引用本文： 黃立勇, 潘杰, 盧星榕, 池畔. miR-196和HoxB8與結直腸癌Folfox4化療敏感性的相關研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(1): 35-39. doi: 10.7507/1007-9424.20140007 復制
目前，結直腸癌的發病率和死亡率均位居惡性腫瘤的第3位[1]，國內的發病率和死亡率也呈上升趨勢[2]。在腫瘤早期，多數結直腸癌可通過手術治療治愈，但對局部進展及發生遠處轉移的患者，需聯合化療來治療，目前，Folfox4方案是臨床上針對進展期結直腸癌患者較常用的化療方案之一。筆者的研究發現（待發表），HoxB8基因的差異表達與Folfox4化療方案的敏感性相關，在結直腸癌細胞中通過RNAi方式抑制HoxB8基因表達，可顯著提高結直腸癌細胞對化療藥物的敏感性。國外有研究[3]發現，HoxB8的上游調控基因miR-196的表達差異也可導致結直腸癌細胞對鉑類化療藥物敏感性的不同。本研究擬通過檢測結直腸癌患者新輔助化療組與未行化療組，以及化療敏感組與不敏感組中miR-196及HoxB8表達的差異，以探討兩者表達水平與Folfox4化療方案的相關性及其意義。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取2008年11月至2011年12月期間在福建醫科大學協和醫院結直腸外科手術切除的80例結直腸癌組織標本，所有患者均經術后病理檢查確診，其臨床及病理資料完整，所有病例在接受治療前均未行其他治療。納入研究的80例患者，根據其治療方式的不同分為了新輔助化療組（50例）和未化療組（30例）。患者接受入選組的治療計劃并簽署知情同意書。對于接受新輔助化療（Folfox4≥3次）的患者，于化療前后均常規行腹部及盆腔CT或MR掃描檢查，并請影像學專家根據實體腫瘤評價標準（RECIST標準）[4]對化療反應進行評估，將完全緩解（CR）和部分緩解（PR）者納入敏感組（25例），而疾病穩定（SD）和疾病進展（PD）者則納入不敏感組（25例）。3組患者的基本資料見表 1，由表 1可見，3組患者的基本資料相似，具有可比性。
表1
3組患者的基本資料
Table1.
The basic data of patients in 3 groups
1.2 治療
1.2.1 新輔助化療組
均采用Folfox4方案化療，至少完成3個周期，即奧沙利鉑（OXA）85 mg/m2（第1天）聯合亞葉酸鈣（LV）200 mg/m2（第1和第2天）靜脈滴注2 h，序貫氟脲嘧啶（FU）400 mg/m2靜脈推注以及1 200 mg/m2持續44 h靜脈滴注，每2周為1個療程，≥3療程。患者于化療前后行腹部及盆腔CT或MR檢查，根據RECIST實體瘤評判標準對腫瘤化療反應進行評估。于化療結束后4～6周進行手術切除腫瘤。
1.2.2 未化療組
納入該組的患者經相關檢查無明顯手術禁忌證后行標準結直腸癌根治術。
所有納入研究患者的手術切除標本離體后均迅速放入10%甲醛固定液中保存，并及時送筆者所在醫院病理科行石蠟包埋保存，以盡量降低其RNA的降解。
1.3 方法
1.3.1 主要試劑與儀器
病理組織蠟塊中總RNA提取試劑盒（miRNeasy FFPE Kit）購自德國QIAG-ENE公司；逆轉錄試劑盒（miScript Reverse Transc-ription Kit）及熒光定量PCR試劑盒（miScript SYBR Green PCR Kit）均購自日本TAKARA公司；miR-196、 HoxB8及內參照U6引物委托商業公司（上海生工）合成（表 2）；HoxB8抗體（goat polyclonal IgG）購自美國santa cruz公司（產品代號：sc-82879），工作濃度為1︰200；SABC試劑盒（包含有二抗：SA1023-山羊IgG）購買自武漢博士德生物公司；酶標儀（DU-600型分光度計）為Beckman公司產品，real-time PCR儀ABI 7500 Fast為美國Ambion公司產品。
表2
real-time PCR的引物序列
Table2.
