引用本文： 戴越, 周帆, 鄭建偉, 穆軍升, 伯平, 尤斌. CDM3對人誘導多能干細胞與覆有基質膠的聚己內酯共培養制作心肌補片的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(5): 738-745. doi: 10.7507/1007-4848.202206078 復制
心血管疾病成為危害全世界人類健康的重要問題[1]。心肌梗死發生后，存活的心肌細胞數量會減少，最終導致心律失常和終末期心力衰竭發作[2]。目前，臨床上除心臟移植外沒有一種治療方式可以逆轉心肌梗死造成的心肌損傷，尤其是大面積心肌梗死患者[3]。干細胞因為具有自我更新和潛在的細胞分化能力受到廣泛關注，通過干細胞移植治療修復受損的心肌結構和恢復心臟功能，被認為是心肌梗死最有前途的治療方式之一[4-6]。
在多種干細胞中，誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）具有低免疫排斥反應、無限的自我增殖能力和全譜系分化潛力，目前被認為是器官再生/修復的重要細胞來源之一[7]。當前已有多種誘導方案獲得心肌樣細胞，其中標準的化學定義和基于小分子誘導方案（CDM3）心肌誘導分化方法已經能夠更高效穩定地獲得人誘導多能干細胞來源心肌細胞（human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes，hiPSC-CM），獲得的心肌樣細胞具有與人成熟心肌細胞更相近的心肌標志物蛋白表達、電生理及微觀結構，顯示出極大的優勢[8]。
然而因為血液沖刷和心臟機械收縮作用，導致移植細胞的種植率和存活率低。通過載體支架來為移植細胞提供良好的環境，從而提高細胞存活、保留和修復能力[9]。聚己內酯（polycaprolactone，PCL）具有可塑的力學性能、較好的生物相容性、易于加工的特點，已廣泛應用于心臟組織工程。本研究旨在通過將覆有基質膠的PCL與人誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）共培養后，利用CDM3方案促進hiPSCs心肌向分化，從而初步構建心肌補片，為進一步通過其他體外實驗研究心肌補片成熟度以及體內動物實驗研究其安全性提供實驗數據和理論依據支持。
1 材料與方法
1.1 材料
hiPSCs、PGM1人多潛能干細胞培養基、PSCeasy?人多潛能干細胞復蘇培養基、PSCeasy?人多潛能干細胞消化液、PSCeasy?人多潛能干細胞鋪底工作液和CardioEasy?人心肌細胞分化試劑盒均購自北京賽貝公司（Cellapy）。PSCeasy?人多潛能干細胞鋪底工作液主要成分是基質膠。磷酸鹽緩沖液（PBS）、細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試劑均購自上海翊圣公司。免疫熒光標記抗體購自美國Abcam公司。PCL來自清華大學化工系及清華大學蘇州環境創新學院，采用靜電紡絲法制成厚0.5 mm 的支架。
1.2 hiPSCs的復蘇、培養及鑒定
從液氮罐中取出一支凍存的hiPSCs，浸入37℃水浴鍋中迅速解凍，移入15 mL離心管中，加入3 mL復蘇培養基，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，2 mL復蘇培養基重懸細胞，接種于提前1 d準備的6孔細胞培養板上（每孔1 mL基質膠，37℃，過夜，使用前吸棄），放入培養箱中培養，第2 d起使用PGM1人多潛能干細胞培養基維持培養。每天更換培養基，hiPSCs細胞密度達到80%～90%時消化5 min傳代，接種于覆有基質膠的細胞培養板中，繼續培養。
1.3 hiPSCs與覆有基質膠的PCL支架共培養
PCL支架用打孔器剪成直徑5 mm的圓形片，經紫外線正反面各照射1 h滅菌后放入96孔板內，每孔加入100 μL鋪底工作液，37℃過夜。吸棄后將細胞培養板中的hiPSCs解離成單細胞懸液，逐滴接種到覆有基質膠的PCL支架上，孵育過夜確保細胞附著。每天更換培養基。
1.4 實驗分組及hiPSCs的誘導分化
hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養24 h后，根據培養基不同進行分組。對照組使用基礎培養基培養6 d，CDM3組使用人心肌細胞分化完全培養基培養6 d。
根據試劑盒說明書，分別將人心肌細胞分化添加劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與人心肌細胞基礎培養基混合形成人心肌細胞分化完全培養基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。當hiPSCs與PCL共培養24 h后開啟心肌向分化進程。在分化的第0 d，吸棄培養基，PBS洗1遍，加入人心肌細胞分化添加劑Ⅰ孵育48 h。第2 d，吸棄培養基，PBS洗1遍，加入人心肌細胞分化添加劑Ⅱ孵育48 h。第4 d，吸棄培養基，PBS洗1遍，加入人心肌細胞分化完全培養基Ⅲ孵育48 h。第6 d起，用于心肌細胞維持培養的培養基Ⅲ每隔1 d更換1次。
1.5 免疫熒光染色
將細胞培養板hiPSCs、PCL支架上培養的hiPSC-CM分別進行免疫熒光成像觀察。簡而言之，細胞在室溫下4%多聚甲醛固定20 min，加入0.5% Triton-X100室溫透膜10 min，4%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入兔抗大鼠一抗OCT4（1∶200）、兔抗大鼠一抗cTnT（1∶200）、兔抗大鼠一抗α-actin（1∶250）在4℃下孵育過夜。加入山羊抗兔二抗室溫避光孵育2 h。加入 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核，室溫10 min。每步操作之間PBS洗3遍，每次5 min。熒光圖像由LEICA：PDMI 4000 B倒置熒光顯微鏡下捕獲。
1.6 掃描電子顯微鏡觀察
標本經過PBS洗滌后，使用2.5%戊二醛固定，4℃保存，制成電鏡標本觀察覆有基質膠的PCL材料表面形態和覆有基質膠的PCL上的細胞形態。
1.7 CCK-8法測定細胞增殖情況
在基礎培養基中hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養7 d，分別在培養的第1 d、3 d、5 d、7 d使用CCK-8測定細胞增殖情況。每組設置4個復孔，用Bio-Tek：Synergn 4酶標儀測450 nm處吸光度值。
1.8 統計學分析
實驗數據應用SPSS 20.0軟件進行統計處理。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）描述。
2 結果
2.1 hiPSCs的形態及鑒定
細胞培養24 h后，光鏡下hiPSCs在覆有基質膠的細胞培養板中克隆生長，形成集落，集落形態扁平、致密、形態較規則（圖1）。
圖1
hiPSCs光鏡下呈克隆生長，細胞邊界清晰
a：×100；b：×200
OCT4為iPSCs特異性標志蛋白，在hiPSCs與覆有基質膠的細胞培養板以及覆有基質膠的PCL上共培養24 h后，通過免疫熒光觀察干細胞OCT4的表達。OCT4蛋白發出綠色熒光，細胞核為DAPI藍染（圖2）。免疫熒光發現細胞培養板及PCL上的hiPSCs細胞形態一致，體現出干細胞大核仁及胞漿少的特點，細胞核DAPI藍染均強表達，說明hiPSCs在覆有基質膠的PCL上黏附增殖。高表達綠色熒光OCT4，表明hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養24 h保持未分化狀態。覆有基質膠的細胞培養板上的綠色熒光顯示hiPSCs多為單層細胞生長，而覆有基質膠的PCL上的綠色熒光多重疊，呈現亮暗相間，表明hiPSCs不僅生長在覆有基質膠的PCL表面，也會遷移到三維網狀結構的內部。
圖2
hiPSCs培養24 h后細胞干性鑒定
