引用本文： 王賽, 王靈杰, 李艷麗, 李鵬, 李蒙君, 趙懂華, 王勇杰. 桔皮素通過調節PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制非小細胞肺癌的腫瘤干性. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(4): 614-621. doi: 10.7507/1007-4848.202203003 復制
肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，占所有惡性腫瘤的11%左右，在腫瘤導致的死亡中約占18%[1-2]。在所有類型的肺癌中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占比最高，約85%[3]。NSCLC治療困難，盡管由手術、免疫治療和放化療結合的綜合治療手段改善了NSCLC的預后，但仍有許多患者死于NSCLC的復發和轉移[4]，其治療效果仍不理想。有研究[5]顯示腫瘤干細胞是腫瘤復發和轉移的關鍵因素。腫瘤干細胞也被稱為腫瘤生發細胞，是具有多向分化、轉移、高增殖性、自我更新等能力的一個腫瘤細胞亞群。腫瘤干細胞與腫瘤的放/化療耐受、復發、轉移密切相關[6]。如果不能抑制腫瘤干細胞，很可能導致后期腫瘤的復發和轉移[7]。因此針對腫瘤干細胞的治療措施是很有意義的抗腫瘤策略。針對腫瘤干細胞的靶向抑制是重要的研究領域，尋找能夠靶向抑制肺癌干細胞的藥物已經成為研究熱點。有研究[8]顯示長期食用柑橘可以降低腫瘤相關疾病的發病風險。因此從柑橘尋找具體的化合物對腫瘤的治療有一定的意義。桔皮素是一種提取自柑橘果皮的多甲基黃酮類天然產物，在許多腫瘤疾病上表現出較好的抗腫瘤效果[9-11]。國內外的研究[12-15]顯示桔皮素對肺癌有一定的治療潛力，而關于桔皮素對肺癌干細胞的研究尚未見報道。為了研究桔皮素對NSCLC的治療作用，我們利用體外實驗和體內實驗檢測桔皮素對NSCLC的影響，并探討其潛在的分子機制。
1 材料與方法
1.1 藥物、細胞及動物
桔皮素（HY-N0133）藥物購買自上海MCE公司，純度為99.51%。A549、HCC827、H1299細胞系均購買自武漢普諾賽生物公司，貨號分別為A549#CL-0016、HCC827#CL-0094、H1299#CL-0165。雄性裸鼠購買自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010。
1.2 細胞計數實驗
取對數生長期的NSCLC細胞系A549、HCC827、H1299細胞，以5 000個/孔的密度接種于96孔板中，加不同濃度的桔皮素孵育24 h或48 h，對照組加入相同體積的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，孵育結束后加10 μL CCK-8試劑，于酶標儀中檢測吸光度。
1.3 細胞克隆實驗
取對數生長期的NSCLC細胞系A549、HCC827、H1299細胞，以800個/孔的密度接種于6孔細胞培養板，孵育過夜后，加不同濃度的桔皮素，對照組加入相同體積的DMSO溶液，每隔3 d換液1次，培養12 d，培養結束后以結晶紫溶液染色，拍照，顯微鏡下計數。
1.4 transwell實驗
在transwell上室鋪上基質膠，取對數生長期的NSCLC細胞系A549、HCC827、H1299細胞，以5 000個/孔的密度，將細胞與不含胎牛血清的培養基混合，接種于上室，在上室中加不同濃度的桔皮素孵育24 h，對照組加入相同體積的DMSO溶液。在下室中加入含胎牛血清的培養基。孵育24 h后，取出上室，置于多聚甲醛中固定，棉簽擦去上室內層的細胞，于顯微鏡下拍照計數。
1.5 裸鼠荷瘤實驗
取4周齡的雄性裸鼠，分為對照組和桔皮素組，每組各3只。取對數生長期的A549細胞，以2×105個/只的細胞濃度接種于裸鼠背部皮下，接種后，桔皮素組裸鼠注射桔皮素藥物5 mg/（kg·d），對照組注射等量DMSO溶液。每7 d測量皮下腫瘤直徑，治療28 d后，處死裸鼠，切除腫瘤稱重。
