引用本文： 閆子伊, 趙海波, 賀春岳, 劉溢思. miR-3187-5p與冠狀動脈旁路移植術后心房顫動關系的前瞻性隊列研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(7): 1038-1047. doi: 10.7507/1007-4848.202206018 復制
術后心房顫動（postoperative atrial fibrillation，POAF）指術前無心房顫動（atrial fibrillation，AF）發生，在術后新出現的AF[1]。POAF為冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）常見的并發癥之一，發生率為30%～40%[1-2]，多發生于術后 2～4 d，且7 d后幾乎不發生[3]。發生 POAF 的患者卒中和死亡風險分別為未發生 POAF 患者的5倍和2倍[4]。目前對于POAF的發生機制尚未完全研究清楚[5]，因此目前缺乏有效預防POAF的措施[6]。
近年來，研究[7]發現miRNA可能與POAF的發生有關。miRNA是長度15～23個核苷酸的單鏈非蛋白編碼核糖核酸，能與靶基因的3'端非翻譯區域（3'UTR）互補結合，通過抑制信使RNA（message RNA，mRNA）翻譯或促進 mRNA 降解來負性調節基因表達。近年來有研究[7]發現miRNA可以影響膠原代謝，調控成纖維細胞的增殖分化，進而在心臟結構重構和AF發生中起關鍵作用。雖然目前已有研究探討miRNA的表達與POAF的關系，但研究結論并不一致。Feldman等[8]發現與未發生POAF相比，POAF組患者血液中miR-1降低，但差異無統計學意義。Tsoporis等[9]則發現POAF組患者組織中miR-1顯著升高。此外，大多數研究是從血液樣本著手，反映的是全身病理生理變化，忽略了手術所致心臟局部環境的改變對POAF發生的影響。既往研究[10]及本團隊前期研究發現CABG術后心包引流液的改變可能在POAF的發生中起著更為關鍵的作用。
本研究團隊前期通過前瞻性隊列研究，收集并分析CABG術后發生POAF和未發生POAF患者的心包引流液，進行miRNA測序分析，發現miR-3187-5p的表達水平在POAF組和非POAF（non-POAF）組差異顯著（FC=1.35，P=0.0002）。基于此結果，我們認為miR-3187-5p可能與POAF的發生有關。miR-3187-3p被認為參與調控膠原代謝通路TGF-β和Wnt[11]，而纖維化所致心房結構重構被認為是POAF發生的易感基質[12]。既往研究中，關于miR-3187-5p的報道較少。Gao等[13]發現在心血管疾病患者血液中miR-3187-5p下調。關于miR-3187-5p與POAF的關系，既往文獻未見報道。因此，基于前期研究結果，本研究擬通過前瞻性隊列研究探討miR-3187-5p與POAF的關系，以期為POAF的發生機制探討提供新思路，并為臨床POAF的精準預測和預防提供研究基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本研究為前瞻性隊列研究。利用方便抽樣選取于2022年3—5月在北京朝陽醫院心臟中心行CABG手術的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）患者。冠心病的診斷標準：冠狀動脈造影檢查發現心外膜下冠狀動脈直徑狹窄＞50%，并且患者有典型性心絞痛癥狀或無創性檢查顯示有心肌缺血證據[14]。納入標準：年齡>18歲；行 CABG 術；無既往AF史，術前心電示波為竇性心律。排除標準：先天性心臟病史，心肌病；術前嚴重感染、電解質紊亂、嚴重的肝腎功能不全；術后住院期間死亡；合并有嚴重影響預后的疾病；標本采集及研究過程中拒絕配合。根據術后是否發生POAF，將患者分為 POAF 組和non-POAF組。
1.2 方法
1.2.1 儀器和設備
儀器和設備包括：PCR擴增儀（日本TakaRa公司），7500 Real-Time PCR System （美國 ABI 公司），超凈工作臺（中國蘇凈集團），低溫高速離心機（德國 Eppendorf 公司），渦旋振蕩器（美國 Scientific Industries 公司），10 μL、200 μL、1 000 μL單道手動移液器（德國 Transferpette 公司），無線心電監護（上海微創公司）。
1.2.2 樣本收集及處理
（1）收集及處理血樣：當患者從手術室返回ICU即刻，研究者通過患者置入的動脈導管抽取動脈血樣。收集方法：用 10 mL 無菌注射器采集動脈血10 mL，置于EDTA抗凝管中。處理方法：在室溫下放置30 min后，4℃，3 000 r/min離心15 min，取上清液，在?80℃冰箱中保存。
（2）收集及處理引流液樣本：當患者從手術室返回ICU即刻，研究者在嚴格無菌操作下采集心包引流液樣本（患者均術中留置心包縱隔引流管，連接引流瓶）。采集方法：用安爾碘消毒引流瓶的瓶口及瓶頸，打開EDTA抗凝管蓋，將引流液從瓶口注入抗凝管。處理方法同上。
1.2.3 miR-3187-5p的測定
采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法檢測外周血和引流液中miR-3187-5p的含量，所用試劑盒為TB Green? Advantage? qPCR Premix（TaKaRa，日本），所用引物（北京諾賽基因組研究中心有限公司）序列（Forward）為5'-CCTGGGCAGCGTGTGGCTGAAGG-3'。
1.2.4 POAF的監測
患者術后采用24 h動態心電監護儀和無線心電監護進行心電監測。研究人員每日上午10點到心外科ICU查看動態心電圖監測中過去24 h的心電圖，術后5 d摘取無線心電圖監測記錄，同時結合護理記錄和病歷確定是否發生 POAF。有10年以上AF診斷經驗的2名醫務人員根據24 h心電圖記錄判定是否發生POAF。如果有分歧，與第3位上級醫生聯合進行重新評估。