Primer sequence of real-time PCR
1.3.2 石蠟包埋組織的總RNA提取切取10 μm
厚石蠟組織塊2片，放入經焦碳酸二乙酯（DEPC）水及高壓處理后的1.5 mL EP管中，加1 mL二甲苯常規脫蠟2次，盡可能清除石蠟，經100%乙醇洗滌2次后離心（14 000 r/min，r=8 cm，2 min），除去乙醇，室溫晾干15 min使剩余乙醇完全揮發。參照德國QIAGENE公司miRNeasy FFPE Kit試劑盒說明書中的方法，提取蠟塊組織中的總RNA（包括mRNA和microRNA），將所提取的總RNA溶于15～20 μL的去核糖核酸酶（Rnase-free）水中，用酶標儀測定所提取的總RNA溶液濃度以及波長260 nm和280 nm處的吸光度值（A值），選取總RNA濃度大于100 ng/μL及A260 /A280比值介于1.8～2.1之間者用于后續實驗。
1.3.3 miR-196和HoxB8的逆轉錄反應
參照日本TAKARA公司逆轉錄試劑盒產品說明書配制逆轉錄反應混合液（2×miRNA逆轉錄緩沖液10 μL；0.1%BSA 2 μL；miRNA逆轉錄酶混合液2 μL；RNA定量至0.5 μg，加Rnase-free水至總反應液量達20 μL），反應條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，得到的cDNA于-20 ℃保存。
1.3.4 SYBR Green熒光定量PCR
參照日本TAK-ARA公司的熒光定量PCR試劑盒說明書分別配制miR-196和HoxB8的反應混合液（SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL；F-Primer 0.8 μL；R-Primer 0.8 μL；校正染料（ROX Reference Dye Ⅱ）0.4 μL；RNase-free水6 μL；cDNA 2 μL），反應條件參照說明書如下：預變性95 ℃ 30 s；PCR反應：95 ℃，3 s；60 ℃，30 s，共40個循環，均以U6為內參照，重復3個復孔，取所得Ct均值；采用2-ΔΔct法分析。
1.3.5 HoxB8蛋白表達檢測
采用免疫組化SABC法檢測化療敏感組及不敏感組中HoxB8蛋白的表達情況。參照說明書進行實驗，以PBS代替一抗作陰性對照，陽性對照圖片由試劑公司提供。結果判定標準：按每張切片中的陽性細胞的百分比和著色深淺計分，行半定量分析[5-6]。在高倍鏡視野下（400倍）隨機選取5個視野（上中下及左右），根據其著色強度評分：0分為無著色；1分為淡黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色；并根據陽性細胞百分比評分：陽性細胞所占百分比＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。分別計算其均值，最后將兩項評分的乘積作為總評分，總分為0分判為陰性（?），1～3分判為弱陽性（＋），4～7分判為陽性（＋＋），8～12分判為強陽性（＋＋＋）。以上結果判斷均在雙盲法下進行。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件包進行數據分析。計量資料數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 新輔助化療組與未化療組中miR-196和HoxB8 mRNA表達檢測結果
新輔助化療組中miR-196和HoxB8 mRNA的相對表達量分別為0.646 8±0.683 9和0.607 6±0.418 9，其表達水平均低于未化療組的1.000 0±0.000 0和1.000 0±0.000 0（均P＜0.01）。
2.2 化療敏感組與不敏感組中miR-196和HoxB8 mRNA表達檢測結果
2.2.1 PCR結果
miR-196在化療敏感組與不敏感組中的表達相對量分別為0.948 9±0.691 0和0.344 7±0.536 1，化療敏感組的miR-196表達水平明顯高于不敏感組，Mann-Whitney檢驗提示2組間的差異有統計學意義（Z=-3.172，P＜0.01）。HoxB8 mRNA在化療敏感組與不敏感組中的表達相對量分別為0.489 9±0.371 5和0.725 3±0.437 5，化療敏感組的HoxB8 mRNA表達水平低于不敏感組，Mann-Whitney檢驗提示2組間的差異有統計學意義（Z=-2.222，P＜0.05）。
2.2.2 免疫組化染色結果
結果見圖 1和表 3。由圖 1和表 3可見，HoxB8蛋白在結直腸癌組織中主要表達于細胞質；在化療敏感組其HoxB8蛋白表達陽性率低于不敏感組，經Mann-Whitney檢驗其差異有統計學意義（Z=-2.396，P=0.017）。
圖1
示HoxB8蛋白在結直腸癌組織中的表達（SABC ×400）。1A：敏感組；1B：不敏感組
Figure1.
