活體顯微鏡成像技術的應用開發使研究者得以在細胞水平上實時、原位地觀察肺內微循環，對于肺部疾病免疫微環境的研究發揮了重要作用。本文簡要介紹了小鼠肺部成像視窗構建技術的研究進展，歸納了目前用于肺活體研究的光學顯微鏡技術的功能及應用特點，包括寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及雙光子掃描顯微鏡，及其在小鼠肺部炎癥及感染模型中的應用，同時指出該技術目前的局限性，為研究者系統性學習和了解該技術提供參考。
引用本文： 程雨飛, 張龍浩. 肺部活體顯微成像技術的研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(8): 1204-1209. doi: 10.7507/1007-4848.202306065 復制
活體顯微成像是指在盡量不影響生物體正常生理狀態的條件下，通過顯微鏡等高分辨率的成像設備實時觀察和記錄生物體內部的生理過程與分子相互作用。隨著光學顯微成像技術的發展，越來越多的研究開始通過活體顯微成像實時、原位地觀察特定組織中不同細胞的形態、運動及相互作用等。由此獲得的信息因為很大程度規避了常規體外實驗中的各種干擾因素，更能代表生理狀態下的真實情況。在各類器官中，肺部的多種疾病具有高發病率以及死亡率，相關的研究一直非常活躍，其中活體顯微成像技術對觀察和研究肺部疾病的免疫微環境發揮了很大作用。本文將對該領域的方法學現狀及進展進行介紹，為肺部疾病基礎研究提供參考。本文所涵蓋的適用于肺部免疫學研究的活體顯微成像技術一方面需要動物在成像實驗中維持存活狀態，呼吸系統的器官需要盡量保持其完整性而不可單獨分離出來；其次，成像實驗要能夠對肺的同一區域進行一定時間的動態觀察并且達到細胞水平的分辨率。由于信號質量會隨成像深度的增加而衰減，目前的顯微鏡技術難以直接對密閉于胸腔內的肺組織進行細胞級分辨率的成像，所有實驗均需通過開胸手術暴露肺部以構建成像視窗。
1 肺部活體顯微成像視窗的構建技術
活體顯微成像的實驗流程大致分為：動物處理、顯微鏡操作及圖像處理。顯微鏡的使用相對簡單，用戶經短時間培訓一般可獨立操作，實驗動物的處理則涉及熒光標記細胞以及構建成像視窗。各類熒光染料均可在顯微鏡觀測前的一定時間內經由靜脈注射（如尾靜脈穿刺置管）等方式進行肺組織的熒光標記，信號穩定性強且靈敏度高，例如，Rhodamine 6G可用于標記白細胞。熒光蛋白亦可用于識別相應類型細胞，例如，對于用于觀測中性粒細胞的LysM-GFP小鼠，其Lyz2基因編碼的lysozyme M主要在中性粒細胞中表達[1-2]。除此之外，免疫細胞具有可被熒光抗體識別的相應抗原，例如，Ly6G是一類在小鼠中性粒細胞內高度表達的細胞表面蛋白[3]，Ly6C和F4/80則在巨噬細胞或單核白血球內高度表達[4]。對于肺部觀察，成像視窗的構建是實驗的重難點。為保障實驗順利進行，小鼠需要進行全身麻醉，目前較通用的方式是通過異氟烷氣體進行吸入式麻醉，該方法可對麻醉深度進行精細調控[5-6]。待麻醉后，將其仰臥固定于穩定裝置上，手術暴露氣管，經插管或氣管切開術處理并通過呼吸機進行機械通氣。在胸廓處手術切開一道窗口并剪除相應的肋骨以暴露肺葉，并對肺組織進行機械固定以及顯微鏡成像。實驗結束后，小鼠在清醒之前均會依據相應的規范被處以安樂死[7-8]。
肺部活體顯微成像因其涉及侵入性操作而難以用于臨床試驗[7]，但該技術可用于多種不同類型的實驗動物[9]。其中小鼠因為具有易于繁殖[10]、低實驗成本以及易于經由相應實驗方法靈活有效地創建各類疾病模型等特質[11]，是普遍使用的實驗動物模型[12]，在各類器官的疾病研究中發揮了很大作用。盡管如此，其肺部成像尚面臨諸多難點。由于成像視窗構建是創傷性的非存活手術[7]，長時間觀測需要依賴多組小鼠。小鼠本身的小尺寸亦限制了其支撐設備的尺寸和操作空間，導致插管以及氣管切開術等操作難度增大[7]，同時對肺進行機械固定也因其小體積以及相較于大型動物更高的呼吸頻率而難度增大[13]。活體顯微成像需要在盡可能維護組織完整和功能正常的同時優化圖像質量，這對于肺而言挑戰尤其大[14]。一方面，肺組織因其質地疏松脆弱從而極易受損，同時肺內微循環復雜且豐富而且極易誘發免疫反應，任何對肺的氣-液界面的擾動都容易產生較大的影響。其次，在成像中肺部自主呼吸和心臟搏動對觀察區的穩定影響非常大，會導致成像難以“對焦”以及不同時間點視野的偏移，需要通過合適的固定方式盡量控制抖動對成像的影響。
