳腺癌分期（第7版）標準[11]進行TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期47例，Ⅲ期25例。腫塊最大直徑≤2 cm者23例，＞2 cm者59例。伴有腋窩淋巴結轉移者48例，無腋窩淋巴結轉移者34例。組織學分級：Ⅰ級18例，Ⅱ級43例，Ⅲ級21例。伴脈管侵犯者55例，無脈管侵犯者27例。術前均未經放療、化療及內分泌治療。相應的距癌腫5 cm且經病理學證實的正常乳腺組織為對照組。所有病理診斷均經兩位病理科副高以上專家閱片復核證實。
1.2 免疫組織化學方法
1.2.1 SP法
手術切除組織標本均用10%甲醛中性緩沖液固定，石蠟包埋，4μm厚連續切片，行常規HE染色及免疫組織化學染色。鼠抗人COX-2單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、SP試劑盒及DAB底物顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。COX-2和Ki-67的抗體工作濃度均為1：100，實驗步驟按試劑盒說明書進行。用PBS代替一抗作為染色的陰性對照，用已知的COX-2染色陽性的結腸癌組織和已知的Ki-67染色陽性的胃癌組織分別作為陽性對照。
1.2.2 結果判定標準
COX-2表達產物主要定位于細胞漿，腫瘤細胞漿出現棕黃色或黃褐色均勻顆粒為陽性細胞；Ki-67陽性細胞為核著色，少數為較弱的細胞質染色，呈棕黃色或黃褐色線性分布。取任意5個高倍鏡（×400）視野中陽性細胞所占細胞總數比例的平均值為陽性細胞百分比，陽性細胞數＞5%為陽性（+），≤5%為陰性（―）。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析法，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 COX-2和Ki-67在乳腺浸潤性導管癌組織和相應癌旁正常乳腺組織中的表達結果
COX-2和Ki-67的免疫組織化學染色結果見圖 1。在82例乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2表達陽性率為71.95%（59/82），其在相應癌旁正常乳腺組織中的表達陽性率為8.54%（7/82），前者明顯高于后者（χ2=68.56，P < 0.001）；Ki-67蛋白表達陽性率在乳腺浸潤性導管癌組織和相應癌旁正常乳腺組織中分別為64.63%（53/82）和13.42%（11/82），前者明顯高于后者（χ2=45.20，P < 0.001）。
圖1
COX-2和Ki-67在乳腺浸潤性導管癌組織中的陽性表達（SP ×100）。1A：COX-2；1B：Ki-67
Figure1.
Positive expressions of COX-2 and Ki-6 in invasive ductal carcinoma of breast (SP ×100). 1A:COX-2;1B:Ki-67
2.2 COX-2和Ki-67的表達與乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理特征的關系
COX-2和Ki-67蛋白陽性表達與腫瘤臨床TNM分期（rs=0.349，P < 0.05；rs=0.305，P < 0.05）、淋巴結轉移（rs=0.336，P < 0.05；rs=0.419，P < 0.01）、脈管侵犯（rs=0.235，P < 0.05；rs=0.461，P < 0.01）及組織學分級（rs=0.434，P < 0.01；rs=0.378，P < 0.05）呈正相關；Ki-67蛋白陽性表達與腫瘤直徑呈正相關（rs=0.365，P < 0.01），而COX-2蛋白陽性表達與此無關（rs=0.135，P > 0.05）。COX-2和Ki-67的表達皆與患者是否絕經無關（rs=0.172，P > 0.05；rs=0.163，P > 0.05），見表 1。
表1
COX-2和Ki-67在乳腺浸潤性導管癌組織中的蛋白陽性表達與其臨床病理特征的關系
Table1.