Expression of HoxB8 protein in colorectal carcinoma tissues (SABC ×400). 1A:Sensitive group; 1B:Insensitive group
表3
化療敏感組與不敏感組HoxB8蛋白表達檢測結果〔例（%）〕
Table3.
Results of HoxB8 protein expression between the sensitive group and insensitive group for chemotherapy〔case(%)〕
2.3 miR-196和HoxB8 mRNA表達的相關性分析結果
在未化療組的30例患者中，miR-196和HoxB8 mRNA表達存在負相關關系，其Spearman相關系數r=-0.435，P=0.016。在新輔助化療組的50例患者中，miR-196和HoxB8 mRNA表達也存在負相關關系，其Spearman相關系數r=-0.595，P＜0.01。
3 討論
微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種由內源基因編碼的小分子單鏈非編碼RNA，長約21～25個核苷酸，可以通過形成RNA誘導沉默復合體（RISC）與靶基因完全或不完全互補結合[7-9]，誘導靶mRNA的裂解或抑制蛋白翻譯來調控靶基因的表達[10-11]，也可以作為癌基因或抑癌基因參與惡性腫瘤的發生與演進[12-13]。miR-196是位于Hox基因家族上游的一類微小RNA，對Hox基因家族中多數成員的表達情況具有負向調控作用，且以對HoxB8的調控作用最為多見[3, 14-18]。研究發現miR-196在多種惡性腫瘤中表達升高：Bloomston等[19]發現，在胰腺癌患者組織中miR-196表達量較正常胰腺組織升高，且高表達miR-196時提示患者的預后差、生存期縮短；Liao等[20]利用qRT-PCR方法檢測63例胃癌患者的胃癌組織和癌旁組織中的miR-196表達，發現miR-196在胃癌組織中呈高表達，這一結果在Tsai等[21]的研究中也獲得了認可；Schimanski等[3]在對結腸癌和正常結腸黏膜進行定量PCR測定后發現，在結腸癌組織中，miR-196的表達水平亦有上調，而在相應的正常結腸黏膜中表達較低。在筆者研究小組的前期研究[22]發現，在30例術前未接受化療的結直腸癌患者切除的新鮮癌組織標本中miR-196的表達水平亦較正常黏膜中的表達水平升高（P＜0.05），與上述文獻報道結果相符。有研究還發現，一些化療藥物如5-FU或奧沙利鉑等可以改變大腸癌細胞中miRNAs分子表達水平，提示miRNA可能作為化療藥物作用的新型靶點，為新型抗癌藥物的開發提供新的策略和思路：Meng等[23]發現，在化療藥物的干預下，miRNA的表達譜會發生變化，進而提出將miRNA作為化療藥物療效的預測指標；Schimanski等[3]的研究也進一步指出，高濃度的miR-196可以使結直腸癌細胞對于鉑類藥物的化療敏感性升高。本研究結果提示：結直腸癌患者miR-196的表達水平在接受Folfox4方案化療后下降，且對化療的不同反應程度其表達水平有差異，敏感組中miR-196的表達水平較不敏感組為高，提示高表達的miR-196可以使患者對于Folfox4方案的化療敏感性提高，這在一定程度上與Schimanski等[3]的研究結果相吻合。