1.6 自我更新實驗
取對數生長期的NSCLC細胞系A549、HCC827、H1299細胞，使用低吸附的培養板，以400個/孔的密度與20 μL/孔的基質膠混合，將細胞與基質膠的混合溶液接種于96孔板中，每隔2 d向培養板中加入100 μL培養基。培養1周后顯微鏡下拍照，測量細胞球體的直徑，計數。
1.7 Western blotting 實驗
使用RIPA提取液提取桔皮素處理后的細胞蛋白，BCA法進行蛋白定量，加入一定量的Loading Buffer溶液，于100℃金屬浴變性15 min，于SDS-PAGE膠中電泳，然后轉膜，封閉，孵育一抗（一抗貨號及濃度如下：CD133，CST#64326，1∶1 000；Nanog，CST#8822，1∶1 000；PI3K，Affinity#AF6241，1∶1 000；p-PI3K，Affinity#AF3242，1∶500；AKT，Affinity#AF0836，1∶1000；p-AKT，Affinity#AF0832，1∶500；mTOR，Affinity#AF6308，1∶1 000；p-mTOR，Affinity#AF3308，1∶500；β-actin，CST#4970，1∶1 000），孵育二抗（二抗貨號及濃度如下：beyotime#A0408、beyotime#A0412，1∶5 000），ECL顯色，拍照。
1.8 統計學分析
采用SPSS 22.0進行統計學分析。每組實驗均重復3次，對計量資料進行正態性檢驗，均服從正態分布，以均數±標準差（
±s）描述，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。
1.9 倫理審查
本研究已通過康泰醫學檢驗服務河北有限公司實驗動物倫理委員會審批，批準號：MDL-2022-01-09-01。
2 結果
2.1 桔皮素在體外抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲
我們通過細胞計數實驗發現，桔皮素可以抑制A549、HCC827以及H1299 3種NSCLC細胞系的增殖活性。25～175 μM桔皮素治療下，各組細胞的活性與未處理組差異均有統計學意義（P<0.01）；見圖1a。隨后我們進一步利用克隆形成實驗檢測桔皮素對NSCLC細胞增殖能力的影響，我們發現桔皮素可以明顯抑制NSCLC細胞克隆形成能力，在100 μM組更加明顯，差異有統計學意義（P<0.01）；見圖1b～c。侵襲能力反映腫瘤在細胞水平的轉移能力，我們利用transwell實驗檢測NSCLC細胞的侵襲能力，發現桔皮素可以明顯抑制NSCLC細胞的侵襲能力；見圖1d～e。以上結果說明桔皮素在體外可以抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲能力。
圖1
桔皮素可以在體外抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲
a：細胞計數實驗檢測桔皮素對A549、HCC827、H1299 3種NSCLC細胞活性的影響，發現桔皮素對3種細胞有不同程度的活性抑制作用；b～c：利用克隆形成實驗檢測桔皮素對3種NSCLC細胞二維增殖的影響，發現桔皮素可以抑制NSCLC細胞的克隆形成能力，具有一定的濃度依賴性；d～e：利用transwell實驗檢測桔皮素對NSCLC細胞侵襲能力的影響，發現桔皮素可以明顯抑制NSCLC細胞的侵襲能力；NSCLC：非小細胞肺癌；**：與0 μM桔皮素組比較，
2.2 桔皮素在體內抑制NSCLC細胞增長
我們進一步研究桔皮素在體內的作用效果。通過裸鼠荷瘤模型檢測桔皮素在體內對NSCLC細胞的作用，我們發現桔皮素可以抑制NSCLC細胞在裸鼠體內的增殖速度，桔皮素組的腫瘤組織明顯小于對照組。對照組腫瘤體積（1.02±0.06）cm3，桔皮素組腫瘤體積（0.48±0.03）cm3，差異有統計學意義（P＜0.01）。對照組腫瘤重量為（0.97±0.16）g，桔皮素組腫瘤重量為（0.45±0.06）g，差異有統計學意義（P＜0.01）；見圖2。因此，我們認為桔皮素在體外和體內具有一定的抗腫瘤作用。