a～c：hiPSCs與覆有基質膠的細胞培養板共培養干細胞干性鑒定；a：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；b：hiPSCs表達綠色熒光干性標志物OCT4（×200）；c：圖a、b嵌合（×200）；d～f：hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養干細胞干性鑒定；d：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；e：hiPSCs表達綠色熒光干性標志物OCT4（×200）；f：圖d、e嵌合（×200）
2.2 心肌標志物的免疫熒光檢測
hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養24 h后，對照組和CDM3組分別使用對應培養基培養6 d。免疫熒光顯示，對照組的hiPSCs干細胞標志物OCT4高表達（圖3a～c），而CDM3組未見明顯干細胞標志物OCT4綠色熒光表達（圖3d～f）。與之對應，對照組細胞未見明顯表達心肌標志物cTnT（圖4a～c）、α-actin（圖5a～c），CDM3組明顯表達心肌標志物cTnT（圖4d～f）、α-actin（圖5d～f），表明心肌補片初步制備成功。
圖3
不同培養基培養hiPSCs 6 d后細胞干性鑒定
a～c為對照組；a：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；b：hiPSCs表達綠色熒光干性標志物OCT4（×200）；c：圖a、b嵌合（×200）；d～f為CDM3組；d：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；e：未見明顯hiPSCs表達綠色熒光干性標志物OCT4（×200）； f：圖d、e嵌合（×200）
圖4
心肌標志物cTnT表達
a～c為對照組；a：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；b：未見明顯hiPSCs表達cTnT心肌標志物蛋白（×200）；c：圖a、b嵌合（×200）；d～f為CDM3組；d：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；e：hiPSCs表達cTnT心肌標志物蛋白（×200）；f：圖d、e嵌合（×200）
圖5
心肌標志物α-actin表達
a～c為對照組；a：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；b：未見明顯hiPSCs表達α-actin心肌標志物蛋白（×200）；c：圖a、b嵌合（×200）；d～f為CDM3組；d：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；e：hiPSCs表達α-actin心肌標志物蛋白（×200）；f：圖d、e嵌合（×200）
2.3 掃描電子顯微鏡觀察
hiPSCs與PCL共培養24 h后，電鏡結果顯示：覆有基質膠的PCL表面被白色基質膠覆蓋。覆有基質膠的PCL可見大細胞嵌入基質膠，細胞輪廓清晰可見，多呈橢圓形，形成細胞集落（圖6a～b）。
圖6
掃描電鏡
a：覆有基質膠的PCL表面（×500）；b：hiPSCs在覆有基質膠的PCL上生長（×4 000）
2.4 CCK-8法測定細胞增殖情況
在基礎培養基中hiPSCs在覆有基質膠的PCL上培養7 d，第1 d光密度（optical density，OD）值為1.422±0.015，第3 d OD值為1.751±0.037，第5 d OD值為1.898±0.024，第7 d OD值為1.992±0.041，繪制增殖曲線證明 hiPSCs可以在覆有基質膠的PCL上生長增殖（圖7）。
圖7
增殖曲線
3 討論
心肌梗死是導致心肌細胞壞死隨之引起纖維瘢痕組織形成，進一步發展為慢性心力衰竭的主要病因。目前的治療方法主要致力于控制心力衰竭癥狀，而無法逆轉其病理、生理進程。其預后差，死亡率高迫使人們研究新的治療方式。
