動脈導管未閉（patent ductus arteriosus，PDA）是常見的先天性心臟病（先心病）之一，約占所有先心病的20%[1-2]。PDA導致心肺功能改變，造成心力衰竭、肺動脈高壓、感染性心內膜炎等風險[3-4]。目前，經皮PDA介入封堵術在世界范圍內得到廣泛應用并逐漸成為PDA的首選治療方法[5-6]。為研究PDA的介入治療器材及病理生理改變，需要建立合適的動物模型，但既往小動物模型多采用轉基因大鼠或小鼠[7]，費用昂貴，在血流動力學和病理生理等方面不能很好地模擬人類PDA，而且無法行介入封堵手術。既往研究顯示犬的PDA動物模型建模成功率僅50%左右[8-9]，這主要是既往建模方法存在手術創傷大、操作困難等缺點 [8, 10-14]。巴馬小型豬的心臟解剖、血流動力學和病理生理等特點與人類相近，不但能模擬PDA對心肺功能的影響，而且可以進行經外周血管的封堵實驗。本研究擬通過使用巴馬小型豬自體頸靜脈吻合至升主動脈和主肺動脈之間，建立一個簡單、安全、可靠的PDA大動物模型，為PDA封堵器研制及先心病相關肺高壓研究提供穩定的動物平臺。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
雄性巴馬小型豬5頭，體重35.5～61.1（45.7±7.57）kg，術前經超聲檢查不合并心臟解剖異常。實驗動物和實驗場地均由中國醫學科學院阜外醫院西山實驗基地大動物平臺提供。
1.2 術前準備及麻醉
術前禁食8 h，全身麻醉（全麻）后將動物仰臥位固定于手術臺上，經口氣管插管連接呼吸機，潮氣量10 mL/kg，呼吸頻率15次/min，術中根據血氣結果適當調節呼吸機參數。根據超聲評估頸靜脈的合適節段作為目標血管并用記號筆標記（圖1a）。手術區域消毒，鋪無菌單。
圖1
PDA建模過程圖
1.3 獲取頸靜脈
根據術前標記，于頸部中線偏右側約2 cm做5 cm切口，游離右頸靜脈，分別用7號絲線結扎近、遠端（圖1b），切斷取下約3 cm長的頸靜脈，盡量剝離頸靜脈外膜組織，套于10 mL注射器針帽并置于0.625%戊二醛中固定15 min，生理鹽水清洗干凈后，無菌濕紗布包裹備用（圖1c）。常規逐層縫合頸靜脈切口。
1.4 制作PDA模型
胸骨正中切口，劈開胸骨后牽開器撐開，剪開心包并懸吊，游離主、肺動脈間隔，靜脈注射肝素100 U/kg，使活化凝血時間（activated clotting time，ACT）>250 s。側壁鉗阻斷部分升主動脈后觀察血壓、心率等參數，血流動力學穩定后將處理好的頸靜脈使用6-0 prolene線連續縫合，端側吻合于升主動脈，確認吻合口無滲血后，使用哈巴狗夾閉頸靜脈并移除主動脈側壁鉗。側壁鉗部分阻斷主肺動脈近端，確認血流動力學穩定，使用6-0 prolene線將頸靜脈另一側端側吻合于主肺動脈，打結前行吻合口排氣完成最終吻合（圖1d）。檢查吻合口無出血后，通過超聲或心血管造影確認PDA通暢情況。心包不縫合，留置心包引流管一根，仔細止血，鋼絲閉合胸骨，逐層縫合肌肉及皮膚層關胸。
1.5 術后管理
術后預防性使用抗生素1周（每次靜脈滴注頭孢呋辛鈉1.5 g，2次/d）。術后即刻經胃管給于阿斯匹林300 mg及氯吡格雷225 mg，術后第1 d開始每日給于阿斯匹林100 mg及氯吡格雷75 mg口服抗血小板。視引流量情況于術后第2 d左右拔除心包引流管。