圖2
桔皮素在體內抑制非小細胞肺癌細胞增長
a：腫瘤實體圖；b：腫瘤體積比較；c：腫瘤重量比較；**：與Control組比較，
2.3 桔皮素抑制NSCLC細胞的腫瘤干性
為了檢測桔皮素是否影響NSCLC細胞的腫瘤干性，我們利用自我更新實驗和CD133、Nanog蛋白表達實驗檢測NSCLC細胞的腫瘤干性。我們發現桔皮素在3種細胞系中均可抑制自我更新球體的直徑和數量，并且這一抑制效果在高濃度桔皮素作用下更明顯；見圖3a～c。經桔皮素處理后的細胞CD133和Nanog蛋白的相對表達水平明顯下降；見圖3d～f。據此，我們認為桔皮素可以抑制NSCLC細胞的腫瘤干性。
圖3
桔皮素抑制NSCLC細胞的腫瘤干性
a：自我更新實驗；b：自我更新實驗中球體形成的數量變化；c：自我更新實驗中球體形成的直徑變化；d：Western blotting 實驗；e：桔皮素抑制CD133在3種NSCLC細胞中的表達；f：桔皮素抑制Nanog在3種NSCLC細胞中的表達；*：與0 µM桔皮素組比較，
2.4 桔皮素抑制NSCLC細胞中的PI3K/AKT/mTOR信號通路
為了探討PI3K/AKT/mTOR信號通路是否參與桔皮素抗腫瘤干性的過程，我們利用Western blotting實驗檢測桔皮素干預后A549細胞系中PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白的表達情況。結果發現桔皮素可以降低p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比例，其抑制作用在100 μM組更加明顯；見圖4a～b。說明桔皮素可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活。我們進一步利用740 Y-P TFA 作為PI3K/AKT/mTOR信號通路激活劑，使用濃度為30 μM。結果顯示，740 Y-P TFA可升高p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比例，說明740 Y-P TFA可以激活PI3K/AKT/mTOR信號通路；見圖4c～d。這表明740 Y-P TFA可改善桔皮素對PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用。進一步實驗發現740 Y-P TFA可緩解桔皮素導致的NSCLC細胞自我更新能力和CD133、Nanog表達水平的抑制；見圖4e～i。綜上，我們認為桔皮素可能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制NSCLC細胞的腫瘤干性。
圖4
桔皮素可抑制NSCLC細胞中的PI3K/AKT/mTOR信號通路
a～b：桔皮素可以明顯抑制p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比例；c～d：740 Y-P TFA可緩解桔皮素對p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比例的抑制作用；e～g：740 Y-P TFA可以部分改善桔皮素對自我更新能力的抑制；h～i：740 Y-P TFA可以緩解桔皮素對CD133、Nanog表達的抑制；*：
3 討論
腫瘤干細胞是腫瘤治療的重要靶細胞，越來越多的研究發現抑制腫瘤干性在腫瘤轉移、復發、耐藥等方面具有重要意義。肺癌干細胞治療的藥物研究較少，本研究發現桔皮素可以在體外抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲能力，也可以在體內抑制NSCLC細胞的增長，更重要的是桔皮素可有效抑制NSCLC細胞的腫瘤干性，桔皮素對NSCLC細胞腫瘤干性的影響與PI3K/AKT/mTOR信號通路的抑制有關。