近些年，因為具有自我更新能力和定向分化潛力，干細胞治療引發人們關注。在眾多候選干細胞中iPSCs因其低免疫排斥反應、無限的自我增殖能力和全譜系分化潛力的特點被廣泛研究。研究[10-14]顯示iPSCs可以向骨骼肌及軟骨細胞、肝細胞、神經細胞、心肌細胞等多個方向分化。然而直接移植細胞到心肌梗死區無法產生良好的治療效果，多數細胞因血液沖刷和心肌跳動而流失。為提高細胞種植率，心臟組織工程應運而生，將細胞和載體共培養制備心肌補片移植到梗死區便可以大大提高種植效率。目前載體支架來源主要分為天然材料和合成材料，天然生物材料是從天然存在的生物來源中提取的材料，這使得天然材料具有模擬細胞微環境的優勢，但由于天然材料不具備良好的機械性能，因此可能在應用于機械收縮強度較大的心臟組織時面臨巨大挑戰。而合成材料可以根據需求構建明確物理機械特性的支架，甚至可以通過不同方式、不同材料支架的組合來提高支架性能，并且具有高可重復性，包括PCL、聚乳酸和聚氨酯等材料[15]。其中PCL因其獨有特性被美國食品藥品監督管理局批準作為生物醫學材料使用，通過靜電紡絲技術制成的PCL，為細胞黏附生長提供有利環境，具有較好的生物相容性；其本身具有良好的力學性能，可以保持一定機械強度抵抗植入部位產生的生理應力，并與目標區域的機械特性相一致；同時具有較低的生物降解性，移植的支架要有足夠的降解時間來提供組織依附生長，直到新生組織能夠穩定發揮功能，目前基于PCL的支架大約3～4年完全降解；還具有低免疫原性和無毒性等特點，因此PCL適合用于心臟組織工程[16-17]。相關研究[18-20]表明，PCL支架和PCL-明膠支架均可以與hiPSC-CM共培養形成心肌補片。
目前已有多種誘導分化方法可以促進干細胞心肌向分化，如5-氮胞苷[21]、堿性成纖維細胞生長因子[22]、外泌體[23]等，但這些方法存在獲得的心肌樣細胞成熟度低、移植到心肌梗死區誘發心律失常等風險[24-25]。本課題組前期已通過維生素C[26]、接觸共培養[27]、5-氮胞苷[28]等誘導分化方法制備心肌補片，同樣存在上述問題。國內外研究表明，CDM3 心肌誘導分化方法已經能夠更高效穩定地獲得hiPSC-CM，獲得的心肌樣細胞具有與人成熟心肌細胞更相近的心肌標志物蛋白表達、電生理及微觀結構，根據cTnT流式細胞術評估，可以獲得80%～95%的cTnT陽性率，顯示出極大的優勢。CDM3方案是指3種成分組成的化學定義培養基：包含L-谷氨酸鹽的RPMI 1640培養基、L-抗壞血酸 2-磷酸鹽和水稻來源重組白蛋白，再結合基于小分子的誘導分化，兩者共同作用，這是一種高效穩定獲得hiPSC-CM的誘導方法[8, 29-30]。故本研究通過將hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養24 h后，在CDM3誘導方案作用下，促進hiPSCs心肌向分化，初步制成心肌補片。
hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養24 h后，免疫熒光顯示hiPSCs保持干細胞干性，細胞在支架上大量生長。掃描電鏡可以清楚看到白色基質膠覆在PCL上，可以見到材料表面的細胞輪廓。對照組繼續培養6 d后，hiPSCs依舊高表達干細胞干性標志物OCT4，而不表達心肌標志物cTnT和α-actin，CDM3組采用分化培養基培養6 d后，hiPSCs心肌向分化，hiPSC-CM表達cTnT和α-actin，不再表達干性標志物OCT4，這初步表明hiPSCs心肌向分化。hiPSCs與覆有基質膠的PCL在基礎培養基中共培養7 d，在培養1 d、3 d、5 d、7 d采用CCK-8法測定OD值，繪制生長曲線發現hiPSCs在覆有基質膠的PCL上穩定增殖。本研究實驗結果證明 hiPSCs可以在覆有基質膠的PCL上生長增殖，在CDM3作用下，促進hiPSCs分化為心肌樣細胞，心肌補片初步制成。
本實驗結果證明了CDM3方案可以促進hiPSCs在PCL上心肌向分化并初步制備心肌補片，在接下來的研究中，將進一步通過體外定量實驗論證采用CDM3方案制備的心肌補片的心肌樣細胞分化效率及成熟度，以及通過體內動物實驗驗證CDM3方案獲得的心肌補片的安全性。未來如何進一步提高心肌補片成熟度，將制備好的心肌補片應用于臨床仍需要進一步研究和論證。
利益沖突：無。
