引用本文： 藺軍平, 孟于琪, 李斌, 馮海明, 李政. DDX46基因調控TE-1食管鱗狀細胞癌細胞侵襲轉移行為的相關性研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(7): 1030-1037. doi: 10.7507/1007-4848.202204019 復制
食管癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，我國屬于食管癌的高發地域，其發病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第6位和第5位[1]。近些年隨著研究的深入，食管癌的手術治療、根治性放化療、聯合免疫治療、靶向治療等均取得了相當的成果[2]，并逐漸形成了以外科手術治療為主的綜合治療模式[3]，但目前整體治療效果并不理想。數據顯示，中國食管癌患者的整體5年生存率僅為29.7%[4]，這與食管癌細胞的侵襲和轉移等惡性生物學行為密切相關。RNA解旋酶是RNA代謝活動中起重要作用的物質，可利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水解產生的能量參與RNA的轉錄、剪接和生物合成等代謝過程[5]。DDX46作為RNA解旋酶家族成員參與多種腫瘤的發生、發展過程[6-10]。先前的研究[11]已經證實了食管鱗狀細胞癌（鱗癌）組織及細胞中存在DDX46基因及蛋白的過表達，敲減DDX46基因能夠抑制食管鱗癌細胞的增殖并誘發細胞凋亡。本研究通過shRNA慢病毒轉染TE-1食管鱗癌細胞以敲減DDX46基因表達，初步探討DDX46與食管鱗癌細胞侵襲和轉移過程的相關性及可能存在的作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和設備
主要試劑：anti-DDX46（美國Sigma），anti-GAPDH（美國Santa Cruz），anti-rabbit IgG（美國Santa Cruz），BCA蛋白濃度測定試劑（上海碧云天），Bulge-LoopTM miRNARTFQPCR Primer Set（廣州銳博），D-Hanks（上海吉凱），DMEM（美國Corning），dNTPs（美國Promega），M-MLV（美國Promega），ECL-PLUS/Kit（美國Thermo），matrigel基質膠（BD Biocoat），Oligo dT（上海生工），Prestained Protein Marker（美國Thermo），Puromycin（美國Clontech），PVDF膜（美國Millipore），RIPA裂解液（上海碧云天），RNase Inhibitor（美國Promega），SYBR Master Mixture（日本TaKaRa），0.5%結晶紫水溶液（上海源葉），TRIzol提取液（上海普飛），X線膠片定影粉和顯影粉（上海冠龍），侵襲試劑盒（美國Corning），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，澳大利亞Ausbian），胰酶（上海生工），引物（上海吉凱）。主要儀器：PCR儀（瑞士Roche），蛋白電泳儀和蛋白轉膜儀（上海天能），電泳穩壓電源及穩壓電泳儀（上海天能），離心機（美國賽默飛），CO2培養箱（日本Sanyo），熒光顯微鏡（日本Olympus）。
1.2 細胞培養及轉染
TE-1食管鱗癌細胞由上海生命科學研究院細胞資源中心提供，上海吉凱基因化學技術有限公司負責完成慢病毒的制備包裝及基因靶點序列設計。DDX46基因shRNA序列：5'-AGAAATCACCAGGCTCATA-3'（shDDX46組），陰性shCtrl對照序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（shCtrl組）[12]。胰蛋白酶消化對數生長期TE-1食管鱗癌細胞，然后用完全培養基制成（3～5）×104個/mL的懸液，均勻接種至6孔板中繼續培養；鋪板量達30%左右時，更換感染培養基，加入適量的慢病毒進行感染，具體操作同慢病毒轉染實驗[13]；感染后12 h更換常規培養基繼續培養；觀察各組細胞狀態良好，未見大量死亡現象；72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達量，即為轉染效率，細胞轉染率達70%以上可繼續下游實驗。
1.3 實時熒光定量PCR
收集對數生長期的目的細胞，經Trizol裂解液充分裂解后提取總RNA。選擇GAPDH為內參基因 ，兩步法進行PCR。首先參照M-MLV 操作要求進行反轉錄獲得 cDNA，再以cDNA為模板進行PCR。DDX46基因mRNA的相對表達量F=2-??Ct，即反映各樣品相對shCtrl組樣品目的基因的相對表達水平（ΔCt=DDX46基因Ct值?GAPDH基因Ct值，ΔΔCt=shRNA組ΔCt均數值?shCtrl組ΔCt均數值）。實驗重復進行3次。