Perez-Cornago等[8]的研究發現，長期食用柑橘的人群其前列腺癌的發病率較對照組人群低，而桔皮素是存在于各種柑橘果皮中的一種黃酮類天然化合物。研究顯示桔皮素在多種腫瘤中均具有一定的抗腫瘤作用，桔皮素可抑制前列腺癌LNCaP、PC-3細胞遷移和侵襲，并抑制其上皮-間質轉化過程[16]，還可以抑制轉移性乳腺癌，其作用靶點包括TP53、PTGS2、MMP9和PI3K/AKT信號通路[17]。在乳腺癌中的研究還發現，桔皮素可以影響腫瘤的代謝和能量生成過程[18]，還可以通過影響細胞周期、誘導細胞凋亡等方式抑制乳腺癌細胞[19]。在NSCLC中，桔皮素可通過促進自噬過程，誘導G2/M細胞周期停滯，促進細胞凋亡的發生[13-14]，桔皮素還可抑制轉移性肺癌細胞株的侵襲能力[15]。本研究發現桔皮素可以在體外抑制A549、HCC827及H1299 3種NSCLC細胞系的增殖和侵襲能力，這一結果與文獻報道類似。我們進一步研究了桔皮素對肺癌細胞體內增殖的影響，發現桔皮素可以在體內起到抑制肺癌細胞增殖的作用。
腫瘤干細胞是腫瘤細胞的一個亞群，可以驅動腫瘤的發生或復發，在腫瘤發生時，腫瘤干細胞可能來自分化成熟的細胞或者成體駐留的其他干細胞。腫瘤干細胞是腫瘤復發轉移的關鍵細胞[20]，已經成為目前腫瘤領域的研究熱點。腫瘤干細胞具有與正常干細胞類似的特性，腫瘤干細胞樣的表型被稱為“干性（stemness）”，包括自我更新能力、分化和強增殖的潛力，另外腫瘤干細胞有許多細胞標記物，如CD133、Nanog等[21]。這些細胞標記物的表達程度可以反映腫瘤干性的強弱，同時也可作為腫瘤干細胞的治療靶點。腫瘤干細胞在NSCLC化療耐受和復發過程中起重要作用[22]。因此尋找能抑制NSCLC細胞腫瘤干性的藥物十分迫切。在結腸癌中的研究[23]發現，桔皮素可以抑制結腸癌細胞的腫瘤干性，并且能改善5-氟尿嘧啶的抗腫瘤增殖作用。因此桔皮素具有靶向腫瘤干細胞的潛力，但桔皮素是否能抑制NSCLC細胞的腫瘤干性，尚未見文獻報道。我們的研究發現桔皮素可以抑制NSCLC細胞株自我更新能力，抑制腫瘤干細胞標記物CD133和Nanog的表達水平。為了進一步研究桔皮素抑制NSCLC細胞腫瘤干性的分子機制，我們研究了桔皮素處理與PI3K/AKT/mTOR信號通路的關聯。PI3K/AKT/mTOR信號通路是促進腫瘤干細胞干性的重要分子機制[24]，PI3K是細胞內磷脂酰肌醇激酶，它由調節亞基p85和催化亞基p110組成，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶和磷脂酰肌醇激酶活性。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，AKT是PI3K的關鍵效應物，可以直接被PI3K激活。mTOR是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是AKT的關鍵下游靶蛋白。激活PI3K可以促進CD133+/CD44+前列腺癌細胞的干性和致瘤性[25]。激活mTOR可上調肝臟腫瘤干細胞腫瘤標記物的表達[26]。PI3K/AKT/mTOR信號通路是桔皮素的下游靶點之一，Zhu等[16]在前列腺癌中發現，桔皮素可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路逆轉前列腺癌的上皮-間質轉化過程。因此我們進一步研究了桔皮素抑制NSCLC細胞腫瘤干性的分子機制，我們發現桔皮素可以抑制NSCLC細胞中的PI3K/AKT/mTOR信號通路，而使用該信號通路激活劑可以部分緩解桔皮素對NSCLC細胞腫瘤干性的抑制。因此我們認為桔皮素抑制NSCLC細胞腫瘤干性的分子機制可能是調節PI3K/AKT/mTOR信號通路。但桔皮素對NSCLC細胞腫瘤干性的抑制可能還有其他分子機制，PI3K/AKT/mTOR信號通路是其中一種。
綜上所述，桔皮素作為一種廉價、易獲取的天然產物，不僅可以在體外抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲，還可在體內抑制NSCLC細胞的增殖，更具意義的是桔皮素還可通過調節PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制NSCLC細胞的腫瘤干性，這說明桔皮素可能可以作為一種輔助藥物抑制NSCLC的復發和轉移。