1.2.5 miR-3187-5p靶基因預測及生物信息學分析
為了降低miR-3187-5p靶基因預測結果的假陽性，采用Targetscan（http://www.targetscan.org/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）和miRDB（http://www.mirdb.org）3個在線軟件預測miR-3187-5p的靶基因，用軟件Veney（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/Venny/index.html）繪制韋恩圖，得到3個數據庫預測結果的交集，然后集合miRTarbase數據庫（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/）中經試驗驗證的靶基因組成下一步分析的基因集合。將預測到的靶基因利用 STRING數據庫（https://>string-db.org/）構建miRNA潛在靶點蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖，采用 Cytoscape 3.9.1 軟件進行可視化分析。利用軟件 R 4.2.0、KEGG數據庫進行預測靶基因的GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析（http://www.genome.jp/KEGG/）。R包：主要為clusterProfiler 包（3.14.3版本，用于分析數據）。
1.3 資料收集
采用自行設計的資料收集表收集可能與 POAF 發生相關的資料，包括入組患者的術前、術中及術后3個時間段資料。具體觀察內容如下：（1）基本資料：姓名、性別、年齡、身高、體重、體重指數（body mass index，BMI）、吸煙史、本次入院診斷。（2）臨床資料：疾病史，包括心臟病史、高血壓病史、糖尿病史、高血脂癥病史、腦血管病史、慢性阻塞性肺病病史、腎病史；紐約心臟協會（New York Heart Association，NYHA）心功能分級；心臟手術史；用藥史；冠狀動脈病變情況；超聲心動圖表現，包括左右心房上下徑及左右徑、左室舒張末期內徑、左室收縮末期內徑、左室射血分數、舒張早期與舒張晚期心室充盈速度最大值之比；手術情況，包括手術時間、術式、冠狀動脈血管搭橋支數、受體血管、術中出血量、術中輸血量、術中除顫情況、主動脈內球囊反搏使用情況；術后情況，包括術后用藥、術后機械輔助通氣時間。（3）血化驗監測結果：白細胞計數、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、血肌酐、血尿酸、血尿素、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，CTNI）、腦利鈉肽、同型半胱氨酸、超敏C-反應蛋白、糖化血紅蛋白。（4）術后0～6 h、6～24 h、24～48 h心包引流量。
1.4 觀察指標
（1）術后0 h外周血和心包引流液中miR-3187-5p水平：術后0 h定義為患者從手術室返回ICU的即刻。（2）POAF 結局：患者是否發生POAF、POAF 首發時間、終止方式。POAF 的診斷標準為心電圖表現為標準 12 導聯心電圖記錄≥30 s或單導聯心電圖示 AF 心律，無明顯重復的P 波和RR間期不規則（房室傳導未受損時）可診斷為臨床AF[15]。（3）臨床結局：是否發生心肌梗死、卒中、術后感染、急性腎功能損害、死亡、二次開胸、譫妄。
1.5 統計學分析
所有數據使用 SPSS 26.0 統計分析軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料采用均數±標準差（
±s）描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗。非正態分布的計量資料采用中位數（上下四分位數）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料采用頻數描述，組間比較采用Fisher確切概率法。單因素分析中P≤0.05的變量及有臨床意義的變量納入 logistic 回歸分析。P≤0.05為差異有統計學意義。
1.6 倫理審查
本研究已通過首都醫科大學醫學倫理委員會審查（2022sy067）。研究按照世界衛生組織《赫爾辛基宣言》制定的道德標準，所有入選患者在研究前均對研究知情同意，告知術后需采用24 h動態心電檢查持續監測，并采集血樣及心包引流液標本用于研究。同時，本研究對所有研究中的臨床資料堅持嚴格保密原則。
2 結果
2.1 患者一般臨床特征
本研究共納入15例患者，其中男9例、女6例，平均年齡（65.6±8.2）歲，其中6例術后出現AF，9例未出現AF，POAF的發生率為40.0%。POAF首發時間為術后2.7～82.5（37.5±32.2）h。兩組患者一般資料分析發現，POAF組患者三尖瓣輕度反流比例顯著高于non-POAF組（P=0.041）。兩組其余基線資料差異均無統計學意義；見表1。
表1
兩組患者的一般臨床資料比較［例（%）/
/M（P25，P75）］
2.2 手術相關資料
POAF組手術時間、術后1 d的CK-MB和CTNI、術后0～6 h和24～48 h心包引流液量高于non-POAF組，差異有統計學意義（P>0.05）。本研究中，無患者發生術后心肌梗死、卒中、術后感染、急性腎功能損害、死亡、二次開胸。兩組患者術中及術后資料見表2。
表2
兩組患者手術相關資料比較［例（%）/
/M（P25，P75）］
2.3 術后miR-3187-5p與POAF的關系
本研究檢測了術后0 h外周血液及心包引流液中miR-3187-5p水平，結果發現，POAF組心包引流液中miR-3187-5p水平顯著高于non-POAF組（P=0.012），而在外周血中二者差異無統計學意義（P=0.797）；見圖1。
圖1
miR-3187-5p的相對表達量