1.4 蛋白質印跡
提取轉染成功的TE-1食管鱗癌細胞中的總蛋白，檢測DDX46基因敲減前后DDX46蛋白及纖連蛋白的表達變化情況，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。按每孔上樣量20 μg進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后改用條件為4℃、300 mA恒定電流持續電轉150 min，轉移蛋白到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST 溶液在室溫條件下封閉1 h，使用封閉液稀釋一抗（anti-DDX46：1∶200；anti-Fibronectin：1∶500；anti-GAPDH：1∶2 000）后將封閉好的PVDF膜在室溫條件下孵育2 h，TBST清洗；同樣用封閉液稀釋二抗（anti-rabbit IgG：1∶2 000；anti-mouse IgG：1∶2 000）后與PVDF膜在室溫環境中孵育1.5 h，TBST清洗；顯色，拍照。采用Image J軟件進行灰度值分析。
1.5 劃痕實驗
依據實驗分組在各孔中依次加入5×105個慢病毒轉染后的TE-1食管鱗癌細胞，24 h后更換低濃度血清培養基，采用劃痕儀在96孔板的細胞層上劃痕，使用無血清培養基漂洗2～3遍后加入低濃度血清培養基，放入37℃、5% CO2培養箱培養，細胞生長狀態良好，分別于0 h及8 h時間點隨機選擇3孔拍照記錄，結果根據劃痕間距隨時間的改變量計算DDX46基因敲減前后的細胞遷移率。
1.6 Transwell小室實驗
接種TE-1食管鱗癌細胞到Transwell小室上室中，確保接種細胞數達到5×105個/孔，下室內加入30% FBS培養基600 μL；接種TE-1細胞后于37℃恒溫CO2培養箱培養24 h，培養結束后去除上室中未轉移的細胞及多余培養基，向小室膜的下表面滴入0.5%結晶紫水溶液染色5 min，沖洗后晾干。200倍鏡下隨機選取3孔，各9個不同視野拍照，計數分析。
1.7 侵襲實驗
從冰箱?20℃中取出試劑盒，將所需數目的小室置于新的24孔板中，無菌操作臺內放置使其恢復到室溫，將500 μL無血清培養基加入小室后將其置入37℃ 恒溫CO2培養箱中靜置2 h，待聚碳酸酯膜上的Matrigel基質層水化完成后，將侵襲小室轉移至新的24孔板中，小心除去侵襲小室中的多余培養基后，下層小室內加入30% FBS培養基750 μL，上層小室中加入500 μL TE-1食管鱗癌細胞懸液，另用該細胞懸液鋪24孔板為侵襲對照，并確保接種細胞數達到5×105個/孔，接種后37℃培養箱中培養24 h，培養結束后去除多余培養基和未轉移細胞，向小室膜的下表面滴入0.5%結晶紫水溶液染色5 min，沖洗晾干。200倍鏡下隨機選取3孔，各9個不同視野拍照，計數分析。
1.8 差異基因在經典通路中的富集分析
本課題組前期研究[14]采用Affymetrix人類全基因表達譜芯片檢測敲減DDX46基因后的TE-1食管鱗癌細胞中全基因的表達豐度變化，獲得差異基因表達譜。本研究中將前期獲得的差異表達基因導入Ingenuity Pathway Analysis（www.ingenuity.com，IPA）在線工具中分析差異基因調控經典通路的狀態變化[15]，所有的信號通路使用?log（P-value）進行排序，得到差異基因在經典信號通路中的富集情況，結果采用信號通路柱狀圖表示。
1.9 統計學分析
結果采用SPSS 23.0軟件分析，計量資料服從正態分布，采用均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用t檢驗，t檢驗前先進行F檢驗，當F檢驗值>0.05時按等方差雙樣本檢驗得到t檢驗值，當F檢驗值≤0.05時按異方差雙樣本檢驗得到t檢驗值。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 慢病毒轉染及效率評價
慢病毒轉染后72 h于熒光顯微鏡下觀察TE-1食管鱗癌細胞中綠色熒光蛋白表達情況，shDDX46組和shCtrl組細胞熒光率達到80%以上，提示TE-1細胞感染率達到80%以上；見圖1a。PCR結果顯示，TE-1食管鱗癌細胞經shRNA慢病毒轉染后，DDX46基因表達明顯下調，基因敲減效率達88.2%（P=0.011）；見圖1b。同時Western blotting結果顯示DDX46基因在蛋白水平的表達也被顯著抑制；見圖1c。上述結果表明shRNA慢病毒轉染后TE-1食管鱗癌細胞中DDX46基因實現敲減表達，目的基因靶點是有效靶點，轉染效率及敲減效率均滿足后續實驗要求。