Relationship of positive expressions of COX-2 and Ki-67 to clinicopathologic features in invasive ductal carcinoma of breast
2.3 乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67表達的相關性
在82例乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2陽性表達而Ki-67陰性表達者13例（15.84%），COX-2陰性表達而Ki-67陽性表達者7例（8.54%）；兩者均陽性表達者46例（56.10%），兩者均陰性表達者16例（19.51%）；經統計學分析在浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67表達呈正相關性（rs=0.475，P < 0.01）。
3 討論
3.1 COX-2與乳腺癌的關系
大量研究[12-14]發現，COX-2高表達與乳腺癌的發生、發展密切相關。COX-2通過介導前列腺素，尤其是前列腺素E2刺激腫瘤細胞的增殖，前列腺素E2在表皮生長因子的作用下刺激乳腺細胞增長，其作為上皮細胞分裂素通過增加雌激素水平直接刺激細胞增殖，芳香酶復合體與乳腺癌組織局部產生雌激素有關，COX-2催化的前列腺素E2可通過上調芳香酶活性，導致雌激素合成增加，從而使腫瘤細胞增殖[15]。COX-2可通過抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤新生血管生成及腫瘤細胞的侵襲和轉移等促進腫瘤的發生、發展，COX-2調節腫瘤細胞增殖和凋亡的具體機制可能通過其下游的各種前列腺素受體包括膜受體（G蛋白偶聯受體）和核內受體而發揮其相應的效應[16]，COX-2在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要的作用，從早期的增生到轉移的發生，COX-2的高表達貫穿于腫瘤發生、發展的整個過程[17]。郭貴龍等[18]的研究發現，在乳腺癌組織中46.8%的癌組織存在COX-2過表達，且COX-2陽性表達患者生存時間較短，與患者預后密切相關。另有研究[19]發現，MCF-7乳腺癌細胞表達的COX-2可誘導染色體組的不穩定、BCL-2的表達、對阿霉素等藥物的耐藥，從而促進乳腺癌的發生和進展，進一步提示COX-2將成為乳腺癌治療和預防的靶點。
本研究結果發現，在浸潤性導管癌組織中COX-2表達陽性率明顯高于其癌旁正常組織（P < 0.001），該結果與文獻[12-14, 18]報道相似；COX-2的陽性表達與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移、脈管侵犯及組織學分級呈正相關（P < 0.05）；與腫瘤大小及患者絕經與否無關；提示COX-2高表達與乳腺浸潤性導管癌的發生、發展密切相關。
3.2 Ki-67與乳腺癌的關系
Ki-67是1983年Gerdes等[20]用鼠源單克隆抗體檢測一種來自霍奇金淋巴瘤系細胞核抗原時首次發現的，是一種能識別存在于增殖細胞核基質內的核蛋白，能夠有效評估腫瘤細胞增殖活性的重要標志物。Ki-67在細胞周期活動期（G1晚期、S、G2和有絲分裂期）的增殖細胞中均有表達，但在靜止細胞中不表達；Ki-67蛋白表達可反映腫瘤細胞增殖活性，是目前公認的腫瘤細胞增殖的特異性指標；而腫瘤的高增殖又與腫瘤的浸潤生長和轉移有關[21-22]。據文獻[23]報道，40%的乳腺原位導管癌的Ki-67表達水平升高，其高表達水平還與乳腺癌病理分級、粉刺型壞死及微浸潤相關，正常的乳腺組織和非癌性乳腺組織中也可表達Ki-67，但一般不超過3%。Santisteban等[24]檢測了192例良性乳腺病組織，Ki-67表達的中位值是1.0%。von Minckwitz等[25]評價了196例乳腺癌患者新輔助治療中Ki-67的預測作用，該研究發現，Ki-67表達水平低的患者對三苯氧胺的應答效果較好，而Ki-67高表達水平組的患者對三苯氧胺的治療無額外受益。本研究小組[26]的結果發現，Ki-67在復發轉移性乳腺癌組織中表達較其在原發性乳腺癌組織中的表達增高，提示該類患者預后不良。
本研究結果顯示，Ki-67在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達陽性率為64.63%，相應癌旁正常乳腺組織中的表達陽性率為13.42%，與國內錢金鋒等[22]的報道結果相似；同時，Ki-67陽性表達與脈管侵犯、組織學分級及腫瘤直徑呈正相關；進一步表明Ki-67是反映乳腺癌生物學行為的可靠指標，可以作為判斷腫瘤細胞增殖狀態及評價乳腺癌預后的生物學指標。有關Ki-67表達與腋窩淋巴結轉移的關系是目前研究的熱點之一。本研究結果顯示，Ki-67表達與患者腋窩淋巴結轉移狀態呈正相關，與謝春華等[27]的研究結果不一致，尚有待于大樣本的進一步研究。
3.3 COX-2和Ki-67表達的相關性