a：血液中miR-3187-5p的相對表達量；b：引流液中miR-3187-5p的相對表達量
2.4 miR-3187-5p對POAF的潛在預測價值
篩選單因素分析中P≤0.05及有臨床意義的變量進行logistic回歸。P≤0.05的變量包括三尖瓣反流、手術時間、術后1 d CK-MB和CTNI，術后0～6 h和24～48 h引流液量、術后0 h心包引流液中miR-3187-5p水平。但由于術后0～6 h引流液量與術后24～48 h引流液量具有強相關性，二者只能選擇其一進入方程。本研究選擇與POAF相關性更強的術后24～48 h引流液量進入二元logistic回歸分析。此外，考慮到臨床實際應用意義，對于術后0 h心包引流液miR-3187-5p以及術后24～48 h引流液量，我們采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線確定其最佳截斷值，將兩個連續變量轉化為分類變量進入多元回歸（ROC結果：術后24～48 h引流液量≥260 mL，miR-3187-5p相對表達量≥2.11為最佳臨界值）。基于以上考慮，最終進入多元回歸的變量為分類變量：三尖瓣反流、術后24～48 h引流液量≥260 mL、miR-3187-5p相對表達量≥2.11，以及連續變量：手術時間、術后1 d CK-MB和CTNI。結果顯示，miR-3187-5p相對表達量≥2.11是CABG術POAF的獨立預測因子。單因素以及多因素logistic回歸結果見表3。該預測模型的Cox & Snell R2=0.433，Nagel kerke R2=0.585，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.861，特異度、靈敏度分別為88.9%、83.3%；見圖2。
圖2
POAF 預測模型的ROC曲線
POAF：術后心房顫動；ROC：受試者工作特征
表3
術后0 h心包引流液中miR-3187-5p預測POAF的logistic回歸分析
2.5 miR-3187-5p靶基因預測及與心肌膠原代謝相關的生物信息學分析
2.5.1 miR-3187-5p的靶基因預測
利用 Targetscan、miRWalk和miRDB軟件分別預測到1204、17111和811個miR-3187-5p的靶基因，取3者的交集，獲得201個共有靶基因。miRTarbase數據庫中經試驗驗證的靶基因有1519個，合并后共得到1642個基因集合用于后續富集分析。
2.5.2 PPI網絡
將預測到的miR-3187-5p的1642個靶基因導入STRING數據庫平臺，選擇物種為人類，獲取PPI關系，采用Cytoscape 3.9.1 軟件進行可視化分析。利用 Cytohubba 插件計算PPI網絡中每個基因的節點度（Degree），其中顏色越深對應的Degree值越大（由于基因數眾多，選擇Degree值前150的基因作圖）。Degree值排名前10位的基因分別為MRTO4、WDR43、IMP4、NAT10、DIEXF、RRP12、GNL3L、KCTD19、RBM19、HEATR1，其中大多與細胞增殖相關；見圖3。
圖3
miR-3187-5p Degree值前150靶基因的蛋白質相互作用網絡
2.5.3 GO功能和KEGG 信號通路富集分析
針對1642個miR-3187-5p靶基因進行GO功能富集分析，發現靶基因在細胞組分方面富集于β-連環蛋白TCF復合物；在分子功能方面富集于β連環蛋白結合、MAP激酶支架活性；在生物學過程方面富集于Ras蛋白信號傳導、MAPK級聯調節、JAK-STAT級聯的負調控、SMAD蛋白信號傳導（P值均＜0.05）；見圖4a。進一步進行KEGG信號通路富集分析發現靶基因在多個與心肌膠原代謝相關的信號通路如MAPK、Wnt、TGF-β、JAK/STAT信號通路中富集（P值均＜0.05）；見圖4b。
圖4
生物信息學分析結果
a：miR-3187-5p預測靶基因的 GO功能富集分析結果；b：KEGG信號通路富集分析結果；c：在心肌膠原代謝通路中的調控網絡，圖中紅色方塊為TGF-β信號通路中抑制分子，黃色方塊為MAPK信號通路抑制分子，綠色方塊為Wnt信號通路抑制分子，白色方塊為其他靶基因
另外，將基因歸類發現，在GO功能分析及KEGG信號通路富集分析中，miR-3187-5p能夠調控TGF-β信號通路上的關鍵抑制型分子SMAD6、TGIF2、FMOD、NBL1、ACVR2A；MAPK信號通路上的關鍵抑制型分子AKT2、PTPN5；以及Wnt信號通路上的關鍵抑制型分子CtBP1、Rspo3、Rspo4、CTNNBIP1、SFRP1；見圖4c。
3 討論
本研究首次對miR-3187-5p與CABG術后POAF的關系進行了初步探討，發現POAF組患者術后0 h心包引流液中miR-3187-5p水平顯著高于non-POAF組，驗證了前期miRNA測序結果。miR-3187-5p可能通過調控TGF-β、MAPK、Wnt信號通路調節術后心房膠原代謝，進而參與POAF的發生。
POAF是CABG術后常見的心律失常并發癥，既往文獻[1-2]報道發生率為30%～40%，本研究中POAF發生率也為40%。本研究收集了來自外周血和心包引流液不同來源的樣本，較為全面地分析了CABG術后0 h miR-3187-5p 的空間分布規律及其與POAF發生的關系；并通過生物信息學分析，初步探討了miR-3187-5p參與POAF發生的可能機制。本研究作為大型前瞻性研究的前期初步探索，為后期臨床研究的開展提供了基礎和方向。
本研究首次發現POAF組患者術后0 h的心包引流液中miR-3187-5p水平顯著高于non-POAF組。在進一步控制混雜因素后，心包引流液中的miR-3187-5p在本研究只有15例樣本的情況下，仍然呈現很強的預測性，單個因子對于POAF的預測能力高達86.1%。既往研究[13,16]發現在心血管疾病患者和非小細胞肺癌患者血液中miR-3187-5p下調；miR-3187-3p則在非小細胞肺癌患者血液中上調[17]，在增生性瘢痕成纖維細胞中下調[18]。然而目前關于心包引流液中miR-3187-5p水平及其與POAF的關系，既往研究尚無報道。