圖1
慢病毒轉染效率及DDX46基因敲減效率檢測
a：慢病毒TE-1細胞感染率達到80%以上（100×）；b：PCR檢測DDX46基因在mRNA水平的表達豐度；c：Western blotting檢測DDX46基因目的蛋白表達變化
2.2 敲減DDX46基因后細胞遷移能力變化
2.2.1 劃痕實驗
TE-1細胞慢病毒轉染成功后接種到劃痕儀上培養，在劃痕后8 h測量劃痕間距的改變量，shDDX46組細胞平均遷移率低于shCtrl組，差異有統計學意義（0.41±0.04 vs. 0.61±0.02，P=0.001），提示敲減DDX46基因后TE-1食管鱗癌細胞的遷移能力減弱；見圖2。
圖2
劃痕實驗
a：DDX46基因敲減前后TE-1食管鱗癌細胞劃痕間距的變化圖；b：shCtrl組與shDDX46組細胞遷移率的比較
2.2.2 Transwell小室實驗
兩組轉移細胞數分別為170.00±1.43、81.00±8.08，shDDX46組轉移細胞數顯著少于shCtrl組，細胞轉移率下降了52%，差異有統計學意義（P<0.001），說明敲減DDX46基因表達能抑制TE-1食管鱗癌細胞的遷移能力；見圖3。
圖3
Transwell小室實驗
a：慢病毒轉染后的TE-1食管鱗癌細胞在Transwell小室內孵育24 h后，于200倍鏡下觀察細胞轉移情況；b：細胞相對轉移率
2.3 敲減DDX46基因后細胞侵襲能力變化
將慢病毒轉染后的TE-1食管鱗癌細胞接種到侵襲小室培養24 h，染色晾干后拍照，分析計數發現shDDX46組能透過Matrigel基質膠和濾膜的細胞數量少于shCtrl組，相比shCtrl組，shDDX46組細胞侵襲率降低了54%（P<0.001），表明敲減DDX46基因使得TE-1食管鱗癌細胞的侵襲能力明顯減弱；見圖4。
圖4
侵襲實驗
a：轉染后的TE-1細胞在侵襲小室內孵育24 h后，于200倍鏡下觀察細胞侵襲情況；b：侵襲細胞數的變化
2.4 富集分析及纖連蛋白表達情況
敲減DDX46基因后TE-1食管鱗癌細胞差異基因在經典信號通路中的富集情況見圖5。差異基因對18個經典信號通路均有調控作用，而在敲減食管鱗癌細胞DDX46基因后僅有整合素信號通路（Z-score為?2.324）的活性是被顯著抑制的，而其他信號通路的活性無明顯變化，因此整合素信號通路可能受到DDX46基因調控。進一步的Western blotting結果顯示敲減食管鱗癌細胞中DDX46基因后，TE-1食管鱗癌細胞與細胞粘附相關的纖連蛋白表達量較shCtrl組減少，其相對表達量下降了11%；見圖6。
圖5
差異基因在18條經典信號通路中的富集分析結果
橫坐標代表經典信號通路名稱，縱坐標表示差異基因在信號通路中富集的顯著性水平，其中縱坐標值越大，表示差異基因在該信號通路中越富集，Ratio表示在該信號通路中差異基因數與該通路中包含的所有基因數的比值。圖中采用藍色標注的信號通路代表通路被抑制，而使用橙色標注的信號通路則代表通路被激活，當｜Z-score｜>2表示差異基因對通路的調控作用顯著
圖6
纖連蛋白表達情況
a：Western blotting 檢測纖連蛋白表達條帶；b：經shCtrl校正后的纖連蛋白相對定量分析結果
3 討論
腫瘤的侵襲和轉移行為是腫瘤細胞具有惡性特征的主要體現，也是引發患者臨床治療失敗和預后不良的直接原因。DDX46作為依賴于ATP的RNA解旋酶家族成員，可以在mRNA前體剪接與核糖體組裝的過程中發揮重要作用，參與腫瘤的發生、發展過程。現已發現DDX46在多種腫瘤組織及細胞中存在過表達，沉默DDX46基因可抑制結直腸癌及皮膚鱗癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[6, 9]。在骨肉瘤的研究[8]中發現，敲減DDX46可以在下調細胞內磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的磷酸化水平后，實現抑制骨肉瘤細胞的體外侵襲和轉移。同樣在神經膠質瘤的研究[10]中發現DDX46可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶-p38信號通路增強膠質瘤細胞的增殖能力，但其遷移能力與DDX46并無顯著關聯。一項有關胃癌的研究[7]發現，DDX46在胃癌組織及細胞中均存在過表達，敲減 DDX46可抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，這個過程可能是DDX46敲減抑制了胃癌細胞中的 Akt/GSK-3β/β-catenin 信號通路，值得注意的是，Akt或β-catenin過表達的激活逆轉了DDX46敲減所產生的抗癌作用。另有研究[16]報道，在子癇前期的孕婦患者胎盤組織中發現DDX46基因的mRNA水平低于正常孕婦，敲減DDX46基因能顯著抑制滋養層細胞增殖并降低滋養層細胞的遷移和侵襲能力，而DDX46的過表達能促進滋養層細胞的遷移和侵襲；敲減DDX46后，PI3K、Akt和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白水平呈現下降趨勢。這與我們課題組前期完成的DDX46與食管鱗癌細胞增殖和凋亡實驗中的研究[12]結果一致。但是關于DDX46基因與食管鱗癌細胞侵襲和轉移行為的相關性目前并不明確。