1.1 支氣管夾閉法
在經麻醉、通氣和開胸處理后，可通過夾閉一側肺葉的支氣管的方式以消除呼吸產生的擾動，而對側肺葉則提供動物存活所需的氧氣，被夾閉的肺葉在被輕取出胸腔后可進行穩定的成像。這種方法曾被用于兔、貓、狗等大型動物的肺部成像[15-17]，在早期的研究中該方法改進了肺內各種血管的血液流動的模型，包括腎上腺素的存在所產生的影響[16-17]。該方法亦被用于小鼠哮喘模型的右肺葉成像[18]，即通過夾閉右肺葉支氣管的同時向對側肺葉按正常呼吸頻率執行機械通氣以維持活體狀態。這類固定方式手術處理簡便，能較好地穩定觀察區，但夾閉支氣管會導致肺葉陷入低氧，從而僅能進行短時間的有效成像。
1.2 肺呼氣末延長法
在正常的呼吸過程中存在一個約300 ms的呼氣末的肺內部壓力恒定的停滯期，該時段可經由機械呼吸機誘導的呼吸暫停及神經肌肉阻滯延長至15 s，研究者進而可按呼吸周期在相應的時段進行分期成像[8]。該方法已被用于表征肺部微循環[19]、肺內皮細胞對急性肺損傷的反應[20]，以及研究肺泡巨噬細胞的吞噬活性[21]。但這種方法的成像視野穩定性總體而言偏差并且受限于成像時長，不適用于對免疫動態的長時間觀察。
1.3 粘合劑固定法
在粘合劑固定法中，獸用粘合劑被用于將肺實質的最上表面粘合固定于蓋玻片，這樣可以提供長時間且穩定的高分辨活體成像，但不足之處是該粘合處理會引發相當程度的炎癥反應。Entenberg等[22] 采用此方式構建了一種低創性的讓小鼠在每次手術后存活及麻醉后恢復的植入式窗口，可在無需機械通氣的條件下對肺同一區域進行數周的連續成像。
1.4 負壓胸吸窗
在負壓胸吸窗法中，真空抽氣系統等裝置被用于將肺實質的一小部分區域通過真空負壓吸附于蓋玻片之下。Rodriguez-Tirado等[23] 將負壓胸吸窗小型化使之更適用于小鼠實驗。該方法在實現穩定而長時間的活體成像的同時有效減輕了早期炎癥反應，目前已成為肺顯微活體成像的金標準，被廣泛用于對肺免疫系統的觀察。
2 光學顯微鏡技術
2.1 寬場熒光顯微鏡
在早期，研究者在活體上可通過明場透射顯微鏡觀察肺組織，隨著熒光顯微鏡技術的發展成熟，肺活體成像實現了多通道特異性，在圖像對比度和實驗靈活性等方面得到了很大改善，逐漸成為在體研究肺內微循環的方法學金標準。2008年，Tabuchi等[24] 建立小鼠模型并通過寬場熒光顯微活體成像首次獲得了肺部微循環的視頻影像。
寬場熒光顯微技術是最早在活體成像中用于研究肺部炎癥及感染的成像技術[7]。其光源一般為高壓汞燈或發光二極管，發出的光通過激發濾光片過濾成特定波段的激發光，再由分光鏡反射至物鏡后聚焦于標本上，標本受其激發后會產生波長更長的熒光信號。其中一部分信號和未被吸收的激發光經原來入射路徑反向通過物鏡并復經分光鏡，分光鏡將大部分剩余的激發光等較短波長光反射至光源方向，其余透過的光則通過發射濾光片進一步過濾成特定波段的發射光，最終到達檢測相機并成像。
寬場熒光顯微鏡的縱向分辨率有限，其成像難以分辨樣品產生熒光的深度信息，在對超過一定厚度的樣品成像時來自不同縱深的信號會投射并干擾焦平面上的細節從而極大降低了對比度，因此對肺的成像會受限于淺表層的觀察以及低分辨率。近10多年以來，隨著共聚焦、雙光子顯微鏡應用的開發，肺活體成像的深度和圖像質量有顯著提升[25]。
2.2 激光共聚焦顯微鏡
