引用本文： 張文, 谷天祥. 不同年齡 A 型主動脈夾層患者 Sirtuin1表達差異的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(4): 622-626. doi: 10.7507/1007-4848.202103016 復制
A 型主動脈夾層指主動脈腔內的高壓血流從主動脈內膜撕裂口進入主動脈中膜，使中膜分離，并沿主動脈長軸方向擴展，從而導致主動脈真假兩腔的一種病理學改變，是心臟外科急診中十分兇險的疾病[1]。目前，主動脈夾層的病因仍不明確。流行病學調查[2]指出，65 歲以上的人群主動脈夾層發生率較高，這說明衰老是主動脈夾層的危險因素之一。然而，臨床上 A 型主動脈夾層患者年輕化也成為一種趨勢。所以年齡和主動脈夾層之間各機制的作用關系還有待研究。
作為一種公認的長壽因子，Sirtuin1（SIRT1）在心血管疾病中起著重要作用。研究[3-4]指出，SIRT1 在血管中的表達隨著年齡的增長而降低，但 SIRT1 在主動脈夾層血管中是否也具有年齡依賴性還有待研究。為此，我們研究了不同年齡主動脈夾層患者主動脈壁中 SIRT1 表達是否有差異，為將來是否可將 SIRT1 作為主動脈夾層預測因子提供證據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
納入 2019—2020 年在中國醫科大學附屬第一醫院接受手術治療的 A 型主動脈夾層患者為夾層組，行冠狀動脈（冠脈）旁路移植術的冠脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）患者為對照組。經胸腹主動脈 CT 血管造影（CT angiography，CTA）、冠脈 CTA 等影像學檢查，明確主動脈夾層的診斷。排除馬方綜合征患者或者其他遺傳性血管疾病患者。<45 歲的患者納入低年齡組，45～60 歲的患者納入中年齡組，>60 歲的患者納入高年齡組。患者臨床資料見表 1。
表1
各組患者臨床資料比較［例（%）/
］
1.2 組織樣本的收集與存儲
所有樣本均為術中收集的新鮮主動脈壁組織，其中對照組取冠脈旁路移植術時主動脈打孔處的主動脈壁組織，于無酶標本袋中編號后，通過液氮罐轉移至?80℃ 超低溫冰箱保存。
1.3 實驗主要試劑
主要試劑包括：SIRT1 mRNA 引物及內參基因 GAPDH （上海生工）、反轉錄試劑（TAKARA 公司）、SIRT1 抗體（CST 公司）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）抗體（萬類生物）、BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、一抗稀釋液等（上海碧云天）。
1.4 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）
取黃豆大小的組織，液氮研磨后采用 TRIZOL 法提取組織總 RNA，去 DNA 反應后通過反轉錄得到 cDNA 溶液，實驗設置 3 個復孔，采用 Thermal Cycler DiceTM Real Time 進行 qRT-PCR 反應，得到 CT 值，并計算 2?ΔΔCT 值。
1.5 Western blotting 檢測
取黃豆大小組織，組織勻漿后采用 RIPA Lysis Buffer 提取組織總蛋白，通過 BCA 蛋白質測定試劑盒定量總蛋白質濃度。根據目標蛋白的相對分子質量選擇對應濃度的分離膠（8%分離膠：SIRT1；10%分離膠：MCP-1、GAPDH），濃縮膠均為 5%濃度。電泳后，將蛋白質轉移到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉封閉后，將膜與一抗在 4℃ 條件下孵育 24 h（SIRT1，1∶1000；MCP-1，1∶500）。洗膜后，孵育二抗，最后采用化學發光試劑顯色。通過 Micro.Chemi 化學發光型凝膠成像系統進行圖像采集。運用 Image J 軟件計算上述蛋白的平均光密度值，將各組平均光密度值除以內參蛋白 GAPDH 的平均光密度值獲取各目標蛋白的相對表達量。