本研究通過慢病毒轉染TE-1食管鱗癌細胞實現了DDX46基因敲減，相比空載體轉染，shRNA慢病毒轉染組DDX46基因的敲減效率達80%，證明目的基因靶點為有效靶點。后續劃痕間距的改變提示在敲減DDX46基因表達后食管鱗癌細胞的遷移能力下降，同時Transwell小室實驗中通過濾膜轉移到下室的細胞數目相比對照組減少，表明敲減DDX46基因能抑制食管鱗癌細胞的遷移能力。同樣在侵襲實驗中觀察到，shDDX46組食管鱗癌細胞通過降解濾膜表面基質膠進入下室的細胞數相比對照組減少。食管鱗癌細胞要通過濾膜，首先需要分泌基質金屬蛋白酶降解附著于濾膜表面的基質膠，因此敲減DDX46基因后食管鱗癌細胞的侵襲能力下降，這一過程可能是通過降低基質金屬蛋白酶的表達實現的。
為了進一步探討其可能存在的作用機制，本研究將前期通過敲減DDX46基因后獲得的食管鱗癌細胞差異基因表達譜[14]導入IPA在線分析工具中進行經典通路的富集分析，差異基因所調控的經典通路由IPA所收集歸納的800條信號、代謝通路所總結。結果顯示在18條經典信號通路中整合素信號通路的活性被顯著抑制，而與粘附相關的整合素作為整合素信號通路中的關鍵分子，能借助精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸序列（Arg-Gly-Asp，RGD）結合胞外基質中的纖連蛋白，為此我們進一步檢測了纖連蛋白的表達情況。結果表明在敲減TE-1食管鱗癌細胞DDX46基因后間質中纖連蛋白的表達下調，同樣敲減DDX46基因后食管鱗癌細胞的侵襲和遷移能力下降，因此敲減DDX46基因可能是通過下調整合素信號通路影響細胞粘附功能，從而改變腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。
整合素一方面介導了細胞與細胞間、細胞與細胞外基質以及細胞與病原體之間的相互作用[17]，能在細胞表面與細胞外基質中的纖連蛋白結合，提供腫瘤細胞粘附和遷移的位點[18]；另一方面，整合素是連接細胞內外信號傳導過程的橋梁[19]，能夠雙向傳導跨膜信號，可與信號通路中的下游分子在細胞內集聚啟動多條胞內信號轉導途徑，從而影響腫瘤細胞的生理和病理功能[20]。當整合素受到胞外因素的刺激后，細胞表面的整合素RGD序列結合纖連蛋白等介導細胞粘附，而整合素位于胞內片段則通過黏著斑蛋白將細胞外基質與細胞骨架的肌動蛋白連接在一起，形成細胞外基質‐整合素‐細胞骨架跨膜信號結構，使胞外刺激信號傳遞到細胞骨架，細胞骨架的結構改變引發細胞運動介導細胞遷移[21]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是黏著斑蛋白的重要成分，在細胞質中的激酶活性主要依賴整合素信號傳導[22]，是整合素信號通路的下游分子，參與多種腫瘤的發生、發展過程[17]。FAK作為整合素信號通路中胞外信號向胞內傳遞的關鍵分子，通過黏著斑的形成和細胞骨架的重構介導了多種腫瘤的侵襲和轉移行為[23-25]。PI3K/AKT是細胞內進行信號傳遞的重要通路，而PI3K作為細胞內PI3K/Akt信號通路的節點，也是整合素信號通路下游的分子，當細胞內接收胞外基質與整合素及黏著斑所傳遞的信號刺激后，PI3K結合FAK并被活化，完成信號的傳遞。相關研究[26-27]發現，FAK/PI3K/Akt信號通路傳導途徑能夠影響肝癌細胞及結直腸癌細胞的侵襲和轉移等惡性生物學行為。本課題組的前期研究[28]表明，敲減DDX46基因后細胞內PI3K及Akt均呈現下調表達，PI3K/Akt通路及下游部分分子表達被抑制。PI3K/Akt信號通路也參與食管癌細胞的侵襲和轉移等系列惡性行為的發生[29]。因此，敲減DDX46后整合素信號通路的活性下降，引起細胞內外信號傳導障礙，同時細胞骨架的重構進一步降低了細胞的侵襲與遷移能力。
綜上所述，DDX46基因參與調控食管鱗癌細胞的侵襲和遷移過程，敲減DDX46基因可能是通過下調整合素通路信號，使得細胞外信號向細胞內傳遞過程受阻，影響細胞粘附及骨架重構，從而抑制食管鱗癌細胞侵襲和轉移能力，未來有望為食管癌的治療提供新的思路。
利益沖突：無。