利益沖突：無。
作者貢獻：王賽、王靈杰、王勇杰負責課題設計；王賽及王靈杰撰寫論文初稿；李艷麗、李鵬、李蒙君、趙懂華參與實驗實施及數據統計分析；王勇杰負責論文修改和審閱。
肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，占所有惡性腫瘤的11%左右，在腫瘤導致的死亡中約占18%[1-2]。在所有類型的肺癌中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占比最高，約85%[3]。NSCLC治療困難，盡管由手術、免疫治療和放化療結合的綜合治療手段改善了NSCLC的預后，但仍有許多患者死于NSCLC的復發和轉移[4]，其治療效果仍不理想。有研究[5]顯示腫瘤干細胞是腫瘤復發和轉移的關鍵因素。腫瘤干細胞也被稱為腫瘤生發細胞，是具有多向分化、轉移、高增殖性、自我更新等能力的一個腫瘤細胞亞群。腫瘤干細胞與腫瘤的放/化療耐受、復發、轉移密切相關[6]。如果不能抑制腫瘤干細胞，很可能導致后期腫瘤的復發和轉移[7]。因此針對腫瘤干細胞的治療措施是很有意義的抗腫瘤策略。針對腫瘤干細胞的靶向抑制是重要的研究領域，尋找能夠靶向抑制肺癌干細胞的藥物已經成為研究熱點。有研究[8]顯示長期食用柑橘可以降低腫瘤相關疾病的發病風險。因此從柑橘尋找具體的化合物對腫瘤的治療有一定的意義。桔皮素是一種提取自柑橘果皮的多甲基黃酮類天然產物，在許多腫瘤疾病上表現出較好的抗腫瘤效果[9-11]。國內外的研究[12-15]顯示桔皮素對肺癌有一定的治療潛力，而關于桔皮素對肺癌干細胞的研究尚未見報道。為了研究桔皮素對NSCLC的治療作用，我們利用體外實驗和體內實驗檢測桔皮素對NSCLC的影響，并探討其潛在的分子機制。
1 材料與方法
1.1 藥物、細胞及動物
桔皮素（HY-N0133）藥物購買自上海MCE公司，純度為99.51%。A549、HCC827、H1299細胞系均購買自武漢普諾賽生物公司，貨號分別為A549#CL-0016、HCC827#CL-0094、H1299#CL-0165。雄性裸鼠購買自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010。
1.2 細胞計數實驗
取對數生長期的NSCLC細胞系A549、HCC827、H1299細胞，以5 000個/孔的密度接種于96孔板中，加不同濃度的桔皮素孵育24 h或48 h，對照組加入相同體積的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，孵育結束后加10 μL CCK-8試劑，于酶標儀中檢測吸光度。
1.3 細胞克隆實驗
取對數生長期的NSCLC細胞系A549、HCC827、H1299細胞，以800個/孔的密度接種于6孔細胞培養板，孵育過夜后，加不同濃度的桔皮素，對照組加入相同體積的DMSO溶液，每隔3 d換液1次，培養12 d，培養結束后以結晶紫溶液染色，拍照，顯微鏡下計數。
1.4 transwell實驗
在transwell上室鋪上基質膠，取對數生長期的NSCLC細胞系A549、HCC827、H1299細胞，以5 000個/孔的密度，將細胞與不含胎牛血清的培養基混合，接種于上室，在上室中加不同濃度的桔皮素孵育24 h，對照組加入相同體積的DMSO溶液。在下室中加入含胎牛血清的培養基。孵育24 h后，取出上室，置于多聚甲醛中固定，棉簽擦去上室內層的細胞，于顯微鏡下拍照計數。
1.5 裸鼠荷瘤實驗
取4周齡的雄性裸鼠，分為對照組和桔皮素組，每組各3只。取對數生長期的A549細胞，以2×105個/只的細胞濃度接種于裸鼠背部皮下，接種后，桔皮素組裸鼠注射桔皮素藥物5 mg/（kg·d），對照組注射等量DMSO溶液。每7 d測量皮下腫瘤直徑，治療28 d后，處死裸鼠，切除腫瘤稱重。
1.6 自我更新實驗
取對數生長期的NSCLC細胞系A549、HCC827、H1299細胞，使用低吸附的培養板，以400個/孔的密度與20 μL/孔的基質膠混合，將細胞與基質膠的混合溶液接種于96孔板中，每隔2 d向培養板中加入100 μL培養基。培養1周后顯微鏡下拍照，測量細胞球體的直徑，計數。