1.6 經股靜脈介入封堵
術后1周時超聲確認PDA通暢后，動物全麻仰臥固定于手術臺。切開右腹股溝，分別游離股動脈、股靜脈后穿刺置入鞘管，升主動脈造影明確PDA走行及通暢情況（圖2a）。放射線引導下經右股靜脈將網籃導絲置于肺動脈，經右股動脈置入6Fr MPA2導管及260 cm泥鰍導絲，泥鰍導絲通過PDA后在肺動脈內被網籃導絲抓捕，回撤網籃導絲至體外，通過泥鰍導絲建立股靜脈-主肺動脈-PDA-升主動脈-股動脈軌道，經股靜脈置入10Fr輸送鞘至升主動脈，將PDA封堵器（上海形狀記憶公司，圖2b）收入裝載鞘內，使用鋼尺標記封堵器從剛冒出輸送鞘至完全釋放出來時輸送鋼纜的長度（圖2c）。在超聲引導下，先釋放封堵器主動脈側，拉緊成型線，回撤封堵器緊貼主動脈后，固定鋼纜，回撤輸送鞘管全部釋放出封堵器，超聲顯示PDA處分流消失后，剪斷并抽除成型線，完全釋放封堵器，再次超聲和升主動脈造影確定封堵完全后，拔除股動、靜脈鞘管并逐層縫合切口。
圖2
PDA經皮介入封堵示意圖
1.7 解剖學及組織學檢查
術后即刻及術后1周，實驗動物復查完超聲和心血管造影后處死。取肺組織、PDA及其連接的大動脈，用生理鹽水沖洗干凈，使用10%甲醛溶液固定48 h。再經過梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片和HE染色后在顯微鏡下觀察。
1.8 倫理審查
本研究經中國醫學科學院阜外醫院醫學倫理委員會審批，批準號：0104-1-10-ZX（X）-30。
2 結果
2.1 PDA建模情況
5頭動物均順利完成手術，1頭動物即刻取材，4頭動物飼養一周后生命體征正常，造模成功率100%。5頭動物術前超聲測量右頸外靜脈直徑（4.6±0.6）mm，獲取頸靜脈耗時（12.6±3.4）min。頸靜脈與主動脈和肺動脈端側吻合時間（13.2±1.6）min，未出現出血、血壓難以維持等可能引起動物死亡的情況。手術臺上PDA可觸及明顯連續性震顫，術后即刻及術后1周復查超聲及心血管造影顯示PDA血流通暢。
2.2 經股靜脈PDA封堵情況
2只PDA通暢實驗動物順利完成經股靜脈PDA封堵術，從股靜脈穿刺至拔除血管鞘的手術時間分別為52 min、43 min。術中導絲難以經肺動脈側通過PDA進入主動脈內，但經主動脈側通過PDA進入肺動脈側可輕松建立封堵軌道。封堵后動物血流動力學平穩，造影顯示動脈水平分流消失，無殘余分流、心臟和血管損傷等并發癥。
2.3 解剖學及組織學檢查
實驗動物即刻和術后1周取材，肉眼見PDA各吻合口通暢，PDA外形呈管狀，其內未見血栓、吻合口瘺或膨出瘤形成（圖3a～c）；術后1周HE染色見PDA內皮化良好（圖3d）。術后1周雙側胸腔有不同程度粘連，肺組織呈鮮紅色；與術后即刻取材動物相比，術后1周動物肺組織HE染色可見肺小動脈內膜及肌層增厚，肺間質增厚，肺泡內炎性滲出，中性粒細胞浸潤（圖4）。
圖3
術后1周PDA大體及組織學檢查
圖4
肺部組織學檢查。與術后即刻取材動物(a:x10, b:x20)相比，術后1周動物肺組織(c:x10, d:x20)HE染色可見肺小動脈內膜及肌層增厚，肺間質增厚，肺泡內炎性滲出，中性粒細胞浸潤。
3 討論