本研究發現相對于心包引流液，兩組間血液中的miR-3187-5p水平相差不大。一方面，可能與本研究樣本量少，檢測效能較低有關。另一方面也說明，相對于手術后全身系統性的病理生理變化，心臟局部的病理生理變化可能更能反映POAF的發生機制。心包引流液主要是手術后心臟和胸腔滲血或滲液及淋巴液，其主要反映了手術后心臟局部的病理生理變化[19]。所以心包引流液中的因子水平相對于血液中因子的水平更能代表心臟局部的變化，從而更能反映心房在遭受了手術創傷后所發生的變化。本研究在小樣本的情況下，發現了心包引流液中，而非外周血液中的miR-3187-5p對POAF的影響，進一步說明了手術帶來的心房局部病理生理變化是POAF發生的重要觸發機制。
目前對于miR-3187-5p研究較少，對于其上游通路相關文獻未見報道。本研究采用TransmiR v2.0，對miR-3187-5p上游的轉錄因子進行預測，發現ERG、EZH2、KDM2B、LARP7等轉錄因子調控miR-3187-5p的表達，但此發現需要進一步通過雙熒光素酶檢測等方法進行實驗驗證。關于miR-3187-5p的下游通路，本研究采用生物信息學分析發現，miR-3187-5p可能通過調控TGF-β、Wnt及MAPK等信號通路上的關鍵分子進而調控CABG術后早期膠原代謝，參與POAF的發生。
TGF-β是纖維化形成的重要因素之一，而SMAD信號轉導通路是TGF-β發揮重要作用的主要支路[20]。通過生物信息學分析發現miR-3187-5p負調控TGF-β通路的抑制型轉錄調控因子SMAD6[20]、ACVR2A、FMOD、TGIF2和NBL1。miR-3187-5p通過負調控作用，削弱抑制因子對TGF-β信號通路的抑制作用，進而促使術后早期心肌膠原合成增加。
在MAPK信號通路中，ERK1/2 是 MAPK 家族的關鍵激酶之一，活化的 ERK1/2 可使一系列轉錄因子磷酸化以調控相關肥大基因的表達，從而促進心肌肥厚，其主要通過Ras-RAF-MEK-ERK 級聯激活發揮作用[20]。miR-3187-5p在Ras-RAF-MEK-ERK中，負調控抑制型分子PTPN5、AKT2，促使ERK表達，從而促膠原代謝失衡。
Wnt 信號通路的激活是纖維化疾病的共同特征，β聯蛋白在細胞中持續積累通過 Wnt 信號通路激活成纖維細胞，促進成纖維細胞增殖以及膠原纖維的分泌[21]。miR-3187-5p則在Wnt信號通路中負調控抑制型因子SFRP1、CtBP1、Rspo3、Rspo4、CTNNBIP1，抑制其阻礙Wnt被激活后信號傳導的作用，進一步使β聯蛋白持續累積，促使纖維細胞增殖和膠原纖維分泌。
此外，我們進一步構建了 miR-3187-5p 靶基因所編碼蛋白質之間的相互作用網絡，發現節點度排名前10位的基因中NAT10、RRP12、GNL3L、RBM19、HEATR1曾被報道參與細胞增殖的過程[22-26]。以NAT10為例，余程[22]的研究發現在利用頸動脈球囊損傷構建血管新生內膜形成的SD大鼠模型中敲除NAT10后，可抑制細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡。miR-3187-5p 可能在手術帶來的血管損傷觸發的損傷-修復反應中負調控NAT10，進而促進心房局部成纖維細胞增加，促進膠原合成增加。
再者，本研究單因素分析結果顯示相對于non-POAF組，POAF組三尖瓣反流患者比例更大、術后1 d CK-MB和CTNI值更高、術后0～6 h和24～48 h心包引流液量更多、手術時間更長，但由于本研究樣本量較少，因此這些因素在回歸方程中未能進入模型，但是可供今后大樣本臨床研究篩選危險因素時作為參考。三尖瓣反流與右心房結構改變相關，而心房重構是AF的關鍵病理基礎[27]。術后CK-MB和CTNI值高表示心肌損傷程度大，直接反映了手術對心臟損傷的程度，而術中心肌再灌注損傷與POAF發生有關[28]。術后心包引流液量多的患者更易發生POAF這一結論也與本研究團隊前期工作結論相符[29]，引流量的增加可能由手術時間長、心臟應激性增加、術后液體不平衡所致，亦可反映手術損傷程度。心肌受損程度曾被報道與POAF的發生有關[30]。CABG手術時間與POAF發生的關系尚未有明確報道，推測其可能為主動脈交叉夾鉗時間延長所致，而這一因素是較為明確的可能增加POAF發生率的因素[31]。
本研究存在幾點局限性。一是未檢測基線血液中miR-3187-5p水平，因此不能排除基線差異對于結果的影響，將在未來研究中進行彌補。二是，本研究對miR-3187-5p的信號通路進行了生物信息學分析與預測，發現其通過調控TGF-β等通路參與POAF的發生，尚未開展動物實驗對通路進行驗證，但本研究結果可對后期的通路研究提供方向與基礎。三是，本研究發現miR-3187-5p與POAF發生有關。但POAF發生機制復雜，已被證實與炎癥反應、纖維化相關。因此，關于miR-3187-5p是否是POAF發生的關鍵分子，需要進一步開展細胞和動物實驗，通過敲減或過表達miR-3187-5p，觀察其對POAF發生情況的影響。四是，由于疫情管控原因，研究期間納入患者較少，造成心房大小、三尖瓣反流、術后心功酶等可能對AF有影響的因素未能納入模型。最終僅1個因素“術后0 h心包引流液miR-3187-5p水平≥2.11”具有預測價值。此結果一方面與樣本量小有關，另一方面也反映了miR-3187-5p水平的強大預測能力。再者，本研究樣本來自于同一家醫院，影響研究結果的外推性，但本研究結果可為今后大樣本、多中心研究提供研究方向。
本研究首次對CABG術后患者血液和心包引流液中的miR-3187-5p與POAF的關系進行了初步探索，并發現術后0 h心包引流液中的miR-3187-5p是一種潛在的、新型的、無創的POAF預測因子，其可能通過調控TGF-β、MAPK、Wnt信號通路進而促使CABG術后早期膠原代謝失衡，心房中膠原沉積增加，進而促使術后早期結構重構，導致POAF的發生。研究結果為POAF的發生機制探討提供了新思路，并為臨床POAF的精準預測和預防提供了研究基礎。