本研究中將COX-2和Ki-67在82例乳腺浸潤性導管癌組織中的表達情況進行了相關分析，發現二者的蛋白陽性表達之間呈正相關（rs=0.475，P < 0.01），但二者之間的具體作用機制尚不明確，這提示COX-2和Ki-67均可作為反映乳腺浸潤性導管癌生物學行為的客觀參考指標。COX-2有可能通過誘導Ki-67的表達升高來促進乳腺癌細胞的惡性增殖和分化，抑制癌細胞的凋亡，提示與乳腺癌的發生、發展密切相關[28]；COX-2和Ki-67在腫瘤形成過程中的內在關系尚需進一步研究。
綜上所述，乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67的蛋白陽性表達呈顯著正相關，并與乳腺浸潤性導管癌患者的臨床病理特征有密切關系，提示二者在乳腺浸潤性導管癌發生、發展中發揮著重要作用，對兩者進行聯合檢測，可作為反映其生物學行為的指標；選擇性COX-2抑制劑的開發有望為腫瘤預防及治療開辟新的途徑。
近年來，乳腺癌的發病率呈持續上升的趨勢，占女性所患全部惡性腫瘤的23%，全世界每年新發乳腺癌約150萬例，尤其在大中城市漸成為女性首發的惡性腫瘤[1-2]。因此，深入研究乳腺癌發生的分子生物學機制，對于乳腺癌的防治具有重要意義。環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在惡性腫瘤，如肝癌[3]、胃癌[4-6]、大腸癌[7]、胰腺癌[8]等的發病機制中起著非常重要的作用。COX-2能通過促進腫瘤新生血管形成和腫瘤細胞增殖[9]，從而影響腫瘤患者預后。Ki-67是一種存在于增殖細胞中的核抗原，與細胞的有絲分裂有關，其表達能反映腫瘤的增殖活性。研究[10]表明，Ki-67在多種惡性腫瘤中高表達，并與惡性腫瘤的發生、發展有關。浸潤性導管癌是乳腺癌最常見的病理類型且預后差，在乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67表達的相關性臨床上少見報道。因此，我們采用免疫組織化學方法檢測乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67的表達，并分析兩者之間的相關性及其與臨床病理特征之間的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2008年1月至2013年1月期間在南京鼓樓醫院集團宿遷市人民醫院（徐州醫學院附屬宿遷醫院）甲乳外科接受乳腺癌改良根治術且病理類型為浸潤性導管癌的患者82例，均為女性；發病年齡34～66歲，（48.67±7.34）歲。絕經前患者48例，絕經后患者34例。依據2009年美國癌癥聯合會（AJCC）修訂的乳腺癌分期（第7版）標準[11]進行TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期47例，Ⅲ期25例。腫塊最大直徑≤2 cm者23例，＞2 cm者59例。伴有腋窩淋巴結轉移者48例，無腋窩淋巴結轉移者34例。組織學分級：Ⅰ級18例，Ⅱ級43例，Ⅲ級21例。伴脈管侵犯者55例，無脈管侵犯者27例。術前均未經放療、化療及內分泌治療。相應的距癌腫5 cm且經病理學證實的正常乳腺組織為對照組。所有病理診斷均經兩位病理科副高以上專家閱片復核證實。
1.2 免疫組織化學方法
1.2.1 SP法
手術切除組織標本均用10%甲醛中性緩沖液固定，石蠟包埋，4μm厚連續切片，行常規HE染色及免疫組織化學染色。鼠抗人COX-2單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、SP試劑盒及DAB底物顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。COX-2和Ki-67的抗體工作濃度均為1：100，實驗步驟按試劑盒說明書進行。用PBS代替一抗作為染色的陰性對照，用已知的COX-2染色陽性的結腸癌組織和已知的Ki-67染色陽性的胃癌組織分別作為陽性對照。
1.2.2 結果判定標準
COX-2表達產物主要定位于細胞漿，腫瘤細胞漿出現棕黃色或黃褐色均勻顆粒為陽性細胞；Ki-67陽性細胞為核著色，少數為較弱的細胞質染色，呈棕黃色或黃褐色線性分布。取任意5個高倍鏡（×400）視野中陽性細胞所占細胞總數比例的平均值為陽性細胞百分比，陽性細胞數＞5%為陽性（+），≤5%為陰性（―）。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析法，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 COX-2和Ki-67在乳腺浸潤性導管癌組織和相應癌旁正常乳腺組織中的表達結果
COX-2和Ki-67的免疫組織化學染色結果見圖 1。在82例乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2表達陽性率為71.95%（59/82），其在相應癌旁正常乳腺組織中的表達陽性率為8.54%（7/82），前者明顯高于后者（χ2=68.56，P < 0.001）；Ki-67蛋白表達陽性率在乳腺浸潤性導管癌組織和相應癌旁正常乳腺組織中分別為64.63%（53/82）和13.42%（11/82），前者明顯高于后者（χ2=45.20，P < 0.001）。
圖1
COX-2和Ki-67在乳腺浸潤性導管癌組織中的陽性表達（SP ×100）。1A：COX-2；1B：Ki-67
Figure1.