作者貢獻：藺軍平參與研究設計，實驗實施，論文初稿撰寫；孟于琪參與論文設計與數據統計學分析；李斌參與研究設計與指導，論文審閱修改；馮海明參與論文的數據整理與生物信息學分析；李政參與研究相關的實驗操作。
食管癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，我國屬于食管癌的高發地域，其發病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第6位和第5位[1]。近些年隨著研究的深入，食管癌的手術治療、根治性放化療、聯合免疫治療、靶向治療等均取得了相當的成果[2]，并逐漸形成了以外科手術治療為主的綜合治療模式[3]，但目前整體治療效果并不理想。數據顯示，中國食管癌患者的整體5年生存率僅為29.7%[4]，這與食管癌細胞的侵襲和轉移等惡性生物學行為密切相關。RNA解旋酶是RNA代謝活動中起重要作用的物質，可利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水解產生的能量參與RNA的轉錄、剪接和生物合成等代謝過程[5]。DDX46作為RNA解旋酶家族成員參與多種腫瘤的發生、發展過程[6-10]。先前的研究[11]已經證實了食管鱗狀細胞癌（鱗癌）組織及細胞中存在DDX46基因及蛋白的過表達，敲減DDX46基因能夠抑制食管鱗癌細胞的增殖并誘發細胞凋亡。本研究通過shRNA慢病毒轉染TE-1食管鱗癌細胞以敲減DDX46基因表達，初步探討DDX46與食管鱗癌細胞侵襲和轉移過程的相關性及可能存在的作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和設備
主要試劑：anti-DDX46（美國Sigma），anti-GAPDH（美國Santa Cruz），anti-rabbit IgG（美國Santa Cruz），BCA蛋白濃度測定試劑（上海碧云天），Bulge-LoopTM miRNARTFQPCR Primer Set（廣州銳博），D-Hanks（上海吉凱），DMEM（美國Corning），dNTPs（美國Promega），M-MLV（美國Promega），ECL-PLUS/Kit（美國Thermo），matrigel基質膠（BD Biocoat），Oligo dT（上海生工），Prestained Protein Marker（美國Thermo），Puromycin（美國Clontech），PVDF膜（美國Millipore），RIPA裂解液（上海碧云天），RNase Inhibitor（美國Promega），SYBR Master Mixture（日本TaKaRa），0.5%結晶紫水溶液（上海源葉），TRIzol提取液（上海普飛），X線膠片定影粉和顯影粉（上海冠龍），侵襲試劑盒（美國Corning），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，澳大利亞Ausbian），胰酶（上海生工），引物（上海吉凱）。主要儀器：PCR儀（瑞士Roche），蛋白電泳儀和蛋白轉膜儀（上海天能），電泳穩壓電源及穩壓電泳儀（上海天能），離心機（美國賽默飛），CO2培養箱（日本Sanyo），熒光顯微鏡（日本Olympus）。
1.2 細胞培養及轉染
TE-1食管鱗癌細胞由上海生命科學研究院細胞資源中心提供，上海吉凱基因化學技術有限公司負責完成慢病毒的制備包裝及基因靶點序列設計。DDX46基因shRNA序列：5'-AGAAATCACCAGGCTCATA-3'（shDDX46組），陰性shCtrl對照序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（shCtrl組）[12]。胰蛋白酶消化對數生長期TE-1食管鱗癌細胞，然后用完全培養基制成（3～5）×104個/mL的懸液，均勻接種至6孔板中繼續培養；鋪板量達30%左右時，更換感染培養基，加入適量的慢病毒進行感染，具體操作同慢病毒轉染實驗[13]；感染后12 h更換常規培養基繼續培養；觀察各組細胞狀態良好，未見大量死亡現象；72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達量，即為轉染效率，細胞轉染率達70%以上可繼續下游實驗。
1.3 實時熒光定量PCR
收集對數生長期的目的細胞，經Trizol裂解液充分裂解后提取總RNA。選擇GAPDH為內參基因 ，兩步法進行PCR。首先參照M-MLV 操作要求進行反轉錄獲得 cDNA，再以cDNA為模板進行PCR。DDX46基因mRNA的相對表達量F=2-??Ct，即反映各樣品相對shCtrl組樣品目的基因的相對表達水平（ΔCt=DDX46基因Ct值?GAPDH基因Ct值，ΔΔCt=shRNA組ΔCt均數值?shCtrl組ΔCt均數值）。實驗重復進行3次。