利益沖突：無。
作者貢獻：閆子伊負責數據收集與分析，論文撰寫；趙海波、賀春岳負責數據收集與分析；劉溢思負責研究構思與設計，數據收集與分析，論文撰寫與修訂。
術后心房顫動（postoperative atrial fibrillation，POAF）指術前無心房顫動（atrial fibrillation，AF）發生，在術后新出現的AF[1]。POAF為冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）常見的并發癥之一，發生率為30%～40%[1-2]，多發生于術后 2～4 d，且7 d后幾乎不發生[3]。發生 POAF 的患者卒中和死亡風險分別為未發生 POAF 患者的5倍和2倍[4]。目前對于POAF的發生機制尚未完全研究清楚[5]，因此目前缺乏有效預防POAF的措施[6]。
近年來，研究[7]發現miRNA可能與POAF的發生有關。miRNA是長度15～23個核苷酸的單鏈非蛋白編碼核糖核酸，能與靶基因的3'端非翻譯區域（3'UTR）互補結合，通過抑制信使RNA（message RNA，mRNA）翻譯或促進 mRNA 降解來負性調節基因表達。近年來有研究[7]發現miRNA可以影響膠原代謝，調控成纖維細胞的增殖分化，進而在心臟結構重構和AF發生中起關鍵作用。雖然目前已有研究探討miRNA的表達與POAF的關系，但研究結論并不一致。Feldman等[8]發現與未發生POAF相比，POAF組患者血液中miR-1降低，但差異無統計學意義。Tsoporis等[9]則發現POAF組患者組織中miR-1顯著升高。此外，大多數研究是從血液樣本著手，反映的是全身病理生理變化，忽略了手術所致心臟局部環境的改變對POAF發生的影響。既往研究[10]及本團隊前期研究發現CABG術后心包引流液的改變可能在POAF的發生中起著更為關鍵的作用。
本研究團隊前期通過前瞻性隊列研究，收集并分析CABG術后發生POAF和未發生POAF患者的心包引流液，進行miRNA測序分析，發現miR-3187-5p的表達水平在POAF組和非POAF（non-POAF）組差異顯著（FC=1.35，P=0.0002）。基于此結果，我們認為miR-3187-5p可能與POAF的發生有關。miR-3187-3p被認為參與調控膠原代謝通路TGF-β和Wnt[11]，而纖維化所致心房結構重構被認為是POAF發生的易感基質[12]。既往研究中，關于miR-3187-5p的報道較少。Gao等[13]發現在心血管疾病患者血液中miR-3187-5p下調。關于miR-3187-5p與POAF的關系，既往文獻未見報道。因此，基于前期研究結果，本研究擬通過前瞻性隊列研究探討miR-3187-5p與POAF的關系，以期為POAF的發生機制探討提供新思路，并為臨床POAF的精準預測和預防提供研究基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本研究為前瞻性隊列研究。利用方便抽樣選取于2022年3—5月在北京朝陽醫院心臟中心行CABG手術的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）患者。冠心病的診斷標準：冠狀動脈造影檢查發現心外膜下冠狀動脈直徑狹窄＞50%，并且患者有典型性心絞痛癥狀或無創性檢查顯示有心肌缺血證據[14]。納入標準：年齡>18歲；行 CABG 術；無既往AF史，術前心電示波為竇性心律。排除標準：先天性心臟病史，心肌病；術前嚴重感染、電解質紊亂、嚴重的肝腎功能不全；術后住院期間死亡；合并有嚴重影響預后的疾病；標本采集及研究過程中拒絕配合。根據術后是否發生POAF，將患者分為 POAF 組和non-POAF組。
1.2 方法
1.2.1 儀器和設備
儀器和設備包括：PCR擴增儀（日本TakaRa公司），7500 Real-Time PCR System （美國 ABI 公司），超凈工作臺（中國蘇凈集團），低溫高速離心機（德國 Eppendorf 公司），渦旋振蕩器（美國 Scientific Industries 公司），10 μL、200 μL、1 000 μL單道手動移液器（德國 Transferpette 公司），無線心電監護（上海微創公司）。
1.2.2 樣本收集及處理
（1）收集及處理血樣：當患者從手術室返回ICU即刻，研究者通過患者置入的動脈導管抽取動脈血樣。收集方法：用 10 mL 無菌注射器采集動脈血10 mL，置于EDTA抗凝管中。處理方法：在室溫下放置30 min后，4℃，3 000 r/min離心15 min，取上清液，在?80℃冰箱中保存。
（2）收集及處理引流液樣本：當患者從手術室返回ICU即刻，研究者在嚴格無菌操作下采集心包引流液樣本（患者均術中留置心包縱隔引流管，連接引流瓶）。采集方法：用安爾碘消毒引流瓶的瓶口及瓶頸，打開EDTA抗凝管蓋，將引流液從瓶口注入抗凝管。處理方法同上。
1.2.3 miR-3187-5p的測定
采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法檢測外周血和引流液中miR-3187-5p的含量，所用試劑盒為TB Green? Advantage? qPCR Premix（TaKaRa，日本），所用引物（北京諾賽基因組研究中心有限公司）序列（Forward）為5'-CCTGGGCAGCGTGTGGCTGAAGG-3'。
1.2.4 POAF的監測
患者術后采用24 h動態心電監護儀和無線心電監護進行心電監測。研究人員每日上午10點到心外科ICU查看動態心電圖監測中過去24 h的心電圖，術后5 d摘取無線心電圖監測記錄，同時結合護理記錄和病歷確定是否發生 POAF。有10年以上AF診斷經驗的2名醫務人員根據24 h心電圖記錄判定是否發生POAF。如果有分歧，與第3位上級醫生聯合進行重新評估。
1.2.5 miR-3187-5p靶基因預測及生物信息學分析