1.7 Western blotting 實驗
使用RIPA提取液提取桔皮素處理后的細胞蛋白，BCA法進行蛋白定量，加入一定量的Loading Buffer溶液，于100℃金屬浴變性15 min，于SDS-PAGE膠中電泳，然后轉膜，封閉，孵育一抗（一抗貨號及濃度如下：CD133，CST#64326，1∶1 000；Nanog，CST#8822，1∶1 000；PI3K，Affinity#AF6241，1∶1 000；p-PI3K，Affinity#AF3242，1∶500；AKT，Affinity#AF0836，1∶1000；p-AKT，Affinity#AF0832，1∶500；mTOR，Affinity#AF6308，1∶1 000；p-mTOR，Affinity#AF3308，1∶500；β-actin，CST#4970，1∶1 000），孵育二抗（二抗貨號及濃度如下：beyotime#A0408、beyotime#A0412，1∶5 000），ECL顯色，拍照。
1.8 統計學分析
采用SPSS 22.0進行統計學分析。每組實驗均重復3次，對計量資料進行正態性檢驗，均服從正態分布，以均數±標準差（±s）描述，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。
1.9 倫理審查
本研究已通過康泰醫學檢驗服務河北有限公司實驗動物倫理委員會審批，批準號：MDL-2022-01-09-01。
2 結果
2.1 桔皮素在體外抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲
我們通過細胞計數實驗發現，桔皮素可以抑制A549、HCC827以及H1299 3種NSCLC細胞系的增殖活性。25～175 μM桔皮素治療下，各組細胞的活性與未處理組差異均有統計學意義（P<0.01）；見圖1a。隨后我們進一步利用克隆形成實驗檢測桔皮素對NSCLC細胞增殖能力的影響，我們發現桔皮素可以明顯抑制NSCLC細胞克隆形成能力，在100 μM組更加明顯，差異有統計學意義（P<0.01）；見圖1b～c。侵襲能力反映腫瘤在細胞水平的轉移能力，我們利用transwell實驗檢測NSCLC細胞的侵襲能力，發現桔皮素可以明顯抑制NSCLC細胞的侵襲能力；見圖1d～e。以上結果說明桔皮素在體外可以抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲能力。
圖1
桔皮素可以在體外抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲
a：細胞計數實驗檢測桔皮素對A549、HCC827、H1299 3種NSCLC細胞活性的影響，發現桔皮素對3種細胞有不同程度的活性抑制作用；b～c：利用克隆形成實驗檢測桔皮素對3種NSCLC細胞二維增殖的影響，發現桔皮素可以抑制NSCLC細胞的克隆形成能力，具有一定的濃度依賴性；d～e：利用transwell實驗檢測桔皮素對NSCLC細胞侵襲能力的影響，發現桔皮素可以明顯抑制NSCLC細胞的侵襲能力；NSCLC：非小細胞肺癌；**：與0 μM桔皮素組比較，
2.2 桔皮素在體內抑制NSCLC細胞增長
我們進一步研究桔皮素在體內的作用效果。通過裸鼠荷瘤模型檢測桔皮素在體內對NSCLC細胞的作用，我們發現桔皮素可以抑制NSCLC細胞在裸鼠體內的增殖速度，桔皮素組的腫瘤組織明顯小于對照組。對照組腫瘤體積（1.02±0.06）cm3，桔皮素組腫瘤體積（0.48±0.03）cm3，差異有統計學意義（P＜0.01）。對照組腫瘤重量為（0.97±0.16）g，桔皮素組腫瘤重量為（0.45±0.06）g，差異有統計學意義（P＜0.01）；見圖2。因此，我們認為桔皮素在體外和體內具有一定的抗腫瘤作用。
圖2
桔皮素在體內抑制非小細胞肺癌細胞增長
a：腫瘤實體圖；b：腫瘤體積比較；c：腫瘤重量比較；**：與Control組比較，
2.3 桔皮素抑制NSCLC細胞的腫瘤干性