HoxB8是同源盒基因家族成員之一，位于人類第17號染色體，是一個序列特異性轉錄因子，其編碼的產物為DNA結合蛋白，在細胞的分化、發育和器官形成中發揮重要作用[24-25]。且有研究[26]表明，其在結直腸癌組織中相較正常黏膜呈高水平表達。筆者研究小組在前期細胞實驗中發現（待發表）：HoxB8的差異表達與Folfox4方案化療敏感性相關，且通過RNAi抑制HoxB8基因表達，能夠顯著提高結直腸癌細胞對化療藥物的敏感性。由此筆者進一步對接受Folfox4方案化療患者結直腸癌組織標本中HoxB8蛋白表達情況進行檢測，結果發現，結直腸癌患者在接受Folfox4方案化療干預后，HoxB8蛋白的表達陽性率降低，且對化療的不同敏感度其表達陽性率也有差異，敏感組中HoxB8的表達陽性率低于不敏感組，這進一步表明了HoxB8的高表達可以降低Folfox4化療的敏感性，與前期實驗結果相吻合。
同時，本研究對miR-196和HoxB8表達水平的相關性進行了分析，發現無論是在直接手術組還是新輔助化療組，miR-196和HoxB8的表達都存在負相關關系，進一步驗證了兩者之間具有調控關系，且在化療藥物干預后此調控作用依然存在。結合兩者在化療敏感組與不敏感組中的表達差異，筆者提出可以將miR-196和HoxB8在結直腸癌患者中的表達情況作為預測患者是否對Folfox4化療方案敏感的指標，來預測化療的反應性與毒性，通過檢測這兩個因子的表達水平來篩選能夠從Folfox4化療方案中獲益的患者，開展個體化治療；并且miR-196和HoxB8有望成為化療藥物作用的新型靶點，在藥物研制上可以通過直接抑制HoxB8的表達來提高化療藥物的敏感性，或是對其上游的調控基因miR-196進行干預，間接改變HoxB8的表達來提高患者的化療敏感性，為新型抗癌藥物的研發提供新的策略和思路。由于本實驗納入的病例數有限，相關結果有待進一步的大宗病例的研究予以證實。
目前，結直腸癌的發病率和死亡率均位居惡性腫瘤的第3位[1]，國內的發病率和死亡率也呈上升趨勢[2]。在腫瘤早期，多數結直腸癌可通過手術治療治愈，但對局部進展及發生遠處轉移的患者，需聯合化療來治療，目前，Folfox4方案是臨床上針對進展期結直腸癌患者較常用的化療方案之一。筆者的研究發現（待發表），HoxB8基因的差異表達與Folfox4化療方案的敏感性相關，在結直腸癌細胞中通過RNAi方式抑制HoxB8基因表達，可顯著提高結直腸癌細胞對化療藥物的敏感性。國外有研究[3]發現，HoxB8的上游調控基因miR-196的表達差異也可導致結直腸癌細胞對鉑類化療藥物敏感性的不同。本研究擬通過檢測結直腸癌患者新輔助化療組與未行化療組，以及化療敏感組與不敏感組中miR-196及HoxB8表達的差異，以探討兩者表達水平與Folfox4化療方案的相關性及其意義。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取2008年11月至2011年12月期間在福建醫科大學協和醫院結直腸外科手術切除的80例結直腸癌組織標本，所有患者均經術后病理檢查確診，其臨床及病理資料完整，所有病例在接受治療前均未行其他治療。納入研究的80例患者，根據其治療方式的不同分為了新輔助化療組（50例）和未化療組（30例）。患者接受入選組的治療計劃并簽署知情同意書。對于接受新輔助化療（Folfox4≥3次）的患者，于化療前后均常規行腹部及盆腔CT或MR掃描檢查，并請影像學專家根據實體腫瘤評價標準（RECIST標準）[4]對化療反應進行評估，將完全緩解（CR）和部分緩解（PR）者納入敏感組（25例），而疾病穩定（SD）和疾病進展（PD）者則納入不敏感組（25例）。3組患者的基本資料見表 1，由表 1可見，3組患者的基本資料相似，具有可比性。
表1
3組患者的基本資料
Table1.