為了降低miR-3187-5p靶基因預測結果的假陽性，采用Targetscan（http://www.targetscan.org/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）和miRDB（http://www.mirdb.org）3個在線軟件預測miR-3187-5p的靶基因，用軟件Veney（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/Venny/index.html）繪制韋恩圖，得到3個數據庫預測結果的交集，然后集合miRTarbase數據庫（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/）中經試驗驗證的靶基因組成下一步分析的基因集合。將預測到的靶基因利用 STRING數據庫（https://>string-db.org/）構建miRNA潛在靶點蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖，采用 Cytoscape 3.9.1 軟件進行可視化分析。利用軟件 R 4.2.0、KEGG數據庫進行預測靶基因的GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析（http://www.genome.jp/KEGG/）。R包：主要為clusterProfiler 包（3.14.3版本，用于分析數據）。
1.3 資料收集
采用自行設計的資料收集表收集可能與 POAF 發生相關的資料，包括入組患者的術前、術中及術后3個時間段資料。具體觀察內容如下：（1）基本資料：姓名、性別、年齡、身高、體重、體重指數（body mass index，BMI）、吸煙史、本次入院診斷。（2）臨床資料：疾病史，包括心臟病史、高血壓病史、糖尿病史、高血脂癥病史、腦血管病史、慢性阻塞性肺病病史、腎病史；紐約心臟協會（New York Heart Association，NYHA）心功能分級；心臟手術史；用藥史；冠狀動脈病變情況；超聲心動圖表現，包括左右心房上下徑及左右徑、左室舒張末期內徑、左室收縮末期內徑、左室射血分數、舒張早期與舒張晚期心室充盈速度最大值之比；手術情況，包括手術時間、術式、冠狀動脈血管搭橋支數、受體血管、術中出血量、術中輸血量、術中除顫情況、主動脈內球囊反搏使用情況；術后情況，包括術后用藥、術后機械輔助通氣時間。（3）血化驗監測結果：白細胞計數、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、血肌酐、血尿酸、血尿素、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，CTNI）、腦利鈉肽、同型半胱氨酸、超敏C-反應蛋白、糖化血紅蛋白。（4）術后0～6 h、6～24 h、24～48 h心包引流量。
1.4 觀察指標
（1）術后0 h外周血和心包引流液中miR-3187-5p水平：術后0 h定義為患者從手術室返回ICU的即刻。（2）POAF 結局：患者是否發生POAF、POAF 首發時間、終止方式。POAF 的診斷標準為心電圖表現為標準 12 導聯心電圖記錄≥30 s或單導聯心電圖示 AF 心律，無明顯重復的P 波和RR間期不規則（房室傳導未受損時）可診斷為臨床AF[15]。（3）臨床結局：是否發生心肌梗死、卒中、術后感染、急性腎功能損害、死亡、二次開胸、譫妄。
1.5 統計學分析
所有數據使用 SPSS 26.0 統計分析軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗。非正態分布的計量資料采用中位數（上下四分位數）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料采用頻數描述，組間比較采用Fisher確切概率法。單因素分析中P≤0.05的變量及有臨床意義的變量納入 logistic 回歸分析。P≤0.05為差異有統計學意義。
1.6 倫理審查
本研究已通過首都醫科大學醫學倫理委員會審查（2022sy067）。研究按照世界衛生組織《赫爾辛基宣言》制定的道德標準，所有入選患者在研究前均對研究知情同意，告知術后需采用24 h動態心電檢查持續監測，并采集血樣及心包引流液標本用于研究。同時，本研究對所有研究中的臨床資料堅持嚴格保密原則。
2 結果
2.1 患者一般臨床特征
本研究共納入15例患者，其中男9例、女6例，平均年齡（65.6±8.2）歲，其中6例術后出現AF，9例未出現AF，POAF的發生率為40.0%。POAF首發時間為術后2.7～82.5（37.5±32.2）h。兩組患者一般資料分析發現，POAF組患者三尖瓣輕度反流比例顯著高于non-POAF組（P=0.041）。兩組其余基線資料差異均無統計學意義；見表1。
表1
兩組患者的一般臨床資料比較［例（%）//M（P25，P75）］
2.2 手術相關資料
POAF組手術時間、術后1 d的CK-MB和CTNI、術后0～6 h和24～48 h心包引流液量高于non-POAF組，差異有統計學意義（P>0.05）。本研究中，無患者發生術后心肌梗死、卒中、術后感染、急性腎功能損害、死亡、二次開胸。兩組患者術中及術后資料見表2。
表2
兩組患者手術相關資料比較［例（%）//M（P25，P75）］
2.3 術后miR-3187-5p與POAF的關系
本研究檢測了術后0 h外周血液及心包引流液中miR-3187-5p水平，結果發現，POAF組心包引流液中miR-3187-5p水平顯著高于non-POAF組（P=0.012），而在外周血中二者差異無統計學意義（P=0.797）；見圖1。
圖1
miR-3187-5p的相對表達量
a：血液中miR-3187-5p的相對表達量；b：引流液中miR-3187-5p的相對表達量
2.4 miR-3187-5p對POAF的潛在預測價值