作者貢獻：戴越實施研究，包括細胞培養、心肌補片制作等，撰寫文章；周帆進行免疫組化以及統計學分析等；鄭建偉進行電鏡標本制作及文章校對等；穆軍升總負責，設計課題，對文章進行審閱修改等；伯平收集、整理數據等；尤斌整理圖片及指導相關技術。
心血管疾病成為危害全世界人類健康的重要問題[1]。心肌梗死發生后，存活的心肌細胞數量會減少，最終導致心律失常和終末期心力衰竭發作[2]。目前，臨床上除心臟移植外沒有一種治療方式可以逆轉心肌梗死造成的心肌損傷，尤其是大面積心肌梗死患者[3]。干細胞因為具有自我更新和潛在的細胞分化能力受到廣泛關注，通過干細胞移植治療修復受損的心肌結構和恢復心臟功能，被認為是心肌梗死最有前途的治療方式之一[4-6]。
在多種干細胞中，誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）具有低免疫排斥反應、無限的自我增殖能力和全譜系分化潛力，目前被認為是器官再生/修復的重要細胞來源之一[7]。當前已有多種誘導方案獲得心肌樣細胞，其中標準的化學定義和基于小分子誘導方案（CDM3）心肌誘導分化方法已經能夠更高效穩定地獲得人誘導多能干細胞來源心肌細胞（human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes，hiPSC-CM），獲得的心肌樣細胞具有與人成熟心肌細胞更相近的心肌標志物蛋白表達、電生理及微觀結構，顯示出極大的優勢[8]。
然而因為血液沖刷和心臟機械收縮作用，導致移植細胞的種植率和存活率低。通過載體支架來為移植細胞提供良好的環境，從而提高細胞存活、保留和修復能力[9]。聚己內酯（polycaprolactone，PCL）具有可塑的力學性能、較好的生物相容性、易于加工的特點，已廣泛應用于心臟組織工程。本研究旨在通過將覆有基質膠的PCL與人誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）共培養后，利用CDM3方案促進hiPSCs心肌向分化，從而初步構建心肌補片，為進一步通過其他體外實驗研究心肌補片成熟度以及體內動物實驗研究其安全性提供實驗數據和理論依據支持。
1 材料與方法
1.1 材料
hiPSCs、PGM1人多潛能干細胞培養基、PSCeasy?人多潛能干細胞復蘇培養基、PSCeasy?人多潛能干細胞消化液、PSCeasy?人多潛能干細胞鋪底工作液和CardioEasy?人心肌細胞分化試劑盒均購自北京賽貝公司（Cellapy）。PSCeasy?人多潛能干細胞鋪底工作液主要成分是基質膠。磷酸鹽緩沖液（PBS）、細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試劑均購自上海翊圣公司。免疫熒光標記抗體購自美國Abcam公司。PCL來自清華大學化工系及清華大學蘇州環境創新學院，采用靜電紡絲法制成厚0.5 mm 的支架。
1.2 hiPSCs的復蘇、培養及鑒定
從液氮罐中取出一支凍存的hiPSCs，浸入37℃水浴鍋中迅速解凍，移入15 mL離心管中，加入3 mL復蘇培養基，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，2 mL復蘇培養基重懸細胞，接種于提前1 d準備的6孔細胞培養板上（每孔1 mL基質膠，37℃，過夜，使用前吸棄），放入培養箱中培養，第2 d起使用PGM1人多潛能干細胞培養基維持培養。每天更換培養基，hiPSCs細胞密度達到80%～90%時消化5 min傳代，接種于覆有基質膠的細胞培養板中，繼續培養。
1.3 hiPSCs與覆有基質膠的PCL支架共培養
PCL支架用打孔器剪成直徑5 mm的圓形片，經紫外線正反面各照射1 h滅菌后放入96孔板內，每孔加入100 μL鋪底工作液，37℃過夜。吸棄后將細胞培養板中的hiPSCs解離成單細胞懸液，逐滴接種到覆有基質膠的PCL支架上，孵育過夜確保細胞附著。每天更換培養基。
1.4 實驗分組及hiPSCs的誘導分化
hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養24 h后，根據培養基不同進行分組。對照組使用基礎培養基培養6 d，CDM3組使用人心肌細胞分化完全培養基培養6 d。
根據試劑盒說明書，分別將人心肌細胞分化添加劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與人心肌細胞基礎培養基混合形成人心肌細胞分化完全培養基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。當hiPSCs與PCL共培養24 h后開啟心肌向分化進程。在分化的第0 d，吸棄培養基，PBS洗1遍，加入人心肌細胞分化添加劑Ⅰ孵育48 h。第2 d，吸棄培養基，PBS洗1遍，加入人心肌細胞分化添加劑Ⅱ孵育48 h。第4 d，吸棄培養基，PBS洗1遍，加入人心肌細胞分化完全培養基Ⅲ孵育48 h。第6 d起，用于心肌細胞維持培養的培養基Ⅲ每隔1 d更換1次。
1.5 免疫熒光染色
將細胞培養板hiPSCs、PCL支架上培養的hiPSC-CM分別進行免疫熒光成像觀察。簡而言之，細胞在室溫下4%多聚甲醛固定20 min，加入0.5% Triton-X100室溫透膜10 min，4%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入兔抗大鼠一抗OCT4（1∶200）、兔抗大鼠一抗cTnT（1∶200）、兔抗大鼠一抗α-actin（1∶250）在4℃下孵育過夜。加入山羊抗兔二抗室溫避光孵育2 h。加入 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核，室溫10 min。每步操作之間PBS洗3遍，每次5 min。熒光圖像由LEICA：PDMI 4000 B倒置熒光顯微鏡下捕獲。
1.6 掃描電子顯微鏡觀察
標本經過PBS洗滌后，使用2.5%戊二醛固定，4℃保存，制成電鏡標本觀察覆有基質膠的PCL材料表面形態和覆有基質膠的PCL上的細胞形態。
1.7 CCK-8法測定細胞增殖情況
在基礎培養基中hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養7 d，分別在培養的第1 d、3 d、5 d、7 d使用CCK-8測定細胞增殖情況。每組設置4個復孔，用Bio-Tek：Synergn 4酶標儀測450 nm處吸光度值。
1.8 統計學分析
實驗數據應用SPSS 20.0軟件進行統計處理。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）描述。
2 結果
2.1 hiPSCs的形態及鑒定
細胞培養24 h后，光鏡下hiPSCs在覆有基質膠的細胞培養板中克隆生長，形成集落，集落形態扁平、致密、形態較規則（圖1）。
圖1
hiPSCs光鏡下呈克隆生長，細胞邊界清晰
a：×100；b：×200
OCT4為iPSCs特異性標志蛋白，在hiPSCs與覆有基質膠的細胞培養板以及覆有基質膠的PCL上共培養24 h后，通過免疫熒光觀察干細胞OCT4的表達。OCT4蛋白發出綠色熒光，細胞核為DAPI藍染（圖2）。免疫熒光發現細胞培養板及PCL上的hiPSCs細胞形態一致，體現出干細胞大核仁及胞漿少的特點，細胞核DAPI藍染均強表達，說明hiPSCs在覆有基質膠的PCL上黏附增殖。高表達綠色熒光OCT4，表明hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養24 h保持未分化狀態。覆有基質膠的細胞培養板上的綠色熒光顯示hiPSCs多為單層細胞生長，而覆有基質膠的PCL上的綠色熒光多重疊，呈現亮暗相間，表明hiPSCs不僅生長在覆有基質膠的PCL表面，也會遷移到三維網狀結構的內部。
圖2
hiPSCs培養24 h后細胞干性鑒定