本研究選取自體頸靜脈作為移植物分別與升主動脈與主肺動脈行端側吻合，建立了相對符合PDA病理生理特點和血流動力學的大動物模型，并且使用完全可吸收封堵器完成了2頭動物的經股靜脈PDA封堵術。本研究具有如下優點：（1）相較使用人造血管建立PDA，使用自體血管取材方便，吻合后不容易出血，亦無需額外費用，降低實驗成本；（2）相較于肋間切口，選擇胸骨正中切口建立PDA模型，可以降低手術對動物肺部的影響，最主要的是吻合口表淺，手術難度大大降低，并且減少了出血、吻合口狹窄等并發癥，提高了建模成功率。本研究的難點在于：（1）巴馬小型豬升主動脈、肺動脈分別自左心室、右心室發出后，很快轉向背側向深處走行，故既往游離暴露降主動脈和左肺動脈的難度非常大，但是正中切口經過心包懸吊、右心耳牽開和主肺間隔游離后，可提供足夠的操作空間，需要注意的是使用側壁鉗部分阻斷大動脈時，需要觀察血壓、心率等指標變化，盡量在血流動力學穩定的情況下有條不紊地進行血管吻合；（2）吻合血管的合適粗細非常重要，血管過粗將引起分流過量導致動物心力衰竭死亡，血管過細易發生血管堵塞。本研究術前常規超聲測量頸靜脈直徑，在游離、獲取血管時操作盡量輕柔，避免過多刺激造成血管攣縮，最終獲取的血管直徑比較合適；（3）盡量避免影響PDA通暢性的因素。首先，本研究選用自體頸外靜脈作為血管材料，從根源上避免人造血管促使血栓形成和易并發感染的缺點。其次，本研究使用戊二醛固定頸靜脈，大大降低吻合難度和縮短了手術時間，術中確切的吻合保證了血管的長期通暢。最后，由于小型豬凝血功能強，故PDA吻合前靜脈使用肝素抗凝，并給予阿司匹林和氯吡格雷負荷量，PDA吻合后不中和肝素，并于術后第一天開始雙抗治療，足量的抗凝方案也是保證PDA通暢的一個重要原因。
本研究2頭動物成功使用可降解PDA封堵器完成了經股靜脈介入封堵手術，該封堵器是PDO骨架，在放射線下不顯影，在超聲下可清晰顯影[15-16]，但受巴馬小型豬解剖條件限制，無論經胸超聲還是食管超聲，均很難完整顯示PDA的走行，只能分別顯示PDA主動脈或肺動脈側血流情況，故本研究采用超聲+放射線的引導方式，使用放射線建立封堵軌道，結合臨床上“工作距離”的理念[17-18]，使用超聲引導封堵器釋放過程，最終順利實現了封堵器的穩妥放置。
本研究2頭動物術后1周肺組織病理切片可見肺間質增厚、肺小動脈內膜及肌層增厚、中性粒細胞浸潤等炎性改變，這提示肺血管在高流量和高壓力的影響下發生了血管重構，初步形成了先心病左向右分流引起肺動脈高壓的組織學改變[19]。如果使用小月齡動物并延長造模時間，相信可以更精準地模擬先心病相關肺動脈高壓的病理生理改變[20]。
目前國內外尚無使用頸靜脈行升主動脈與主肺動脈端側吻合建立小型豬動物模型的報道。本研究通過優化手術材料和手術流程，建立了一個簡便、安全和穩定的動物模型。在此基礎上，我們成功使用完全可吸收封堵器進行了經外周血管的PDA封堵術，同時發現該動物模型可形成先心病相關肺動脈高壓的病理生理改變，這為PDA介入封堵器材研發和先心病相關肺高壓研究打下堅實基礎。
利益沖突：無。
作者貢獻：李健、歐陽文斌、李文超、張敏負責實驗操作，實驗動物的圍手術期管理，論文撰寫；張鳳文、莊東林、魏培堅、李航負責實驗數據的采集、整理和分析；歐陽文斌、潘湘斌負責論文設計、審閱和修改，經費支持。