1.4 蛋白質印跡
提取轉染成功的TE-1食管鱗癌細胞中的總蛋白，檢測DDX46基因敲減前后DDX46蛋白及纖連蛋白的表達變化情況，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。按每孔上樣量20 μg進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后改用條件為4℃、300 mA恒定電流持續電轉150 min，轉移蛋白到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST 溶液在室溫條件下封閉1 h，使用封閉液稀釋一抗（anti-DDX46：1∶200；anti-Fibronectin：1∶500；anti-GAPDH：1∶2 000）后將封閉好的PVDF膜在室溫條件下孵育2 h，TBST清洗；同樣用封閉液稀釋二抗（anti-rabbit IgG：1∶2 000；anti-mouse IgG：1∶2 000）后與PVDF膜在室溫環境中孵育1.5 h，TBST清洗；顯色，拍照。采用Image J軟件進行灰度值分析。
1.5 劃痕實驗
依據實驗分組在各孔中依次加入5×105個慢病毒轉染后的TE-1食管鱗癌細胞，24 h后更換低濃度血清培養基，采用劃痕儀在96孔板的細胞層上劃痕，使用無血清培養基漂洗2～3遍后加入低濃度血清培養基，放入37℃、5% CO2培養箱培養，細胞生長狀態良好，分別于0 h及8 h時間點隨機選擇3孔拍照記錄，結果根據劃痕間距隨時間的改變量計算DDX46基因敲減前后的細胞遷移率。
1.6 Transwell小室實驗
接種TE-1食管鱗癌細胞到Transwell小室上室中，確保接種細胞數達到5×105個/孔，下室內加入30% FBS培養基600 μL；接種TE-1細胞后于37℃恒溫CO2培養箱培養24 h，培養結束后去除上室中未轉移的細胞及多余培養基，向小室膜的下表面滴入0.5%結晶紫水溶液染色5 min，沖洗后晾干。200倍鏡下隨機選取3孔，各9個不同視野拍照，計數分析。
1.7 侵襲實驗
從冰箱?20℃中取出試劑盒，將所需數目的小室置于新的24孔板中，無菌操作臺內放置使其恢復到室溫，將500 μL無血清培養基加入小室后將其置入37℃ 恒溫CO2培養箱中靜置2 h，待聚碳酸酯膜上的Matrigel基質層水化完成后，將侵襲小室轉移至新的24孔板中，小心除去侵襲小室中的多余培養基后，下層小室內加入30% FBS培養基750 μL，上層小室中加入500 μL TE-1食管鱗癌細胞懸液，另用該細胞懸液鋪24孔板為侵襲對照，并確保接種細胞數達到5×105個/孔，接種后37℃培養箱中培養24 h，培養結束后去除多余培養基和未轉移細胞，向小室膜的下表面滴入0.5%結晶紫水溶液染色5 min，沖洗晾干。200倍鏡下隨機選取3孔，各9個不同視野拍照，計數分析。
1.8 差異基因在經典通路中的富集分析
本課題組前期研究[14]采用Affymetrix人類全基因表達譜芯片檢測敲減DDX46基因后的TE-1食管鱗癌細胞中全基因的表達豐度變化，獲得差異基因表達譜。本研究中將前期獲得的差異表達基因導入Ingenuity Pathway Analysis（www.ingenuity.com，IPA）在線工具中分析差異基因調控經典通路的狀態變化[15]，所有的信號通路使用?log（P-value）進行排序，得到差異基因在經典信號通路中的富集情況，結果采用信號通路柱狀圖表示。
1.9 統計學分析
結果采用SPSS 23.0軟件分析，計量資料服從正態分布，采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，t檢驗前先進行F檢驗，當F檢驗值>0.05時按等方差雙樣本檢驗得到t檢驗值，當F檢驗值≤0.05時按異方差雙樣本檢驗得到t檢驗值。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 慢病毒轉染及效率評價
慢病毒轉染后72 h于熒光顯微鏡下觀察TE-1食管鱗癌細胞中綠色熒光蛋白表達情況，shDDX46組和shCtrl組細胞熒光率達到80%以上，提示TE-1細胞感染率達到80%以上；見圖1a。PCR結果顯示，TE-1食管鱗癌細胞經shRNA慢病毒轉染后，DDX46基因表達明顯下調，基因敲減效率達88.2%（P=0.011）；見圖1b。同時Western blotting結果顯示DDX46基因在蛋白水平的表達也被顯著抑制；見圖1c。上述結果表明shRNA慢病毒轉染后TE-1食管鱗癌細胞中DDX46基因實現敲減表達，目的基因靶點是有效靶點，轉染效率及敲減效率均滿足后續實驗要求。
圖1
慢病毒轉染效率及DDX46基因敲減效率檢測