1.6 免疫組織化學染色
通過免疫組織化學染色檢測主動脈壁組織中 SIRT1 蛋白的表達。4% 多聚甲醛固定組織后，OCT 包埋，制作冰凍切片。用 3% 的過氧化氫消除內源性過氧化物酶的活性，10% 正常山羊血清封閉，一抗孵育過夜（SIRT1，1∶500），PBS 洗片后滴加二抗工作液，然后顯色劑顯色，蘇木素復染，流水沖洗 1 min 后鹽酸酒精分化數秒，酒精梯度脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。
1.7 統計學分析
采用 SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
±s）描述，組間比較采用one-way ANOVA 分析。計數資料以頻數（%）描述，組間比較采用χ2檢驗。 P≤0.05 為差異有統計學意義。
1.8 倫理審查
本研究經中國醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審核批準，批準號：[2018]2018-149-2。
2 結果
2.1 SIRT1 mRNA 的表達
夾層組患者的 SIRT1 mRNA 表達量比對照組低，差異有統計學意義（P<0.001）。同時，SIRT1 mRNA 表達量在主動脈夾層患者中隨年齡的增長呈下降趨勢，差異有統計學意義（P<0.01）；見表2。
表2
各組患者 SIRT1 和 MCP-1 表達量比較（
）
2.2 SIRT1 及 MCP-1 蛋白的表達
通過 Western blotting 檢測各組 SIRT1 和 MCP-1 的蛋白表達。與對照組相比，SIRT1 蛋白在主動脈夾層樣本中低表達（P<0.01）；與低年齡夾層患者相比，SIRT1 蛋白在中年齡和高年齡夾層患者樣本中表達降低，差異有統計學意義（P<0.01）。在低年齡和中年齡患者樣本中，夾層組 MCP-1 蛋白表達量較對照組多，差異有統計學意義（P<0.001）。與低年齡組相比，MCP-1 蛋白表達量在主動脈夾層患者中隨著年齡的增長呈上升趨勢，差異有統計學意義（P<0.001）；見圖1、表 2。通過免疫組織化學染色檢驗主動脈壁組織樣本中的 SIRT1 蛋白，結果顯示：與對照組相比，夾層組 SIRT1 表達量降低（P<0.05）；與低年齡夾層樣本相比，SIRT1 蛋白在中年齡和高年齡夾層樣本中表達量降低，差異有統計學意義（P<0.01）；見圖2、表 2。
圖1
Sirtuin1和 MCP-1 蛋白的表達情況
MCP-1：單核細胞趨化蛋白-1
圖2
SIRT1 蛋白在組織的表達情況
3 討論
主動脈夾層是一種十分兇險的心血管疾病，發病率呈逐年上升趨勢。夾層破裂前一般無明顯的癥狀和體征，夾層破裂后其主要表現通常是胸部劇烈撕裂樣疼痛，目前仍缺少有效的預防篩查措施[5]。
根據研究[3, 6-7]，SIRT1 在心血管組織中起著重要的作用，包括抑制氧化應激，減少炎癥、泡沫細胞形成，抵抗細胞衰老等。SIRT1 還能夠提高平滑肌細胞的功能，在主動脈夾層的進展過程中起作用。有研究[4]指出，隨著年齡的增長，SIRT1 的表達水平受到顯著影響。SIRT1 在年輕和年老患者中所表現出的內源性差異作用包括對細胞周期和細胞增殖的調節，這一點對主動脈夾層的進展尤為重要。但對于年輕夾層患者，SIRT1 在其主動脈壁中的表達是否降低尚無相關研究。