激光共聚焦顯微鏡改變了傳統寬場光學顯微鏡的場光源和全視野照明模式，采用激光器發出的特定波長的激光束作為光源，相比普通光源單色性、方向性、偏振性好，強度大[26]，在通過照明針孔形成點光源后由分光鏡反射至物鏡并匯集于樣本中的一處焦點，對樣本焦平面每一點逐次進行掃描，這樣可有效增加穿透深度并減少干擾信號。同時光電倍增管探測器的前方設置了在掃描過程中與物鏡焦平面共軛的探測針孔濾光，用以消除焦平面以外的雜散光信號，這樣在一定深度的3D標本中便可大大提升成像的信噪比和清晰度，顯著提升了橫向尤其是縱向分辨率，提供了關于深度的信息，擁有對樣本的特定焦平面進行精細成像（如光學層切）的能力。近年來，共聚焦活體成像以其高分辨率等應用優勢在小鼠肺部炎癥及感染模型的研究中持續發揮重要作用[27-30]。
常規激光掃描共聚焦顯微鏡的成像模式是如上所述的通過單一針孔的逐點式掃描以拼制出完整圖像，轉盤式激光共聚焦顯微鏡則是通過其掃描轉盤上的多個針孔以同樣的基于共軛聚焦原理的方式來排除非焦平面的雜光信息，在轉盤高速旋轉下，顯微鏡的光在單位時間內會通過無數個針孔，以“激光擴速”的形式照到整個視場并成像。在犧牲一定分辨率的情況下，這種多點同步掃描的方式可大幅提升掃描速度，同時借助較微弱的激發光照射即可實現高靈敏度的成像效果并降低對活體的光損傷。對于肺的持續運動，其高速動態成像能力對于有效降低偽影尤為關鍵。
2.3 雙光子掃描顯微鏡
目前針對肺的活體研究主要采用雙光子顯微鏡[25, 31-36]，其最大優勢是組織穿透深度優于共聚焦技術。雙光子顯微鏡采用與激光掃描共聚焦顯微鏡同樣的點掃描成像模式，但在此基礎上采用近紅外飛秒激光作為光源，與常規短波長激發光相比，在大部分生物組織中受散射影響小且不易被吸收，穿透性更強且光損傷更輕，因而更適用于活體樣品的深層成像以及長時間觀察。在焦點處，熒光分子可同時吸收兩個入射的近紅外光子而躍遷至激發態并輻射出一個短波長的熒光光子，其效果與使用一個波長為入射光約一半的光子去激發熒光分子相同。這種雙光子激發要求兩個入射光子幾乎在同一時間（～10?15 s）內照到熒光分子，需要較高的光子密度才能產生，為不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器，脈沖頻率可達100 MHz但僅用約10?13 s的脈沖寬度進行有效的高功率激發，在提供高峰值能量的同時維持了低平均能量。此外，雙光子激發的一大獨特性是其激發效率與激發光強度的平方呈正相關，在這種非線性激發模式下，僅有光子密度最高的物鏡焦點處才會產生有效的雙光子激發及熒光信號。由于除此之外近紅外激發光在樣本的入射路徑中基本上難以用于激發熒光分子而被吸收，因此其穿透效率及深度很大程度得以提升，并減輕了樣本的光漂白以及光毒性。
雙光子顯微鏡在相同物鏡倍數等條件下分辨率不及共聚焦顯微鏡，同時成像速度不高。對于同一熒光分子，二者的發射光譜雖一樣，但雙光子的激發光譜比單光子（共聚焦）在橫軸波長方向的兩倍更廣闊，使其在多色成像時很容易同時激發多個通道，造成串色。因此雙光子樣本通常只做單色或雙色標記，在活體上能觀測到的免疫細胞等對象的通道組合有限，相當程度上限制了很多研究方案的實施。總體而言，共聚焦技術仍具備靈活性和低成本等固有優勢，是各大實驗開展活體研究的主要應用手段之一。為肺部疾病在活體狀態下的研究構建基于共聚焦技術的方法學基礎仍在開展并受到重視[25]，同時該領域的熱點研究也在持續產出[37-38]。
3 肺部炎癥及感染模型
3.1 細菌性肺炎