a：慢病毒TE-1細胞感染率達到80%以上（100×）；b：PCR檢測DDX46基因在mRNA水平的表達豐度；c：Western blotting檢測DDX46基因目的蛋白表達變化
2.2 敲減DDX46基因后細胞遷移能力變化
2.2.1 劃痕實驗
TE-1細胞慢病毒轉染成功后接種到劃痕儀上培養，在劃痕后8 h測量劃痕間距的改變量，shDDX46組細胞平均遷移率低于shCtrl組，差異有統計學意義（0.41±0.04 vs. 0.61±0.02，P=0.001），提示敲減DDX46基因后TE-1食管鱗癌細胞的遷移能力減弱；見圖2。
圖2
劃痕實驗
a：DDX46基因敲減前后TE-1食管鱗癌細胞劃痕間距的變化圖；b：shCtrl組與shDDX46組細胞遷移率的比較
2.2.2 Transwell小室實驗
兩組轉移細胞數分別為170.00±1.43、81.00±8.08，shDDX46組轉移細胞數顯著少于shCtrl組，細胞轉移率下降了52%，差異有統計學意義（P<0.001），說明敲減DDX46基因表達能抑制TE-1食管鱗癌細胞的遷移能力；見圖3。
圖3
Transwell小室實驗
a：慢病毒轉染后的TE-1食管鱗癌細胞在Transwell小室內孵育24 h后，于200倍鏡下觀察細胞轉移情況；b：細胞相對轉移率
2.3 敲減DDX46基因后細胞侵襲能力變化
將慢病毒轉染后的TE-1食管鱗癌細胞接種到侵襲小室培養24 h，染色晾干后拍照，分析計數發現shDDX46組能透過Matrigel基質膠和濾膜的細胞數量少于shCtrl組，相比shCtrl組，shDDX46組細胞侵襲率降低了54%（P<0.001），表明敲減DDX46基因使得TE-1食管鱗癌細胞的侵襲能力明顯減弱；見圖4。
圖4
侵襲實驗
a：轉染后的TE-1細胞在侵襲小室內孵育24 h后，于200倍鏡下觀察細胞侵襲情況；b：侵襲細胞數的變化
2.4 富集分析及纖連蛋白表達情況
敲減DDX46基因后TE-1食管鱗癌細胞差異基因在經典信號通路中的富集情況見圖5。差異基因對18個經典信號通路均有調控作用，而在敲減食管鱗癌細胞DDX46基因后僅有整合素信號通路（Z-score為?2.324）的活性是被顯著抑制的，而其他信號通路的活性無明顯變化，因此整合素信號通路可能受到DDX46基因調控。進一步的Western blotting結果顯示敲減食管鱗癌細胞中DDX46基因后，TE-1食管鱗癌細胞與細胞粘附相關的纖連蛋白表達量較shCtrl組減少，其相對表達量下降了11%；見圖6。
圖5
差異基因在18條經典信號通路中的富集分析結果
橫坐標代表經典信號通路名稱，縱坐標表示差異基因在信號通路中富集的顯著性水平，其中縱坐標值越大，表示差異基因在該信號通路中越富集，Ratio表示在該信號通路中差異基因數與該通路中包含的所有基因數的比值。圖中采用藍色標注的信號通路代表通路被抑制，而使用橙色標注的信號通路則代表通路被激活，當｜Z-score｜>2表示差異基因對通路的調控作用顯著
圖6
纖連蛋白表達情況
a：Western blotting 檢測纖連蛋白表達條帶；b：經shCtrl校正后的纖連蛋白相對定量分析結果
3 討論
腫瘤的侵襲和轉移行為是腫瘤細胞具有惡性特征的主要體現，也是引發患者臨床治療失敗和預后不良的直接原因。DDX46作為依賴于ATP的RNA解旋酶家族成員，可以在mRNA前體剪接與核糖體組裝的過程中發揮重要作用，參與腫瘤的發生、發展過程。現已發現DDX46在多種腫瘤組織及細胞中存在過表達，沉默DDX46基因可抑制結直腸癌及皮膚鱗癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[6, 9]。在骨肉瘤的研究[8]中發現，敲減DDX46可以在下調細胞內磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的磷酸化水平后，實現抑制骨肉瘤細胞的體外侵襲和轉移。同樣在神經膠質瘤的研究[10]中發現DDX46可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶-p38信號通路增強膠質瘤細胞的增殖能力，但其遷移能力與DDX46并無顯著關聯。一項有關胃癌的研究[7]發現，DDX46在胃癌組織及細胞中均存在過表達，敲減 DDX46可抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，這個過程可能是DDX46敲減抑制了胃癌細胞中的 Akt/GSK-3β/β-catenin 信號通路，值得注意的是，Akt或β-catenin過表達的激活逆轉了DDX46敲減所產生的抗癌作用。另有研究[16]報道，在子癇前期的孕婦患者胎盤組織中發現DDX46基因的mRNA水平低于正常孕婦，敲減DDX46基因能顯著抑制滋養層細胞增殖并降低滋養層細胞的遷移和侵襲能力，而DDX46的過表達能促進滋養層細胞的遷移和侵襲；敲減DDX46后，PI3K、Akt和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白水平呈現下降趨勢。這與我們課題組前期完成的DDX46與食管鱗癌細胞增殖和凋亡實驗中的研究[12]結果一致。但是關于DDX46基因與食管鱗癌細胞侵襲和轉移行為的相關性目前并不明確。