The basic data of patients in 3 groups
1.2 治療
1.2.1 新輔助化療組
均采用Folfox4方案化療，至少完成3個周期，即奧沙利鉑（OXA）85 mg/m2（第1天）聯合亞葉酸鈣（LV）200 mg/m2（第1和第2天）靜脈滴注2 h，序貫氟脲嘧啶（FU）400 mg/m2靜脈推注以及1 200 mg/m2持續44 h靜脈滴注，每2周為1個療程，≥3療程。患者于化療前后行腹部及盆腔CT或MR檢查，根據RECIST實體瘤評判標準對腫瘤化療反應進行評估。于化療結束后4～6周進行手術切除腫瘤。
1.2.2 未化療組
納入該組的患者經相關檢查無明顯手術禁忌證后行標準結直腸癌根治術。
所有納入研究患者的手術切除標本離體后均迅速放入10%甲醛固定液中保存，并及時送筆者所在醫院病理科行石蠟包埋保存，以盡量降低其RNA的降解。
1.3 方法
1.3.1 主要試劑與儀器
病理組織蠟塊中總RNA提取試劑盒（miRNeasy FFPE Kit）購自德國QIAG-ENE公司；逆轉錄試劑盒（miScript Reverse Transc-ription Kit）及熒光定量PCR試劑盒（miScript SYBR Green PCR Kit）均購自日本TAKARA公司；miR-196、 HoxB8及內參照U6引物委托商業公司（上海生工）合成（表 2）；HoxB8抗體（goat polyclonal IgG）購自美國santa cruz公司（產品代號：sc-82879），工作濃度為1︰200；SABC試劑盒（包含有二抗：SA1023-山羊IgG）購買自武漢博士德生物公司；酶標儀（DU-600型分光度計）為Beckman公司產品，real-time PCR儀ABI 7500 Fast為美國Ambion公司產品。
表2
real-time PCR的引物序列
Table2.
Primer sequence of real-time PCR
1.3.2 石蠟包埋組織的總RNA提取切取10 μm
厚石蠟組織塊2片，放入經焦碳酸二乙酯（DEPC）水及高壓處理后的1.5 mL EP管中，加1 mL二甲苯常規脫蠟2次，盡可能清除石蠟，經100%乙醇洗滌2次后離心（14 000 r/min，r=8 cm，2 min），除去乙醇，室溫晾干15 min使剩余乙醇完全揮發。參照德國QIAGENE公司miRNeasy FFPE Kit試劑盒說明書中的方法，提取蠟塊組織中的總RNA（包括mRNA和microRNA），將所提取的總RNA溶于15～20 μL的去核糖核酸酶（Rnase-free）水中，用酶標儀測定所提取的總RNA溶液濃度以及波長260 nm和280 nm處的吸光度值（A值），選取總RNA濃度大于100 ng/μL及A260 /A280比值介于1.8～2.1之間者用于后續實驗。
1.3.3 miR-196和HoxB8的逆轉錄反應
參照日本TAKARA公司逆轉錄試劑盒產品說明書配制逆轉錄反應混合液（2×miRNA逆轉錄緩沖液10 μL；0.1%BSA 2 μL；miRNA逆轉錄酶混合液2 μL；RNA定量至0.5 μg，加Rnase-free水至總反應液量達20 μL），反應條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，得到的cDNA于-20 ℃保存。
1.3.4 SYBR Green熒光定量PCR