動脈導管未閉（patent ductus arteriosus，PDA）是常見的先天性心臟病（先心病）之一，約占所有先心病的20%[1-2]。PDA導致心肺功能改變，造成心力衰竭、肺動脈高壓、感染性心內膜炎等風險[3-4]。目前，經皮PDA介入封堵術在世界范圍內得到廣泛應用并逐漸成為PDA的首選治療方法[5-6]。為研究PDA的介入治療器材及病理生理改變，需要建立合適的動物模型，但既往小動物模型多采用轉基因大鼠或小鼠[7]，費用昂貴，在血流動力學和病理生理等方面不能很好地模擬人類PDA，而且無法行介入封堵手術。既往研究顯示犬的PDA動物模型建模成功率僅50%左右[8-9]，這主要是既往建模方法存在手術創傷大、操作困難等缺點 [8, 10-14]。巴馬小型豬的心臟解剖、血流動力學和病理生理等特點與人類相近，不但能模擬PDA對心肺功能的影響，而且可以進行經外周血管的封堵實驗。本研究擬通過使用巴馬小型豬自體頸靜脈吻合至升主動脈和主肺動脈之間，建立一個簡單、安全、可靠的PDA大動物模型，為PDA封堵器研制及先心病相關肺高壓研究提供穩定的動物平臺。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
雄性巴馬小型豬5頭，體重35.5～61.1（45.7±7.57）kg，術前經超聲檢查不合并心臟解剖異常。實驗動物和實驗場地均由中國醫學科學院阜外醫院西山實驗基地大動物平臺提供。
1.2 術前準備及麻醉
術前禁食8 h，全身麻醉（全麻）后將動物仰臥位固定于手術臺上，經口氣管插管連接呼吸機，潮氣量10 mL/kg，呼吸頻率15次/min，術中根據血氣結果適當調節呼吸機參數。根據超聲評估頸靜脈的合適節段作為目標血管并用記號筆標記（圖1a）。手術區域消毒，鋪無菌單。
圖1
PDA建模過程圖
1.3 獲取頸靜脈
根據術前標記，于頸部中線偏右側約2 cm做5 cm切口，游離右頸靜脈，分別用7號絲線結扎近、遠端（圖1b），切斷取下約3 cm長的頸靜脈，盡量剝離頸靜脈外膜組織，套于10 mL注射器針帽并置于0.625%戊二醛中固定15 min，生理鹽水清洗干凈后，無菌濕紗布包裹備用（圖1c）。常規逐層縫合頸靜脈切口。
1.4 制作PDA模型
胸骨正中切口，劈開胸骨后牽開器撐開，剪開心包并懸吊，游離主、肺動脈間隔，靜脈注射肝素100 U/kg，使活化凝血時間（activated clotting time，ACT）>250 s。側壁鉗阻斷部分升主動脈后觀察血壓、心率等參數，血流動力學穩定后將處理好的頸靜脈使用6-0 prolene線連續縫合，端側吻合于升主動脈，確認吻合口無滲血后，使用哈巴狗夾閉頸靜脈并移除主動脈側壁鉗。側壁鉗部分阻斷主肺動脈近端，確認血流動力學穩定，使用6-0 prolene線將頸靜脈另一側端側吻合于主肺動脈，打結前行吻合口排氣完成最終吻合（圖1d）。檢查吻合口無出血后，通過超聲或心血管造影確認PDA通暢情況。心包不縫合，留置心包引流管一根，仔細止血，鋼絲閉合胸骨，逐層縫合肌肉及皮膚層關胸。
1.5 術后管理
術后預防性使用抗生素1周（每次靜脈滴注頭孢呋辛鈉1.5 g，2次/d）。術后即刻經胃管給于阿斯匹林300 mg及氯吡格雷225 mg，術后第1 d開始每日給于阿斯匹林100 mg及氯吡格雷75 mg口服抗血小板。視引流量情況于術后第2 d左右拔除心包引流管。