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）是一種呼吸道感染致病菌，可引發急性化膿性肺炎，其耐甲氧西林的菌株（methicillin-resistant S. aureus，MRSA）臨床上常見且毒性較強，被廣泛用于動物感染模型[39]。Lefrancais等[40] 通過MRSA肺炎小鼠模型研究了中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）在肺損傷中的作用。該實驗將小鼠的左肺手術暴露后通過負壓胸吸窗進行固定，在氣管中注入MRSA臨床菌株以建立急性肺損傷模型，并采用雙光子顯微鏡以0.4 mm2的視野面積和40 μm的深度進行每分鐘1次的總計120 min的成像以觀測肺微循環中NETs的變化，成像數據顯示肺在被感染后迅即促發了中性粒細胞的募集以及NETs在肺血管和肺泡腔中的分泌，其圖像首次展示了NETs在肺中的動態產生過程[40]。
3.2 病毒性感染
活體顯微成像技術亦被用于研究病毒性感染。Neupane等[41] 建立了一套用于有效觀測肺泡巨噬細胞的活體成像方法，展示了肺泡巨噬細胞移動于各個肺泡間以對呼吸系統進行免疫監視并且對吸入的細菌進行吞噬以避免促發肺炎的過程，其中甲型流感病毒的介入妨礙了其巡邏和吞噬功能并增加了中性粒細胞浸潤。此外，Naumenko等[42] 開發了一套實時觀測溶瘤水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）與宿主細胞之間相互作用的活體成像方法，可涵蓋癌癥小鼠模型的整個治療過程，具備可視化活小鼠血液、腫瘤以及內臟中單個細胞及VSV 的高靈敏度及空間分辨率。對于肺部，其采用與上述觀測肺泡巨噬細胞相似的顯微成像系統和手術處理并通過相應的標記手段觀測到了VSV與白細胞的相互作用。
3.3 囊性纖維化
囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是一種由囊性纖維化跨膜轉導調節因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）的基因突變所引發的遺傳性疾病，可導致長期肺部感染。在這方面，Brown等[43] 探索了CFTR對肺微血管內皮細胞屏障功能的影響。在靜脈注入可溶性香煙煙霧提取物后，活體雙光子顯微成像顯示相較于野生型小鼠，同窩CFTR缺失的轉基因小鼠展現了肺泡毛細血管屏障功能障礙顯著增加的跡象，包括血漿外滲以及炎癥細胞與內皮粘附的增多。結合體外實驗結果，其研究表明CFTR對肺內皮細胞屏障功能具有維持作用，CFTR功能的缺失尤其是在伴隨香煙煙霧暴露的條件下可導致內皮細胞通透性增加進而促進肺炎。
3.4 膿毒癥急性肺損傷
膿毒癥（sepsis）是由細菌等病原微生物感染引發的全身炎癥反應綜合征，在嚴重的情況下可導致急性肺損傷。膿毒癥急性肺損傷作為重癥監護病房的常見病，是危重癥疾病研究的重點[44]。例如，Yipp等[45] 的研究驗證了膿毒癥過程中Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）以及分化抗原簇分子11B（cluster of differentiation molecule 11B，CD11b）是肺毛細血管中性粒細胞進行宿主防御所必需的。在靜脈注射脂多糖后，肺活體共聚焦顯微成像顯示，相較于正常組，TLR4–、MyD88–以及CD11b–敲除小鼠的肺毛細血管中性粒細胞的貼壁、爬行等行為顯著減弱。
4 肺部活體顯微成像技術的局限性
肺部活體顯微成像視窗的直徑大小通常為10 mm左右[7,46]，僅能觀察到肺前部分有限的表淺部位。肺表面由毛細血管網及彈性纖維所包繞的一系列肺泡所構成，結構復雜并且豐富的氣-液界面會導致大量的光散射，在削弱分辨率的同時加速入射光的衰減進而降低成像深度，將其局限于一兩百微米以內[5]。這部分是研究肺轉移瘤、肺損傷等疾病以及肺內穩態的重要區域，然而很多疾病，例如哮喘、肺部細菌性感染、肺部病毒性感染乃至原發性肺癌會作用于較大的呼吸道及血管等內部區域[5]，只有提升成像深度才能完整地在活體原位的基礎上揭示其免疫學特征及發病機制。
5 總結