參照日本TAK-ARA公司的熒光定量PCR試劑盒說明書分別配制miR-196和HoxB8的反應混合液（SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL；F-Primer 0.8 μL；R-Primer 0.8 μL；校正染料（ROX Reference Dye Ⅱ）0.4 μL；RNase-free水6 μL；cDNA 2 μL），反應條件參照說明書如下：預變性95 ℃ 30 s；PCR反應：95 ℃，3 s；60 ℃，30 s，共40個循環，均以U6為內參照，重復3個復孔，取所得Ct均值；采用2-ΔΔct法分析。
1.3.5 HoxB8蛋白表達檢測
采用免疫組化SABC法檢測化療敏感組及不敏感組中HoxB8蛋白的表達情況。參照說明書進行實驗，以PBS代替一抗作陰性對照，陽性對照圖片由試劑公司提供。結果判定標準：按每張切片中的陽性細胞的百分比和著色深淺計分，行半定量分析[5-6]。在高倍鏡視野下（400倍）隨機選取5個視野（上中下及左右），根據其著色強度評分：0分為無著色；1分為淡黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色；并根據陽性細胞百分比評分：陽性細胞所占百分比＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。分別計算其均值，最后將兩項評分的乘積作為總評分，總分為0分判為陰性（?），1～3分判為弱陽性（＋），4～7分判為陽性（＋＋），8～12分判為強陽性（＋＋＋）。以上結果判斷均在雙盲法下進行。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件包進行數據分析。計量資料數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 新輔助化療組與未化療組中miR-196和HoxB8 mRNA表達檢測結果
新輔助化療組中miR-196和HoxB8 mRNA的相對表達量分別為0.646 8±0.683 9和0.607 6±0.418 9，其表達水平均低于未化療組的1.000 0±0.000 0和1.000 0±0.000 0（均P＜0.01）。
2.2 化療敏感組與不敏感組中miR-196和HoxB8 mRNA表達檢測結果
2.2.1 PCR結果
miR-196在化療敏感組與不敏感組中的表達相對量分別為0.948 9±0.691 0和0.344 7±0.536 1，化療敏感組的miR-196表達水平明顯高于不敏感組，Mann-Whitney檢驗提示2組間的差異有統計學意義（Z=-3.172，P＜0.01）。HoxB8 mRNA在化療敏感組與不敏感組中的表達相對量分別為0.489 9±0.371 5和0.725 3±0.437 5，化療敏感組的HoxB8 mRNA表達水平低于不敏感組，Mann-Whitney檢驗提示2組間的差異有統計學意義（Z=-2.222，P＜0.05）。
2.2.2 免疫組化染色結果
結果見圖 1和表 3。由圖 1和表 3可見，HoxB8蛋白在結直腸癌組織中主要表達于細胞質；在化療敏感組其HoxB8蛋白表達陽性率低于不敏感組，經Mann-Whitney檢驗其差異有統計學意義（Z=-2.396，P=0.017）。
圖1
示HoxB8蛋白在結直腸癌組織中的表達（SABC ×400）。1A：敏感組；1B：不敏感組
Figure1.
Expression of HoxB8 protein in colorectal carcinoma tissues (SABC ×400). 1A:Sensitive group; 1B:Insensitive group
表3
化療敏感組與不敏感組HoxB8蛋白表達檢測結果〔例（%）〕
Table3.