1.6 經股靜脈介入封堵
術后1周時超聲確認PDA通暢后，動物全麻仰臥固定于手術臺。切開右腹股溝，分別游離股動脈、股靜脈后穿刺置入鞘管，升主動脈造影明確PDA走行及通暢情況（圖2a）。放射線引導下經右股靜脈將網籃導絲置于肺動脈，經右股動脈置入6Fr MPA2導管及260 cm泥鰍導絲，泥鰍導絲通過PDA后在肺動脈內被網籃導絲抓捕，回撤網籃導絲至體外，通過泥鰍導絲建立股靜脈-主肺動脈-PDA-升主動脈-股動脈軌道，經股靜脈置入10Fr輸送鞘至升主動脈，將PDA封堵器（上海形狀記憶公司，圖2b）收入裝載鞘內，使用鋼尺標記封堵器從剛冒出輸送鞘至完全釋放出來時輸送鋼纜的長度（圖2c）。在超聲引導下，先釋放封堵器主動脈側，拉緊成型線，回撤封堵器緊貼主動脈后，固定鋼纜，回撤輸送鞘管全部釋放出封堵器，超聲顯示PDA處分流消失后，剪斷并抽除成型線，完全釋放封堵器，再次超聲和升主動脈造影確定封堵完全后，拔除股動、靜脈鞘管并逐層縫合切口。
圖2
PDA經皮介入封堵示意圖
1.7 解剖學及組織學檢查
術后即刻及術后1周，實驗動物復查完超聲和心血管造影后處死。取肺組織、PDA及其連接的大動脈，用生理鹽水沖洗干凈，使用10%甲醛溶液固定48 h。再經過梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片和HE染色后在顯微鏡下觀察。
1.8 倫理審查
本研究經中國醫學科學院阜外醫院醫學倫理委員會審批，批準號：0104-1-10-ZX（X）-30。
2 結果
2.1 PDA建模情況
5頭動物均順利完成手術，1頭動物即刻取材，4頭動物飼養一周后生命體征正常，造模成功率100%。5頭動物術前超聲測量右頸外靜脈直徑（4.6±0.6）mm，獲取頸靜脈耗時（12.6±3.4）min。頸靜脈與主動脈和肺動脈端側吻合時間（13.2±1.6）min，未出現出血、血壓難以維持等可能引起動物死亡的情況。手術臺上PDA可觸及明顯連續性震顫，術后即刻及術后1周復查超聲及心血管造影顯示PDA血流通暢。
2.2 經股靜脈PDA封堵情況
2只PDA通暢實驗動物順利完成經股靜脈PDA封堵術，從股靜脈穿刺至拔除血管鞘的手術時間分別為52 min、43 min。術中導絲難以經肺動脈側通過PDA進入主動脈內，但經主動脈側通過PDA進入肺動脈側可輕松建立封堵軌道。封堵后動物血流動力學平穩，造影顯示動脈水平分流消失，無殘余分流、心臟和血管損傷等并發癥。
2.3 解剖學及組織學檢查
實驗動物即刻和術后1周取材，肉眼見PDA各吻合口通暢，PDA外形呈管狀，其內未見血栓、吻合口瘺或膨出瘤形成（圖3a～c）；術后1周HE染色見PDA內皮化良好（圖3d）。術后1周雙側胸腔有不同程度粘連，肺組織呈鮮紅色；與術后即刻取材動物相比，術后1周動物肺組織HE染色可見肺小動脈內膜及肌層增厚，肺間質增厚，肺泡內炎性滲出，中性粒細胞浸潤（圖4）。
圖3
術后1周PDA大體及組織學檢查
圖4
肺部組織學檢查。與術后即刻取材動物(a:x10, b:x20)相比，術后1周動物肺組織(c:x10, d:x20)HE染色可見肺小動脈內膜及肌層增厚，肺間質增厚，肺泡內炎性滲出，中性粒細胞浸潤。
3 討論