肺部活體顯微成像技術發展至今取得了長足進步，其成像視野的窗口構建主要采用基于粘合劑固定法或負壓胸吸窗的機械固定方式，并在朝著小型化、低創傷性、高穩定性及長時程成像等方向優化，同時隨著共聚焦、雙光子這類具備光學層切能力的顯微鏡的開發，其成像深度和質量有了顯著提升。該技術的固有缺陷是成像視野的穩定性會不可避免地受制于肺部的生理運動，同時其成像范圍尚局限于肺部淺表層。
利益沖突：無。
作者貢獻：程雨飛提出研究設計，收集資料，撰寫初稿，修改論文；張龍浩修改論文。
活體顯微成像是指在盡量不影響生物體正常生理狀態的條件下，通過顯微鏡等高分辨率的成像設備實時觀察和記錄生物體內部的生理過程與分子相互作用。隨著光學顯微成像技術的發展，越來越多的研究開始通過活體顯微成像實時、原位地觀察特定組織中不同細胞的形態、運動及相互作用等。由此獲得的信息因為很大程度規避了常規體外實驗中的各種干擾因素，更能代表生理狀態下的真實情況。在各類器官中，肺部的多種疾病具有高發病率以及死亡率，相關的研究一直非常活躍，其中活體顯微成像技術對觀察和研究肺部疾病的免疫微環境發揮了很大作用。本文將對該領域的方法學現狀及進展進行介紹，為肺部疾病基礎研究提供參考。本文所涵蓋的適用于肺部免疫學研究的活體顯微成像技術一方面需要動物在成像實驗中維持存活狀態，呼吸系統的器官需要盡量保持其完整性而不可單獨分離出來；其次，成像實驗要能夠對肺的同一區域進行一定時間的動態觀察并且達到細胞水平的分辨率。由于信號質量會隨成像深度的增加而衰減，目前的顯微鏡技術難以直接對密閉于胸腔內的肺組織進行細胞級分辨率的成像，所有實驗均需通過開胸手術暴露肺部以構建成像視窗。
1 肺部活體顯微成像視窗的構建技術
活體顯微成像的實驗流程大致分為：動物處理、顯微鏡操作及圖像處理。顯微鏡的使用相對簡單，用戶經短時間培訓一般可獨立操作，實驗動物的處理則涉及熒光標記細胞以及構建成像視窗。各類熒光染料均可在顯微鏡觀測前的一定時間內經由靜脈注射（如尾靜脈穿刺置管）等方式進行肺組織的熒光標記，信號穩定性強且靈敏度高，例如，Rhodamine 6G可用于標記白細胞。熒光蛋白亦可用于識別相應類型細胞，例如，對于用于觀測中性粒細胞的LysM-GFP小鼠，其Lyz2基因編碼的lysozyme M主要在中性粒細胞中表達[1-2]。除此之外，免疫細胞具有可被熒光抗體識別的相應抗原，例如，Ly6G是一類在小鼠中性粒細胞內高度表達的細胞表面蛋白[3]，Ly6C和F4/80則在巨噬細胞或單核白血球內高度表達[4]。對于肺部觀察，成像視窗的構建是實驗的重難點。為保障實驗順利進行，小鼠需要進行全身麻醉，目前較通用的方式是通過異氟烷氣體進行吸入式麻醉，該方法可對麻醉深度進行精細調控[5-6]。待麻醉后，將其仰臥固定于穩定裝置上，手術暴露氣管，經插管或氣管切開術處理并通過呼吸機進行機械通氣。在胸廓處手術切開一道窗口并剪除相應的肋骨以暴露肺葉，并對肺組織進行機械固定以及顯微鏡成像。實驗結束后，小鼠在清醒之前均會依據相應的規范被處以安樂死[7-8]。
肺部活體顯微成像因其涉及侵入性操作而難以用于臨床試驗[7]，但該技術可用于多種不同類型的實驗動物[9]。其中小鼠因為具有易于繁殖[10]、低實驗成本以及易于經由相應實驗方法靈活有效地創建各類疾病模型等特質[11]，是普遍使用的實驗動物模型[12]，在各類器官的疾病研究中發揮了很大作用。盡管如此，其肺部成像尚面臨諸多難點。由于成像視窗構建是創傷性的非存活手術[7]，長時間觀測需要依賴多組小鼠。小鼠本身的小尺寸亦限制了其支撐設備的尺寸和操作空間，導致插管以及氣管切開術等操作難度增大[7]，同時對肺進行機械固定也因其小體積以及相較于大型動物更高的呼吸頻率而難度增大[13]。活體顯微成像需要在盡可能維護組織完整和功能正常的同時優化圖像質量，這對于肺而言挑戰尤其大[14]。一方面，肺組織因其質地疏松脆弱從而極易受損，同時肺內微循環復雜且豐富而且極易誘發免疫反應，任何對肺的氣-液界面的擾動都容易產生較大的影響。其次，在成像中肺部自主呼吸和心臟搏動對觀察區的穩定影響非常大，會導致成像難以“對焦”以及不同時間點視野的偏移，需要通過合適的固定方式盡量控制抖動對成像的影響。