a～c：hiPSCs與覆有基質膠的細胞培養板共培養干細胞干性鑒定；a：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；b：hiPSCs表達綠色熒光干性標志物OCT4（×200）；c：圖a、b嵌合（×200）；d～f：hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養干細胞干性鑒定；d：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；e：hiPSCs表達綠色熒光干性標志物OCT4（×200）；f：圖d、e嵌合（×200）
2.2 心肌標志物的免疫熒光檢測
hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養24 h后，對照組和CDM3組分別使用對應培養基培養6 d。免疫熒光顯示，對照組的hiPSCs干細胞標志物OCT4高表達（圖3a～c），而CDM3組未見明顯干細胞標志物OCT4綠色熒光表達（圖3d～f）。與之對應，對照組細胞未見明顯表達心肌標志物cTnT（圖4a～c）、α-actin（圖5a～c），CDM3組明顯表達心肌標志物cTnT（圖4d～f）、α-actin（圖5d～f），表明心肌補片初步制備成功。
圖3
不同培養基培養hiPSCs 6 d后細胞干性鑒定
a～c為對照組；a：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；b：hiPSCs表達綠色熒光干性標志物OCT4（×200）；c：圖a、b嵌合（×200）；d～f為CDM3組；d：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；e：未見明顯hiPSCs表達綠色熒光干性標志物OCT4（×200）； f：圖d、e嵌合（×200）
圖4
心肌標志物cTnT表達
a～c為對照組；a：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；b：未見明顯hiPSCs表達cTnT心肌標志物蛋白（×200）；c：圖a、b嵌合（×200）；d～f為CDM3組；d：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；e：hiPSCs表達cTnT心肌標志物蛋白（×200）；f：圖d、e嵌合（×200）
圖5
心肌標志物α-actin表達
a～c為對照組；a：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；b：未見明顯hiPSCs表達α-actin心肌標志物蛋白（×200）；c：圖a、b嵌合（×200）；d～f為CDM3組；d：hiPSCs細胞核被DAPI染成藍色（×200）；e：hiPSCs表達α-actin心肌標志物蛋白（×200）；f：圖d、e嵌合（×200）
2.3 掃描電子顯微鏡觀察
hiPSCs與PCL共培養24 h后，電鏡結果顯示：覆有基質膠的PCL表面被白色基質膠覆蓋。覆有基質膠的PCL可見大細胞嵌入基質膠，細胞輪廓清晰可見，多呈橢圓形，形成細胞集落（圖6a～b）。
圖6
掃描電鏡
a：覆有基質膠的PCL表面（×500）；b：hiPSCs在覆有基質膠的PCL上生長（×4 000）
2.4 CCK-8法測定細胞增殖情況
在基礎培養基中hiPSCs在覆有基質膠的PCL上培養7 d，第1 d光密度（optical density，OD）值為1.422±0.015，第3 d OD值為1.751±0.037，第5 d OD值為1.898±0.024，第7 d OD值為1.992±0.041，繪制增殖曲線證明 hiPSCs可以在覆有基質膠的PCL上生長增殖（圖7）。
圖7
增殖曲線
3 討論
心肌梗死是導致心肌細胞壞死隨之引起纖維瘢痕組織形成，進一步發展為慢性心力衰竭的主要病因。目前的治療方法主要致力于控制心力衰竭癥狀，而無法逆轉其病理、生理進程。其預后差，死亡率高迫使人們研究新的治療方式。