篩選單因素分析中P≤0.05及有臨床意義的變量進行logistic回歸。P≤0.05的變量包括三尖瓣反流、手術時間、術后1 d CK-MB和CTNI，術后0～6 h和24～48 h引流液量、術后0 h心包引流液中miR-3187-5p水平。但由于術后0～6 h引流液量與術后24～48 h引流液量具有強相關性，二者只能選擇其一進入方程。本研究選擇與POAF相關性更強的術后24～48 h引流液量進入二元logistic回歸分析。此外，考慮到臨床實際應用意義，對于術后0 h心包引流液miR-3187-5p以及術后24～48 h引流液量，我們采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線確定其最佳截斷值，將兩個連續變量轉化為分類變量進入多元回歸（ROC結果：術后24～48 h引流液量≥260 mL，miR-3187-5p相對表達量≥2.11為最佳臨界值）。基于以上考慮，最終進入多元回歸的變量為分類變量：三尖瓣反流、術后24～48 h引流液量≥260 mL、miR-3187-5p相對表達量≥2.11，以及連續變量：手術時間、術后1 d CK-MB和CTNI。結果顯示，miR-3187-5p相對表達量≥2.11是CABG術POAF的獨立預測因子。單因素以及多因素logistic回歸結果見表3。該預測模型的Cox & Snell R2=0.433，Nagel kerke R2=0.585，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.861，特異度、靈敏度分別為88.9%、83.3%；見圖2。
圖2
POAF 預測模型的ROC曲線
POAF：術后心房顫動；ROC：受試者工作特征
表3
術后0 h心包引流液中miR-3187-5p預測POAF的logistic回歸分析
2.5 miR-3187-5p靶基因預測及與心肌膠原代謝相關的生物信息學分析
2.5.1 miR-3187-5p的靶基因預測
利用 Targetscan、miRWalk和miRDB軟件分別預測到1204、17111和811個miR-3187-5p的靶基因，取3者的交集，獲得201個共有靶基因。miRTarbase數據庫中經試驗驗證的靶基因有1519個，合并后共得到1642個基因集合用于后續富集分析。
2.5.2 PPI網絡
將預測到的miR-3187-5p的1642個靶基因導入STRING數據庫平臺，選擇物種為人類，獲取PPI關系，采用Cytoscape 3.9.1 軟件進行可視化分析。利用 Cytohubba 插件計算PPI網絡中每個基因的節點度（Degree），其中顏色越深對應的Degree值越大（由于基因數眾多，選擇Degree值前150的基因作圖）。Degree值排名前10位的基因分別為MRTO4、WDR43、IMP4、NAT10、DIEXF、RRP12、GNL3L、KCTD19、RBM19、HEATR1，其中大多與細胞增殖相關；見圖3。
圖3
miR-3187-5p Degree值前150靶基因的蛋白質相互作用網絡
2.5.3 GO功能和KEGG 信號通路富集分析
針對1642個miR-3187-5p靶基因進行GO功能富集分析，發現靶基因在細胞組分方面富集于β-連環蛋白TCF復合物；在分子功能方面富集于β連環蛋白結合、MAP激酶支架活性；在生物學過程方面富集于Ras蛋白信號傳導、MAPK級聯調節、JAK-STAT級聯的負調控、SMAD蛋白信號傳導（P值均＜0.05）；見圖4a。進一步進行KEGG信號通路富集分析發現靶基因在多個與心肌膠原代謝相關的信號通路如MAPK、Wnt、TGF-β、JAK/STAT信號通路中富集（P值均＜0.05）；見圖4b。
圖4
生物信息學分析結果
a：miR-3187-5p預測靶基因的 GO功能富集分析結果；b：KEGG信號通路富集分析結果；c：在心肌膠原代謝通路中的調控網絡，圖中紅色方塊為TGF-β信號通路中抑制分子，黃色方塊為MAPK信號通路抑制分子，綠色方塊為Wnt信號通路抑制分子，白色方塊為其他靶基因
另外，將基因歸類發現，在GO功能分析及KEGG信號通路富集分析中，miR-3187-5p能夠調控TGF-β信號通路上的關鍵抑制型分子SMAD6、TGIF2、FMOD、NBL1、ACVR2A；MAPK信號通路上的關鍵抑制型分子AKT2、PTPN5；以及Wnt信號通路上的關鍵抑制型分子CtBP1、Rspo3、Rspo4、CTNNBIP1、SFRP1；見圖4c。
3 討論
本研究首次對miR-3187-5p與CABG術后POAF的關系進行了初步探討，發現POAF組患者術后0 h心包引流液中miR-3187-5p水平顯著高于non-POAF組，驗證了前期miRNA測序結果。miR-3187-5p可能通過調控TGF-β、MAPK、Wnt信號通路調節術后心房膠原代謝，進而參與POAF的發生。
POAF是CABG術后常見的心律失常并發癥，既往文獻[1-2]報道發生率為30%～40%，本研究中POAF發生率也為40%。本研究收集了來自外周血和心包引流液不同來源的樣本，較為全面地分析了CABG術后0 h miR-3187-5p 的空間分布規律及其與POAF發生的關系；并通過生物信息學分析，初步探討了miR-3187-5p參與POAF發生的可能機制。本研究作為大型前瞻性研究的前期初步探索，為后期臨床研究的開展提供了基礎和方向。
本研究首次發現POAF組患者術后0 h的心包引流液中miR-3187-5p水平顯著高于non-POAF組。在進一步控制混雜因素后，心包引流液中的miR-3187-5p在本研究只有15例樣本的情況下，仍然呈現很強的預測性，單個因子對于POAF的預測能力高達86.1%。既往研究[13,16]發現在心血管疾病患者和非小細胞肺癌患者血液中miR-3187-5p下調；miR-3187-3p則在非小細胞肺癌患者血液中上調[17]，在增生性瘢痕成纖維細胞中下調[18]。然而目前關于心包引流液中miR-3187-5p水平及其與POAF的關系，既往研究尚無報道。