1.1 支氣管夾閉法
在經麻醉、通氣和開胸處理后，可通過夾閉一側肺葉的支氣管的方式以消除呼吸產生的擾動，而對側肺葉則提供動物存活所需的氧氣，被夾閉的肺葉在被輕取出胸腔后可進行穩定的成像。這種方法曾被用于兔、貓、狗等大型動物的肺部成像[15-17]，在早期的研究中該方法改進了肺內各種血管的血液流動的模型，包括腎上腺素的存在所產生的影響[16-17]。該方法亦被用于小鼠哮喘模型的右肺葉成像[18]，即通過夾閉右肺葉支氣管的同時向對側肺葉按正常呼吸頻率執行機械通氣以維持活體狀態。這類固定方式手術處理簡便，能較好地穩定觀察區，但夾閉支氣管會導致肺葉陷入低氧，從而僅能進行短時間的有效成像。
1.2 肺呼氣末延長法
在正常的呼吸過程中存在一個約300 ms的呼氣末的肺內部壓力恒定的停滯期，該時段可經由機械呼吸機誘導的呼吸暫停及神經肌肉阻滯延長至15 s，研究者進而可按呼吸周期在相應的時段進行分期成像[8]。該方法已被用于表征肺部微循環[19]、肺內皮細胞對急性肺損傷的反應[20]，以及研究肺泡巨噬細胞的吞噬活性[21]。但這種方法的成像視野穩定性總體而言偏差并且受限于成像時長，不適用于對免疫動態的長時間觀察。
1.3 粘合劑固定法
在粘合劑固定法中，獸用粘合劑被用于將肺實質的最上表面粘合固定于蓋玻片，這樣可以提供長時間且穩定的高分辨活體成像，但不足之處是該粘合處理會引發相當程度的炎癥反應。Entenberg等[22] 采用此方式構建了一種低創性的讓小鼠在每次手術后存活及麻醉后恢復的植入式窗口，可在無需機械通氣的條件下對肺同一區域進行數周的連續成像。
1.4 負壓胸吸窗
在負壓胸吸窗法中，真空抽氣系統等裝置被用于將肺實質的一小部分區域通過真空負壓吸附于蓋玻片之下。Rodriguez-Tirado等[23] 將負壓胸吸窗小型化使之更適用于小鼠實驗。該方法在實現穩定而長時間的活體成像的同時有效減輕了早期炎癥反應，目前已成為肺顯微活體成像的金標準，被廣泛用于對肺免疫系統的觀察。
2 光學顯微鏡技術
2.1 寬場熒光顯微鏡
在早期，研究者在活體上可通過明場透射顯微鏡觀察肺組織，隨著熒光顯微鏡技術的發展成熟，肺活體成像實現了多通道特異性，在圖像對比度和實驗靈活性等方面得到了很大改善，逐漸成為在體研究肺內微循環的方法學金標準。2008年，Tabuchi等[24] 建立小鼠模型并通過寬場熒光顯微活體成像首次獲得了肺部微循環的視頻影像。
寬場熒光顯微技術是最早在活體成像中用于研究肺部炎癥及感染的成像技術[7]。其光源一般為高壓汞燈或發光二極管，發出的光通過激發濾光片過濾成特定波段的激發光，再由分光鏡反射至物鏡后聚焦于標本上，標本受其激發后會產生波長更長的熒光信號。其中一部分信號和未被吸收的激發光經原來入射路徑反向通過物鏡并復經分光鏡，分光鏡將大部分剩余的激發光等較短波長光反射至光源方向，其余透過的光則通過發射濾光片進一步過濾成特定波段的發射光，最終到達檢測相機并成像。
寬場熒光顯微鏡的縱向分辨率有限，其成像難以分辨樣品產生熒光的深度信息，在對超過一定厚度的樣品成像時來自不同縱深的信號會投射并干擾焦平面上的細節從而極大降低了對比度，因此對肺的成像會受限于淺表層的觀察以及低分辨率。近10多年以來，隨著共聚焦、雙光子顯微鏡應用的開發，肺活體成像的深度和圖像質量有顯著提升[25]。
2.2 激光共聚焦顯微鏡
激光共聚焦顯微鏡改變了傳統寬場光學顯微鏡的場光源和全視野照明模式，采用激光器發出的特定波長的激光束作為光源，相比普通光源單色性、方向性、偏振性好，強度大[26]，在通過照明針孔形成點光源后由分光鏡反射至物鏡并匯集于樣本中的一處焦點，對樣本焦平面每一點逐次進行掃描，這樣可有效增加穿透深度并減少干擾信號。同時光電倍增管探測器的前方設置了在掃描過程中與物鏡焦平面共軛的探測針孔濾光，用以消除焦平面以外的雜散光信號，這樣在一定深度的3D標本中便可大大提升成像的信噪比和清晰度，顯著提升了橫向尤其是縱向分辨率，提供了關于深度的信息，擁有對樣本的特定焦平面進行精細成像（如光學層切）的能力。近年來，共聚焦活體成像以其高分辨率等應用優勢在小鼠肺部炎癥及感染模型的研究中持續發揮重要作用[27-30]。