為了檢測桔皮素是否影響NSCLC細胞的腫瘤干性，我們利用自我更新實驗和CD133、Nanog蛋白表達實驗檢測NSCLC細胞的腫瘤干性。我們發現桔皮素在3種細胞系中均可抑制自我更新球體的直徑和數量，并且這一抑制效果在高濃度桔皮素作用下更明顯；見圖3a～c。經桔皮素處理后的細胞CD133和Nanog蛋白的相對表達水平明顯下降；見圖3d～f。據此，我們認為桔皮素可以抑制NSCLC細胞的腫瘤干性。
圖3
桔皮素抑制NSCLC細胞的腫瘤干性
a：自我更新實驗；b：自我更新實驗中球體形成的數量變化；c：自我更新實驗中球體形成的直徑變化；d：Western blotting 實驗；e：桔皮素抑制CD133在3種NSCLC細胞中的表達；f：桔皮素抑制Nanog在3種NSCLC細胞中的表達；*：與0 µM桔皮素組比較，
2.4 桔皮素抑制NSCLC細胞中的PI3K/AKT/mTOR信號通路
為了探討PI3K/AKT/mTOR信號通路是否參與桔皮素抗腫瘤干性的過程，我們利用Western blotting實驗檢測桔皮素干預后A549細胞系中PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白的表達情況。結果發現桔皮素可以降低p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比例，其抑制作用在100 μM組更加明顯；見圖4a～b。說明桔皮素可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活。我們進一步利用740 Y-P TFA 作為PI3K/AKT/mTOR信號通路激活劑，使用濃度為30 μM。結果顯示，740 Y-P TFA可升高p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比例，說明740 Y-P TFA可以激活PI3K/AKT/mTOR信號通路；見圖4c～d。這表明740 Y-P TFA可改善桔皮素對PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用。進一步實驗發現740 Y-P TFA可緩解桔皮素導致的NSCLC細胞自我更新能力和CD133、Nanog表達水平的抑制；見圖4e～i。綜上，我們認為桔皮素可能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制NSCLC細胞的腫瘤干性。
圖4
桔皮素可抑制NSCLC細胞中的PI3K/AKT/mTOR信號通路
a～b：桔皮素可以明顯抑制p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比例；c～d：740 Y-P TFA可緩解桔皮素對p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比例的抑制作用；e～g：740 Y-P TFA可以部分改善桔皮素對自我更新能力的抑制；h～i：740 Y-P TFA可以緩解桔皮素對CD133、Nanog表達的抑制；*：
3 討論
腫瘤干細胞是腫瘤治療的重要靶細胞，越來越多的研究發現抑制腫瘤干性在腫瘤轉移、復發、耐藥等方面具有重要意義。肺癌干細胞治療的藥物研究較少，本研究發現桔皮素可以在體外抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲能力，也可以在體內抑制NSCLC細胞的增長，更重要的是桔皮素可有效抑制NSCLC細胞的腫瘤干性，桔皮素對NSCLC細胞腫瘤干性的影響與PI3K/AKT/mTOR信號通路的抑制有關。