本研究發現相對于心包引流液，兩組間血液中的miR-3187-5p水平相差不大。一方面，可能與本研究樣本量少，檢測效能較低有關。另一方面也說明，相對于手術后全身系統性的病理生理變化，心臟局部的病理生理變化可能更能反映POAF的發生機制。心包引流液主要是手術后心臟和胸腔滲血或滲液及淋巴液，其主要反映了手術后心臟局部的病理生理變化[19]。所以心包引流液中的因子水平相對于血液中因子的水平更能代表心臟局部的變化，從而更能反映心房在遭受了手術創傷后所發生的變化。本研究在小樣本的情況下，發現了心包引流液中，而非外周血液中的miR-3187-5p對POAF的影響，進一步說明了手術帶來的心房局部病理生理變化是POAF發生的重要觸發機制。
目前對于miR-3187-5p研究較少，對于其上游通路相關文獻未見報道。本研究采用TransmiR v2.0，對miR-3187-5p上游的轉錄因子進行預測，發現ERG、EZH2、KDM2B、LARP7等轉錄因子調控miR-3187-5p的表達，但此發現需要進一步通過雙熒光素酶檢測等方法進行實驗驗證。關于miR-3187-5p的下游通路，本研究采用生物信息學分析發現，miR-3187-5p可能通過調控TGF-β、Wnt及MAPK等信號通路上的關鍵分子進而調控CABG術后早期膠原代謝，參與POAF的發生。
TGF-β是纖維化形成的重要因素之一，而SMAD信號轉導通路是TGF-β發揮重要作用的主要支路[20]。通過生物信息學分析發現miR-3187-5p負調控TGF-β通路的抑制型轉錄調控因子SMAD6[20]、ACVR2A、FMOD、TGIF2和NBL1。miR-3187-5p通過負調控作用，削弱抑制因子對TGF-β信號通路的抑制作用，進而促使術后早期心肌膠原合成增加。
在MAPK信號通路中，ERK1/2 是 MAPK 家族的關鍵激酶之一，活化的 ERK1/2 可使一系列轉錄因子磷酸化以調控相關肥大基因的表達，從而促進心肌肥厚，其主要通過Ras-RAF-MEK-ERK 級聯激活發揮作用[20]。miR-3187-5p在Ras-RAF-MEK-ERK中，負調控抑制型分子PTPN5、AKT2，促使ERK表達，從而促膠原代謝失衡。
Wnt 信號通路的激活是纖維化疾病的共同特征，β聯蛋白在細胞中持續積累通過 Wnt 信號通路激活成纖維細胞，促進成纖維細胞增殖以及膠原纖維的分泌[21]。miR-3187-5p則在Wnt信號通路中負調控抑制型因子SFRP1、CtBP1、Rspo3、Rspo4、CTNNBIP1，抑制其阻礙Wnt被激活后信號傳導的作用，進一步使β聯蛋白持續累積，促使纖維細胞增殖和膠原纖維分泌。
此外，我們進一步構建了 miR-3187-5p 靶基因所編碼蛋白質之間的相互作用網絡，發現節點度排名前10位的基因中NAT10、RRP12、GNL3L、RBM19、HEATR1曾被報道參與細胞增殖的過程[22-26]。以NAT10為例，余程[22]的研究發現在利用頸動脈球囊損傷構建血管新生內膜形成的SD大鼠模型中敲除NAT10后，可抑制細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡。miR-3187-5p 可能在手術帶來的血管損傷觸發的損傷-修復反應中負調控NAT10，進而促進心房局部成纖維細胞增加，促進膠原合成增加。
再者，本研究單因素分析結果顯示相對于non-POAF組，POAF組三尖瓣反流患者比例更大、術后1 d CK-MB和CTNI值更高、術后0～6 h和24～48 h心包引流液量更多、手術時間更長，但由于本研究樣本量較少，因此這些因素在回歸方程中未能進入模型，但是可供今后大樣本臨床研究篩選危險因素時作為參考。三尖瓣反流與右心房結構改變相關，而心房重構是AF的關鍵病理基礎[27]。術后CK-MB和CTNI值高表示心肌損傷程度大，直接反映了手術對心臟損傷的程度，而術中心肌再灌注損傷與POAF發生有關[28]。術后心包引流液量多的患者更易發生POAF這一結論也與本研究團隊前期工作結論相符[29]，引流量的增加可能由手術時間長、心臟應激性增加、術后液體不平衡所致，亦可反映手術損傷程度。心肌受損程度曾被報道與POAF的發生有關[30]。CABG手術時間與POAF發生的關系尚未有明確報道，推測其可能為主動脈交叉夾鉗時間延長所致，而這一因素是較為明確的可能增加POAF發生率的因素[31]。
本研究存在幾點局限性。一是未檢測基線血液中miR-3187-5p水平，因此不能排除基線差異對于結果的影響，將在未來研究中進行彌補。二是，本研究對miR-3187-5p的信號通路進行了生物信息學分析與預測，發現其通過調控TGF-β等通路參與POAF的發生，尚未開展動物實驗對通路進行驗證，但本研究結果可對后期的通路研究提供方向與基礎。三是，本研究發現miR-3187-5p與POAF發生有關。但POAF發生機制復雜，已被證實與炎癥反應、纖維化相關。因此，關于miR-3187-5p是否是POAF發生的關鍵分子，需要進一步開展細胞和動物實驗，通過敲減或過表達miR-3187-5p，觀察其對POAF發生情況的影響。四是，由于疫情管控原因，研究期間納入患者較少，造成心房大小、三尖瓣反流、術后心功酶等可能對AF有影響的因素未能納入模型。最終僅1個因素“術后0 h心包引流液miR-3187-5p水平≥2.11”具有預測價值。此結果一方面與樣本量小有關，另一方面也反映了miR-3187-5p水平的強大預測能力。再者，本研究樣本來自于同一家醫院，影響研究結果的外推性，但本研究結果可為今后大樣本、多中心研究提供研究方向。
本研究首次對CABG術后患者血液和心包引流液中的miR-3187-5p與POAF的關系進行了初步探索，并發現術后0 h心包引流液中的miR-3187-5p是一種潛在的、新型的、無創的POAF預測因子，其可能通過調控TGF-β、MAPK、Wnt信號通路進而促使CABG術后早期膠原代謝失衡，心房中膠原沉積增加，進而促使術后早期結構重構，導致POAF的發生。研究結果為POAF的發生機制探討提供了新思路，并為臨床POAF的精準預測和預防提供了研究基礎。
利益沖突：無。
作者貢獻：閆子伊負責數據收集與分析，論文撰寫；趙海波、賀春岳負責數據收集與分析；劉溢思負責研究構思與設計，數據收集與分析，論文撰寫與修訂。