常規激光掃描共聚焦顯微鏡的成像模式是如上所述的通過單一針孔的逐點式掃描以拼制出完整圖像，轉盤式激光共聚焦顯微鏡則是通過其掃描轉盤上的多個針孔以同樣的基于共軛聚焦原理的方式來排除非焦平面的雜光信息，在轉盤高速旋轉下，顯微鏡的光在單位時間內會通過無數個針孔，以“激光擴速”的形式照到整個視場并成像。在犧牲一定分辨率的情況下，這種多點同步掃描的方式可大幅提升掃描速度，同時借助較微弱的激發光照射即可實現高靈敏度的成像效果并降低對活體的光損傷。對于肺的持續運動，其高速動態成像能力對于有效降低偽影尤為關鍵。
2.3 雙光子掃描顯微鏡
目前針對肺的活體研究主要采用雙光子顯微鏡[25, 31-36]，其最大優勢是組織穿透深度優于共聚焦技術。雙光子顯微鏡采用與激光掃描共聚焦顯微鏡同樣的點掃描成像模式，但在此基礎上采用近紅外飛秒激光作為光源，與常規短波長激發光相比，在大部分生物組織中受散射影響小且不易被吸收，穿透性更強且光損傷更輕，因而更適用于活體樣品的深層成像以及長時間觀察。在焦點處，熒光分子可同時吸收兩個入射的近紅外光子而躍遷至激發態并輻射出一個短波長的熒光光子，其效果與使用一個波長為入射光約一半的光子去激發熒光分子相同。這種雙光子激發要求兩個入射光子幾乎在同一時間（～10?15 s）內照到熒光分子，需要較高的光子密度才能產生，為不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器，脈沖頻率可達100 MHz但僅用約10?13 s的脈沖寬度進行有效的高功率激發，在提供高峰值能量的同時維持了低平均能量。此外，雙光子激發的一大獨特性是其激發效率與激發光強度的平方呈正相關，在這種非線性激發模式下，僅有光子密度最高的物鏡焦點處才會產生有效的雙光子激發及熒光信號。由于除此之外近紅外激發光在樣本的入射路徑中基本上難以用于激發熒光分子而被吸收，因此其穿透效率及深度很大程度得以提升，并減輕了樣本的光漂白以及光毒性。
雙光子顯微鏡在相同物鏡倍數等條件下分辨率不及共聚焦顯微鏡，同時成像速度不高。對于同一熒光分子，二者的發射光譜雖一樣，但雙光子的激發光譜比單光子（共聚焦）在橫軸波長方向的兩倍更廣闊，使其在多色成像時很容易同時激發多個通道，造成串色。因此雙光子樣本通常只做單色或雙色標記，在活體上能觀測到的免疫細胞等對象的通道組合有限，相當程度上限制了很多研究方案的實施。總體而言，共聚焦技術仍具備靈活性和低成本等固有優勢，是各大實驗開展活體研究的主要應用手段之一。為肺部疾病在活體狀態下的研究構建基于共聚焦技術的方法學基礎仍在開展并受到重視[25]，同時該領域的熱點研究也在持續產出[37-38]。
3 肺部炎癥及感染模型
3.1 細菌性肺炎
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）是一種呼吸道感染致病菌，可引發急性化膿性肺炎，其耐甲氧西林的菌株（methicillin-resistant S. aureus，MRSA）臨床上常見且毒性較強，被廣泛用于動物感染模型[39]。Lefrancais等[40] 通過MRSA肺炎小鼠模型研究了中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）在肺損傷中的作用。該實驗將小鼠的左肺手術暴露后通過負壓胸吸窗進行固定，在氣管中注入MRSA臨床菌株以建立急性肺損傷模型，并采用雙光子顯微鏡以0.4 mm2的視野面積和40 μm的深度進行每分鐘1次的總計120 min的成像以觀測肺微循環中NETs的變化，成像數據顯示肺在被感染后迅即促發了中性粒細胞的募集以及NETs在肺血管和肺泡腔中的分泌，其圖像首次展示了NETs在肺中的動態產生過程[40]。