Perez-Cornago等[8]的研究發現，長期食用柑橘的人群其前列腺癌的發病率較對照組人群低，而桔皮素是存在于各種柑橘果皮中的一種黃酮類天然化合物。研究顯示桔皮素在多種腫瘤中均具有一定的抗腫瘤作用，桔皮素可抑制前列腺癌LNCaP、PC-3細胞遷移和侵襲，并抑制其上皮-間質轉化過程[16]，還可以抑制轉移性乳腺癌，其作用靶點包括TP53、PTGS2、MMP9和PI3K/AKT信號通路[17]。在乳腺癌中的研究還發現，桔皮素可以影響腫瘤的代謝和能量生成過程[18]，還可以通過影響細胞周期、誘導細胞凋亡等方式抑制乳腺癌細胞[19]。在NSCLC中，桔皮素可通過促進自噬過程，誘導G2/M細胞周期停滯，促進細胞凋亡的發生[13-14]，桔皮素還可抑制轉移性肺癌細胞株的侵襲能力[15]。本研究發現桔皮素可以在體外抑制A549、HCC827及H1299 3種NSCLC細胞系的增殖和侵襲能力，這一結果與文獻報道類似。我們進一步研究了桔皮素對肺癌細胞體內增殖的影響，發現桔皮素可以在體內起到抑制肺癌細胞增殖的作用。
腫瘤干細胞是腫瘤細胞的一個亞群，可以驅動腫瘤的發生或復發，在腫瘤發生時，腫瘤干細胞可能來自分化成熟的細胞或者成體駐留的其他干細胞。腫瘤干細胞是腫瘤復發轉移的關鍵細胞[20]，已經成為目前腫瘤領域的研究熱點。腫瘤干細胞具有與正常干細胞類似的特性，腫瘤干細胞樣的表型被稱為“干性（stemness）”，包括自我更新能力、分化和強增殖的潛力，另外腫瘤干細胞有許多細胞標記物，如CD133、Nanog等[21]。這些細胞標記物的表達程度可以反映腫瘤干性的強弱，同時也可作為腫瘤干細胞的治療靶點。腫瘤干細胞在NSCLC化療耐受和復發過程中起重要作用[22]。因此尋找能抑制NSCLC細胞腫瘤干性的藥物十分迫切。在結腸癌中的研究[23]發現，桔皮素可以抑制結腸癌細胞的腫瘤干性，并且能改善5-氟尿嘧啶的抗腫瘤增殖作用。因此桔皮素具有靶向腫瘤干細胞的潛力，但桔皮素是否能抑制NSCLC細胞的腫瘤干性，尚未見文獻報道。我們的研究發現桔皮素可以抑制NSCLC細胞株自我更新能力，抑制腫瘤干細胞標記物CD133和Nanog的表達水平。為了進一步研究桔皮素抑制NSCLC細胞腫瘤干性的分子機制，我們研究了桔皮素處理與PI3K/AKT/mTOR信號通路的關聯。PI3K/AKT/mTOR信號通路是促進腫瘤干細胞干性的重要分子機制[24]，PI3K是細胞內磷脂酰肌醇激酶，它由調節亞基p85和催化亞基p110組成，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶和磷脂酰肌醇激酶活性。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，AKT是PI3K的關鍵效應物，可以直接被PI3K激活。mTOR是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是AKT的關鍵下游靶蛋白。激活PI3K可以促進CD133+/CD44+前列腺癌細胞的干性和致瘤性[25]。激活mTOR可上調肝臟腫瘤干細胞腫瘤標記物的表達[26]。PI3K/AKT/mTOR信號通路是桔皮素的下游靶點之一，Zhu等[16]在前列腺癌中發現，桔皮素可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路逆轉前列腺癌的上皮-間質轉化過程。因此我們進一步研究了桔皮素抑制NSCLC細胞腫瘤干性的分子機制，我們發現桔皮素可以抑制NSCLC細胞中的PI3K/AKT/mTOR信號通路，而使用該信號通路激活劑可以部分緩解桔皮素對NSCLC細胞腫瘤干性的抑制。因此我們認為桔皮素抑制NSCLC細胞腫瘤干性的分子機制可能是調節PI3K/AKT/mTOR信號通路。但桔皮素對NSCLC細胞腫瘤干性的抑制可能還有其他分子機制，PI3K/AKT/mTOR信號通路是其中一種。
綜上所述，桔皮素作為一種廉價、易獲取的天然產物，不僅可以在體外抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲，還可在體內抑制NSCLC細胞的增殖，更具意義的是桔皮素還可通過調節PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制NSCLC細胞的腫瘤干性，這說明桔皮素可能可以作為一種輔助藥物抑制NSCLC的復發和轉移。
利益沖突：無。
作者貢獻：王賽、王靈杰、王勇杰負責課題設計；王賽及王靈杰撰寫論文初稿；李艷麗、李鵬、李蒙君、趙懂華參與實驗實施及數據統計分析；王勇杰負責論文修改和審閱。