Positive expressions of COX-2 and Ki-6 in invasive ductal carcinoma of breast (SP ×100). 1A:COX-2;1B:Ki-67
2.2 COX-2和Ki-67的表達與乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理特征的關系
COX-2和Ki-67蛋白陽性表達與腫瘤臨床TNM分期（rs=0.349，P < 0.05；rs=0.305，P < 0.05）、淋巴結轉移（rs=0.336，P < 0.05；rs=0.419，P < 0.01）、脈管侵犯（rs=0.235，P < 0.05；rs=0.461，P < 0.01）及組織學分級（rs=0.434，P < 0.01；rs=0.378，P < 0.05）呈正相關；Ki-67蛋白陽性表達與腫瘤直徑呈正相關（rs=0.365，P < 0.01），而COX-2蛋白陽性表達與此無關（rs=0.135，P > 0.05）。COX-2和Ki-67的表達皆與患者是否絕經無關（rs=0.172，P > 0.05；rs=0.163，P > 0.05），見表 1。
表1
COX-2和Ki-67在乳腺浸潤性導管癌組織中的蛋白陽性表達與其臨床病理特征的關系
Table1.
Relationship of positive expressions of COX-2 and Ki-67 to clinicopathologic features in invasive ductal carcinoma of breast
2.3 乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67表達的相關性
在82例乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2陽性表達而Ki-67陰性表達者13例（15.84%），COX-2陰性表達而Ki-67陽性表達者7例（8.54%）；兩者均陽性表達者46例（56.10%），兩者均陰性表達者16例（19.51%）；經統計學分析在浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67表達呈正相關性（rs=0.475，P < 0.01）。
3 討論
3.1 COX-2與乳腺癌的關系
大量研究[12-14]發現，COX-2高表達與乳腺癌的發生、發展密切相關。COX-2通過介導前列腺素，尤其是前列腺素E2刺激腫瘤細胞的增殖，前列腺素E2在表皮生長因子的作用下刺激乳腺細胞增長，其作為上皮細胞分裂素通過增加雌激素水平直接刺激細胞增殖，芳香酶復合體與乳腺癌組織局部產生雌激素有關，COX-2催化的前列腺素E2可通過上調芳香酶活性，導致雌激素合成增加，從而使腫瘤細胞增殖[15]。COX-2可通過抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤新生血管生成及腫瘤細胞的侵襲和轉移等促進腫瘤的發生、發展，COX-2調節腫瘤細胞增殖和凋亡的具體機制可能通過其下游的各種前列腺素受體包括膜受體（G蛋白偶聯受體）和核內受體而發揮其相應的效應[16]，COX-2在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要的作用，從早期的增生到轉移的發生，COX-2的高表達貫穿于腫瘤發生、發展的整個過程[17]。郭貴龍等[18]的研究發現，在乳腺癌組織中46.8%的癌組織存在COX-2過表達，且COX-2陽性表達患者生存時間較短，與患者預后密切相關。另有研究[19]發現，MCF-7乳腺癌細胞表達的COX-2可誘導染色體組的不穩定、BCL-2的表達、對阿霉素等藥物的耐藥，從而促進乳腺癌的發生和進展，進一步提示COX-2將成為乳腺癌治療和預防的靶點。