本研究選取自體頸靜脈作為移植物分別與升主動脈與主肺動脈行端側吻合，建立了相對符合PDA病理生理特點和血流動力學的大動物模型，并且使用完全可吸收封堵器完成了2頭動物的經股靜脈PDA封堵術。本研究具有如下優點：（1）相較使用人造血管建立PDA，使用自體血管取材方便，吻合后不容易出血，亦無需額外費用，降低實驗成本；（2）相較于肋間切口，選擇胸骨正中切口建立PDA模型，可以降低手術對動物肺部的影響，最主要的是吻合口表淺，手術難度大大降低，并且減少了出血、吻合口狹窄等并發癥，提高了建模成功率。本研究的難點在于：（1）巴馬小型豬升主動脈、肺動脈分別自左心室、右心室發出后，很快轉向背側向深處走行，故既往游離暴露降主動脈和左肺動脈的難度非常大，但是正中切口經過心包懸吊、右心耳牽開和主肺間隔游離后，可提供足夠的操作空間，需要注意的是使用側壁鉗部分阻斷大動脈時，需要觀察血壓、心率等指標變化，盡量在血流動力學穩定的情況下有條不紊地進行血管吻合；（2）吻合血管的合適粗細非常重要，血管過粗將引起分流過量導致動物心力衰竭死亡，血管過細易發生血管堵塞。本研究術前常規超聲測量頸靜脈直徑，在游離、獲取血管時操作盡量輕柔，避免過多刺激造成血管攣縮，最終獲取的血管直徑比較合適；（3）盡量避免影響PDA通暢性的因素。首先，本研究選用自體頸外靜脈作為血管材料，從根源上避免人造血管促使血栓形成和易并發感染的缺點。其次，本研究使用戊二醛固定頸靜脈，大大降低吻合難度和縮短了手術時間，術中確切的吻合保證了血管的長期通暢。最后，由于小型豬凝血功能強，故PDA吻合前靜脈使用肝素抗凝，并給予阿司匹林和氯吡格雷負荷量，PDA吻合后不中和肝素，并于術后第一天開始雙抗治療，足量的抗凝方案也是保證PDA通暢的一個重要原因。
本研究2頭動物成功使用可降解PDA封堵器完成了經股靜脈介入封堵手術，該封堵器是PDO骨架，在放射線下不顯影，在超聲下可清晰顯影[15-16]，但受巴馬小型豬解剖條件限制，無論經胸超聲還是食管超聲，均很難完整顯示PDA的走行，只能分別顯示PDA主動脈或肺動脈側血流情況，故本研究采用超聲+放射線的引導方式，使用放射線建立封堵軌道，結合臨床上“工作距離”的理念[17-18]，使用超聲引導封堵器釋放過程，最終順利實現了封堵器的穩妥放置。
本研究2頭動物術后1周肺組織病理切片可見肺間質增厚、肺小動脈內膜及肌層增厚、中性粒細胞浸潤等炎性改變，這提示肺血管在高流量和高壓力的影響下發生了血管重構，初步形成了先心病左向右分流引起肺動脈高壓的組織學改變[19]。如果使用小月齡動物并延長造模時間，相信可以更精準地模擬先心病相關肺動脈高壓的病理生理改變[20]。
目前國內外尚無使用頸靜脈行升主動脈與主肺動脈端側吻合建立小型豬動物模型的報道。本研究通過優化手術材料和手術流程，建立了一個簡便、安全和穩定的動物模型。在此基礎上，我們成功使用完全可吸收封堵器進行了經外周血管的PDA封堵術，同時發現該動物模型可形成先心病相關肺動脈高壓的病理生理改變，這為PDA介入封堵器材研發和先心病相關肺高壓研究打下堅實基礎。
利益沖突：無。
作者貢獻：李健、歐陽文斌、李文超、張敏負責實驗操作，實驗動物的圍手術期管理，論文撰寫；張鳳文、莊東林、魏培堅、李航負責實驗數據的采集、整理和分析；歐陽文斌、潘湘斌負責論文設計、審閱和修改，經費支持。