3.2 病毒性感染
活體顯微成像技術亦被用于研究病毒性感染。Neupane等[41] 建立了一套用于有效觀測肺泡巨噬細胞的活體成像方法，展示了肺泡巨噬細胞移動于各個肺泡間以對呼吸系統進行免疫監視并且對吸入的細菌進行吞噬以避免促發肺炎的過程，其中甲型流感病毒的介入妨礙了其巡邏和吞噬功能并增加了中性粒細胞浸潤。此外，Naumenko等[42] 開發了一套實時觀測溶瘤水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）與宿主細胞之間相互作用的活體成像方法，可涵蓋癌癥小鼠模型的整個治療過程，具備可視化活小鼠血液、腫瘤以及內臟中單個細胞及VSV 的高靈敏度及空間分辨率。對于肺部，其采用與上述觀測肺泡巨噬細胞相似的顯微成像系統和手術處理并通過相應的標記手段觀測到了VSV與白細胞的相互作用。
3.3 囊性纖維化
囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是一種由囊性纖維化跨膜轉導調節因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）的基因突變所引發的遺傳性疾病，可導致長期肺部感染。在這方面，Brown等[43] 探索了CFTR對肺微血管內皮細胞屏障功能的影響。在靜脈注入可溶性香煙煙霧提取物后，活體雙光子顯微成像顯示相較于野生型小鼠，同窩CFTR缺失的轉基因小鼠展現了肺泡毛細血管屏障功能障礙顯著增加的跡象，包括血漿外滲以及炎癥細胞與內皮粘附的增多。結合體外實驗結果，其研究表明CFTR對肺內皮細胞屏障功能具有維持作用，CFTR功能的缺失尤其是在伴隨香煙煙霧暴露的條件下可導致內皮細胞通透性增加進而促進肺炎。
3.4 膿毒癥急性肺損傷
膿毒癥（sepsis）是由細菌等病原微生物感染引發的全身炎癥反應綜合征，在嚴重的情況下可導致急性肺損傷。膿毒癥急性肺損傷作為重癥監護病房的常見病，是危重癥疾病研究的重點[44]。例如，Yipp等[45] 的研究驗證了膿毒癥過程中Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）以及分化抗原簇分子11B（cluster of differentiation molecule 11B，CD11b）是肺毛細血管中性粒細胞進行宿主防御所必需的。在靜脈注射脂多糖后，肺活體共聚焦顯微成像顯示，相較于正常組，TLR4–、MyD88–以及CD11b–敲除小鼠的肺毛細血管中性粒細胞的貼壁、爬行等行為顯著減弱。
4 肺部活體顯微成像技術的局限性
肺部活體顯微成像視窗的直徑大小通常為10 mm左右[7,46]，僅能觀察到肺前部分有限的表淺部位。肺表面由毛細血管網及彈性纖維所包繞的一系列肺泡所構成，結構復雜并且豐富的氣-液界面會導致大量的光散射，在削弱分辨率的同時加速入射光的衰減進而降低成像深度，將其局限于一兩百微米以內[5]。這部分是研究肺轉移瘤、肺損傷等疾病以及肺內穩態的重要區域，然而很多疾病，例如哮喘、肺部細菌性感染、肺部病毒性感染乃至原發性肺癌會作用于較大的呼吸道及血管等內部區域[5]，只有提升成像深度才能完整地在活體原位的基礎上揭示其免疫學特征及發病機制。
5 總結
肺部活體顯微成像技術發展至今取得了長足進步，其成像視野的窗口構建主要采用基于粘合劑固定法或負壓胸吸窗的機械固定方式，并在朝著小型化、低創傷性、高穩定性及長時程成像等方向優化，同時隨著共聚焦、雙光子這類具備光學層切能力的顯微鏡的開發，其成像深度和質量有了顯著提升。該技術的固有缺陷是成像視野的穩定性會不可避免地受制于肺部的生理運動，同時其成像范圍尚局限于肺部淺表層。
利益沖突：無。
作者貢獻：程雨飛提出研究設計，收集資料，撰寫初稿，修改論文；張龍浩修改論文。