本研究通過慢病毒轉染TE-1食管鱗癌細胞實現了DDX46基因敲減，相比空載體轉染，shRNA慢病毒轉染組DDX46基因的敲減效率達80%，證明目的基因靶點為有效靶點。后續劃痕間距的改變提示在敲減DDX46基因表達后食管鱗癌細胞的遷移能力下降，同時Transwell小室實驗中通過濾膜轉移到下室的細胞數目相比對照組減少，表明敲減DDX46基因能抑制食管鱗癌細胞的遷移能力。同樣在侵襲實驗中觀察到，shDDX46組食管鱗癌細胞通過降解濾膜表面基質膠進入下室的細胞數相比對照組減少。食管鱗癌細胞要通過濾膜，首先需要分泌基質金屬蛋白酶降解附著于濾膜表面的基質膠，因此敲減DDX46基因后食管鱗癌細胞的侵襲能力下降，這一過程可能是通過降低基質金屬蛋白酶的表達實現的。
為了進一步探討其可能存在的作用機制，本研究將前期通過敲減DDX46基因后獲得的食管鱗癌細胞差異基因表達譜[14]導入IPA在線分析工具中進行經典通路的富集分析，差異基因所調控的經典通路由IPA所收集歸納的800條信號、代謝通路所總結。結果顯示在18條經典信號通路中整合素信號通路的活性被顯著抑制，而與粘附相關的整合素作為整合素信號通路中的關鍵分子，能借助精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸序列（Arg-Gly-Asp，RGD）結合胞外基質中的纖連蛋白，為此我們進一步檢測了纖連蛋白的表達情況。結果表明在敲減TE-1食管鱗癌細胞DDX46基因后間質中纖連蛋白的表達下調，同樣敲減DDX46基因后食管鱗癌細胞的侵襲和遷移能力下降，因此敲減DDX46基因可能是通過下調整合素信號通路影響細胞粘附功能，從而改變腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。
整合素一方面介導了細胞與細胞間、細胞與細胞外基質以及細胞與病原體之間的相互作用[17]，能在細胞表面與細胞外基質中的纖連蛋白結合，提供腫瘤細胞粘附和遷移的位點[18]；另一方面，整合素是連接細胞內外信號傳導過程的橋梁[19]，能夠雙向傳導跨膜信號，可與信號通路中的下游分子在細胞內集聚啟動多條胞內信號轉導途徑，從而影響腫瘤細胞的生理和病理功能[20]。當整合素受到胞外因素的刺激后，細胞表面的整合素RGD序列結合纖連蛋白等介導細胞粘附，而整合素位于胞內片段則通過黏著斑蛋白將細胞外基質與細胞骨架的肌動蛋白連接在一起，形成細胞外基質‐整合素‐細胞骨架跨膜信號結構，使胞外刺激信號傳遞到細胞骨架，細胞骨架的結構改變引發細胞運動介導細胞遷移[21]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是黏著斑蛋白的重要成分，在細胞質中的激酶活性主要依賴整合素信號傳導[22]，是整合素信號通路的下游分子，參與多種腫瘤的發生、發展過程[17]。FAK作為整合素信號通路中胞外信號向胞內傳遞的關鍵分子，通過黏著斑的形成和細胞骨架的重構介導了多種腫瘤的侵襲和轉移行為[23-25]。PI3K/AKT是細胞內進行信號傳遞的重要通路，而PI3K作為細胞內PI3K/Akt信號通路的節點，也是整合素信號通路下游的分子，當細胞內接收胞外基質與整合素及黏著斑所傳遞的信號刺激后，PI3K結合FAK并被活化，完成信號的傳遞。相關研究[26-27]發現，FAK/PI3K/Akt信號通路傳導途徑能夠影響肝癌細胞及結直腸癌細胞的侵襲和轉移等惡性生物學行為。本課題組的前期研究[28]表明，敲減DDX46基因后細胞內PI3K及Akt均呈現下調表達，PI3K/Akt通路及下游部分分子表達被抑制。PI3K/Akt信號通路也參與食管癌細胞的侵襲和轉移等系列惡性行為的發生[29]。因此，敲減DDX46后整合素信號通路的活性下降，引起細胞內外信號傳導障礙，同時細胞骨架的重構進一步降低了細胞的侵襲與遷移能力。
綜上所述，DDX46基因參與調控食管鱗癌細胞的侵襲和遷移過程，敲減DDX46基因可能是通過下調整合素通路信號，使得細胞外信號向細胞內傳遞過程受阻，影響細胞粘附及骨架重構，從而抑制食管鱗癌細胞侵襲和轉移能力，未來有望為食管癌的治療提供新的思路。
利益沖突：無。
作者貢獻：藺軍平參與研究設計，實驗實施，論文初稿撰寫；孟于琪參與論文設計與數據統計學分析；李斌參與研究設計與指導，論文審閱修改；馮海明參與論文的數據整理與生物信息學分析；李政參與研究相關的實驗操作。