近些年，因為具有自我更新能力和定向分化潛力，干細胞治療引發人們關注。在眾多候選干細胞中iPSCs因其低免疫排斥反應、無限的自我增殖能力和全譜系分化潛力的特點被廣泛研究。研究[10-14]顯示iPSCs可以向骨骼肌及軟骨細胞、肝細胞、神經細胞、心肌細胞等多個方向分化。然而直接移植細胞到心肌梗死區無法產生良好的治療效果，多數細胞因血液沖刷和心肌跳動而流失。為提高細胞種植率，心臟組織工程應運而生，將細胞和載體共培養制備心肌補片移植到梗死區便可以大大提高種植效率。目前載體支架來源主要分為天然材料和合成材料，天然生物材料是從天然存在的生物來源中提取的材料，這使得天然材料具有模擬細胞微環境的優勢，但由于天然材料不具備良好的機械性能，因此可能在應用于機械收縮強度較大的心臟組織時面臨巨大挑戰。而合成材料可以根據需求構建明確物理機械特性的支架，甚至可以通過不同方式、不同材料支架的組合來提高支架性能，并且具有高可重復性，包括PCL、聚乳酸和聚氨酯等材料[15]。其中PCL因其獨有特性被美國食品藥品監督管理局批準作為生物醫學材料使用，通過靜電紡絲技術制成的PCL，為細胞黏附生長提供有利環境，具有較好的生物相容性；其本身具有良好的力學性能，可以保持一定機械強度抵抗植入部位產生的生理應力，并與目標區域的機械特性相一致；同時具有較低的生物降解性，移植的支架要有足夠的降解時間來提供組織依附生長，直到新生組織能夠穩定發揮功能，目前基于PCL的支架大約3～4年完全降解；還具有低免疫原性和無毒性等特點，因此PCL適合用于心臟組織工程[16-17]。相關研究[18-20]表明，PCL支架和PCL-明膠支架均可以與hiPSC-CM共培養形成心肌補片。
目前已有多種誘導分化方法可以促進干細胞心肌向分化，如5-氮胞苷[21]、堿性成纖維細胞生長因子[22]、外泌體[23]等，但這些方法存在獲得的心肌樣細胞成熟度低、移植到心肌梗死區誘發心律失常等風險[24-25]。本課題組前期已通過維生素C[26]、接觸共培養[27]、5-氮胞苷[28]等誘導分化方法制備心肌補片，同樣存在上述問題。國內外研究表明，CDM3 心肌誘導分化方法已經能夠更高效穩定地獲得hiPSC-CM，獲得的心肌樣細胞具有與人成熟心肌細胞更相近的心肌標志物蛋白表達、電生理及微觀結構，根據cTnT流式細胞術評估，可以獲得80%～95%的cTnT陽性率，顯示出極大的優勢。CDM3方案是指3種成分組成的化學定義培養基：包含L-谷氨酸鹽的RPMI 1640培養基、L-抗壞血酸 2-磷酸鹽和水稻來源重組白蛋白，再結合基于小分子的誘導分化，兩者共同作用，這是一種高效穩定獲得hiPSC-CM的誘導方法[8, 29-30]。故本研究通過將hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養24 h后，在CDM3誘導方案作用下，促進hiPSCs心肌向分化，初步制成心肌補片。
hiPSCs與覆有基質膠的PCL共培養24 h后，免疫熒光顯示hiPSCs保持干細胞干性，細胞在支架上大量生長。掃描電鏡可以清楚看到白色基質膠覆在PCL上，可以見到材料表面的細胞輪廓。對照組繼續培養6 d后，hiPSCs依舊高表達干細胞干性標志物OCT4，而不表達心肌標志物cTnT和α-actin，CDM3組采用分化培養基培養6 d后，hiPSCs心肌向分化，hiPSC-CM表達cTnT和α-actin，不再表達干性標志物OCT4，這初步表明hiPSCs心肌向分化。hiPSCs與覆有基質膠的PCL在基礎培養基中共培養7 d，在培養1 d、3 d、5 d、7 d采用CCK-8法測定OD值，繪制生長曲線發現hiPSCs在覆有基質膠的PCL上穩定增殖。本研究實驗結果證明 hiPSCs可以在覆有基質膠的PCL上生長增殖，在CDM3作用下，促進hiPSCs分化為心肌樣細胞，心肌補片初步制成。
本實驗結果證明了CDM3方案可以促進hiPSCs在PCL上心肌向分化并初步制備心肌補片，在接下來的研究中，將進一步通過體外定量實驗論證采用CDM3方案制備的心肌補片的心肌樣細胞分化效率及成熟度，以及通過體內動物實驗驗證CDM3方案獲得的心肌補片的安全性。未來如何進一步提高心肌補片成熟度，將制備好的心肌補片應用于臨床仍需要進一步研究和論證。
利益沖突：無。
作者貢獻：戴越實施研究，包括細胞培養、心肌補片制作等，撰寫文章；周帆進行免疫組化以及統計學分析等；鄭建偉進行電鏡標本制作及文章校對等；穆軍升總負責，設計課題，對文章進行審閱修改等；伯平收集、整理數據等；尤斌整理圖片及指導相關技術。