Results of HoxB8 protein expression between the sensitive group and insensitive group for chemotherapy〔case(%)〕
2.3 miR-196和HoxB8 mRNA表達的相關性分析結果
在未化療組的30例患者中，miR-196和HoxB8 mRNA表達存在負相關關系，其Spearman相關系數r=-0.435，P=0.016。在新輔助化療組的50例患者中，miR-196和HoxB8 mRNA表達也存在負相關關系，其Spearman相關系數r=-0.595，P＜0.01。
3 討論
微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種由內源基因編碼的小分子單鏈非編碼RNA，長約21～25個核苷酸，可以通過形成RNA誘導沉默復合體（RISC）與靶基因完全或不完全互補結合[7-9]，誘導靶mRNA的裂解或抑制蛋白翻譯來調控靶基因的表達[10-11]，也可以作為癌基因或抑癌基因參與惡性腫瘤的發生與演進[12-13]。miR-196是位于Hox基因家族上游的一類微小RNA，對Hox基因家族中多數成員的表達情況具有負向調控作用，且以對HoxB8的調控作用最為多見[3, 14-18]。研究發現miR-196在多種惡性腫瘤中表達升高：Bloomston等[19]發現，在胰腺癌患者組織中miR-196表達量較正常胰腺組織升高，且高表達miR-196時提示患者的預后差、生存期縮短；Liao等[20]利用qRT-PCR方法檢測63例胃癌患者的胃癌組織和癌旁組織中的miR-196表達，發現miR-196在胃癌組織中呈高表達，這一結果在Tsai等[21]的研究中也獲得了認可；Schimanski等[3]在對結腸癌和正常結腸黏膜進行定量PCR測定后發現，在結腸癌組織中，miR-196的表達水平亦有上調，而在相應的正常結腸黏膜中表達較低。在筆者研究小組的前期研究[22]發現，在30例術前未接受化療的結直腸癌患者切除的新鮮癌組織標本中miR-196的表達水平亦較正常黏膜中的表達水平升高（P＜0.05），與上述文獻報道結果相符。有研究還發現，一些化療藥物如5-FU或奧沙利鉑等可以改變大腸癌細胞中miRNAs分子表達水平，提示miRNA可能作為化療藥物作用的新型靶點，為新型抗癌藥物的開發提供新的策略和思路：Meng等[23]發現，在化療藥物的干預下，miRNA的表達譜會發生變化，進而提出將miRNA作為化療藥物療效的預測指標；Schimanski等[3]的研究也進一步指出，高濃度的miR-196可以使結直腸癌細胞對于鉑類藥物的化療敏感性升高。本研究結果提示：結直腸癌患者miR-196的表達水平在接受Folfox4方案化療后下降，且對化療的不同反應程度其表達水平有差異，敏感組中miR-196的表達水平較不敏感組為高，提示高表達的miR-196可以使患者對于Folfox4方案的化療敏感性提高，這在一定程度上與Schimanski等[3]的研究結果相吻合。
HoxB8是同源盒基因家族成員之一，位于人類第17號染色體，是一個序列特異性轉錄因子，其編碼的產物為DNA結合蛋白，在細胞的分化、發育和器官形成中發揮重要作用[24-25]。且有研究[26]表明，其在結直腸癌組織中相較正常黏膜呈高水平表達。筆者研究小組在前期細胞實驗中發現（待發表）：HoxB8的差異表達與Folfox4方案化療敏感性相關，且通過RNAi抑制HoxB8基因表達，能夠顯著提高結直腸癌細胞對化療藥物的敏感性。由此筆者進一步對接受Folfox4方案化療患者結直腸癌組織標本中HoxB8蛋白表達情況進行檢測，結果發現，結直腸癌患者在接受Folfox4方案化療干預后，HoxB8蛋白的表達陽性率降低，且對化療的不同敏感度其表達陽性率也有差異，敏感組中HoxB8的表達陽性率低于不敏感組，這進一步表明了HoxB8的高表達可以降低Folfox4化療的敏感性，與前期實驗結果相吻合。
同時，本研究對miR-196和HoxB8表達水平的相關性進行了分析，發現無論是在直接手術組還是新輔助化療組，miR-196和HoxB8的表達都存在負相關關系，進一步驗證了兩者之間具有調控關系，且在化療藥物干預后此調控作用依然存在。結合兩者在化療敏感組與不敏感組中的表達差異，筆者提出可以將miR-196和HoxB8在結直腸癌患者中的表達情況作為預測患者是否對Folfox4化療方案敏感的指標，來預測化療的反應性與毒性，通過檢測這兩個因子的表達水平來篩選能夠從Folfox4化療方案中獲益的患者，開展個體化治療；并且miR-196和HoxB8有望成為化療藥物作用的新型靶點，在藥物研制上可以通過直接抑制HoxB8的表達來提高化療藥物的敏感性，或是對其上游的調控基因miR-196進行干預，間接改變HoxB8的表達來提高患者的化療敏感性，為新型抗癌藥物的研發提供新的策略和思路。由于本實驗納入的病例數有限，相關結果有待進一步的大宗病例的研究予以證實。