本研究結果發現，在浸潤性導管癌組織中COX-2表達陽性率明顯高于其癌旁正常組織（P < 0.001），該結果與文獻[12-14, 18]報道相似；COX-2的陽性表達與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移、脈管侵犯及組織學分級呈正相關（P < 0.05）；與腫瘤大小及患者絕經與否無關；提示COX-2高表達與乳腺浸潤性導管癌的發生、發展密切相關。
3.2 Ki-67與乳腺癌的關系
Ki-67是1983年Gerdes等[20]用鼠源單克隆抗體檢測一種來自霍奇金淋巴瘤系細胞核抗原時首次發現的，是一種能識別存在于增殖細胞核基質內的核蛋白，能夠有效評估腫瘤細胞增殖活性的重要標志物。Ki-67在細胞周期活動期（G1晚期、S、G2和有絲分裂期）的增殖細胞中均有表達，但在靜止細胞中不表達；Ki-67蛋白表達可反映腫瘤細胞增殖活性，是目前公認的腫瘤細胞增殖的特異性指標；而腫瘤的高增殖又與腫瘤的浸潤生長和轉移有關[21-22]。據文獻[23]報道，40%的乳腺原位導管癌的Ki-67表達水平升高，其高表達水平還與乳腺癌病理分級、粉刺型壞死及微浸潤相關，正常的乳腺組織和非癌性乳腺組織中也可表達Ki-67，但一般不超過3%。Santisteban等[24]檢測了192例良性乳腺病組織，Ki-67表達的中位值是1.0%。von Minckwitz等[25]評價了196例乳腺癌患者新輔助治療中Ki-67的預測作用，該研究發現，Ki-67表達水平低的患者對三苯氧胺的應答效果較好，而Ki-67高表達水平組的患者對三苯氧胺的治療無額外受益。本研究小組[26]的結果發現，Ki-67在復發轉移性乳腺癌組織中表達較其在原發性乳腺癌組織中的表達增高，提示該類患者預后不良。
本研究結果顯示，Ki-67在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達陽性率為64.63%，相應癌旁正常乳腺組織中的表達陽性率為13.42%，與國內錢金鋒等[22]的報道結果相似；同時，Ki-67陽性表達與脈管侵犯、組織學分級及腫瘤直徑呈正相關；進一步表明Ki-67是反映乳腺癌生物學行為的可靠指標，可以作為判斷腫瘤細胞增殖狀態及評價乳腺癌預后的生物學指標。有關Ki-67表達與腋窩淋巴結轉移的關系是目前研究的熱點之一。本研究結果顯示，Ki-67表達與患者腋窩淋巴結轉移狀態呈正相關，與謝春華等[27]的研究結果不一致，尚有待于大樣本的進一步研究。
3.3 COX-2和Ki-67表達的相關性
本研究中將COX-2和Ki-67在82例乳腺浸潤性導管癌組織中的表達情況進行了相關分析，發現二者的蛋白陽性表達之間呈正相關（rs=0.475，P < 0.01），但二者之間的具體作用機制尚不明確，這提示COX-2和Ki-67均可作為反映乳腺浸潤性導管癌生物學行為的客觀參考指標。COX-2有可能通過誘導Ki-67的表達升高來促進乳腺癌細胞的惡性增殖和分化，抑制癌細胞的凋亡，提示與乳腺癌的發生、發展密切相關[28]；COX-2和Ki-67在腫瘤形成過程中的內在關系尚需進一步研究。
綜上所述，乳腺浸潤性導管癌組織中COX-2和Ki-67的蛋白陽性表達呈顯著正相關，并與乳腺浸潤性導管癌患者的臨床病理特征有密切關系，提示二者在乳腺浸潤性導管癌發生、發展中發揮著重要作用，對兩者進行聯合檢測，可作為反映其生物學行為的指標；選擇性COX-2抑制劑的開發有望為腫瘤預防及治療開辟新的途徑。