行冠脈旁路移植術時，主動脈壁打孔處多選在主動脈壁柔軟有彈性處，盡量避免選取鈣化等粥樣硬化改變的部位，所以本研究選取這部分組織作為對照組。尤其對于年輕的冠心病患者，其主動脈壁可以看作是正常的主動脈壁組織。測定這部分組織的 SIRT1 表達可以一定程度代表此年齡段正常人的 SIRT1 表達情況。
本研究還測定了組織中 MCP-1 蛋白的表達。MCP-1 屬于 CC 趨化因子家族的一個小細胞因子，在機體炎癥時，血管平滑肌細胞可分泌 MCP-1 因子[8]。研究[9]發現，MCP-1 在動脈粥樣硬化過程中發揮重要作用，且 SIRT1 和 MCP-1 之間存在負性調控關系。SIRT1 可通過多個信號通路抑制 MCP-1 的表達，包括 NF-κB/SIRT1/AMPK 和 TNF-α/SIRT1/MCP-1 等信號通路[10-11]。本研究中，與對照組比較，夾層組中所有年齡段患者SIRT1均呈低表達，MCP-1在低年齡組及中年齡組夾層患者呈高表達趨勢，而在高年齡夾層患者中無表達增高。我們推測其可能的原因是：隨著年齡的增長，主動脈出現脂質斑塊、鈣化等粥樣硬化改變的幾率增加，MCP-1在粥樣硬化組織中表達增高[9]，所以高年齡組中，即使不存在主動脈夾層改變，其MCP-1的表達也可能升高，因此兩組差異無統計學意義。在低年齡組及中年齡組中，主動脈壁組織脂質沉積、粥樣硬化的幾率較低，其MCP-1的表達主要受SIRT1調控，提示主動脈夾層發生發展中炎性反應可能發揮重要作用。
相關研究[8]指出，主動脈夾層患者主動脈壁組織的 SIRT1 較周圍相對正常的血管呈低表達趨勢。但在 A 型主動脈夾層中，SIRT1 在高齡患者和年輕患者中是否有表達差異尚無相關研究。本研究首次從 mRNA 和蛋白質學層面分析了在 A 型主動脈夾層中，人體主動脈壁組織 SIRT1 在不同年齡的表達情況。實驗結果表明，在主動脈夾層組織中，SIRT1 的表達具有年齡相關性，即高齡夾層患者的 SIRT1 表達水平較低年齡夾層患者低。但是無論低齡還是高齡夾層患者，SIRT1 的表達水平較相對正常的對照組均呈低表達，而 SIRT1 在年輕夾層患者中的作用機制需要進一步驗證。
SIRT1 對主動脈夾層的發生發展起著重要作用，研究 SIRT1 在主動脈夾層疾病中的作用機制有望為 A 型主動脈夾層的治療與篩查提供新思路。
利益沖突：無。
作者貢獻：張文負責實驗操作，文章初稿撰寫，數據整理與分析；谷天祥負責審閱、修改論文，經費支持。
A 型主動脈夾層指主動脈腔內的高壓血流從主動脈內膜撕裂口進入主動脈中膜，使中膜分離，并沿主動脈長軸方向擴展，從而導致主動脈真假兩腔的一種病理學改變，是心臟外科急診中十分兇險的疾病[1]。目前，主動脈夾層的病因仍不明確。流行病學調查[2]指出，65 歲以上的人群主動脈夾層發生率較高，這說明衰老是主動脈夾層的危險因素之一。然而，臨床上 A 型主動脈夾層患者年輕化也成為一種趨勢。所以年齡和主動脈夾層之間各機制的作用關系還有待研究。
作為一種公認的長壽因子，Sirtuin1（SIRT1）在心血管疾病中起著重要作用。研究[3-4]指出，SIRT1 在血管中的表達隨著年齡的增長而降低，但 SIRT1 在主動脈夾層血管中是否也具有年齡依賴性還有待研究。為此，我們研究了不同年齡主動脈夾層患者主動脈壁中 SIRT1 表達是否有差異，為將來是否可將 SIRT1 作為主動脈夾層預測因子提供證據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
納入 2019—2020 年在中國醫科大學附屬第一醫院接受手術治療的 A 型主動脈夾層患者為夾層組，行冠狀動脈（冠脈）旁路移植術的冠脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）患者為對照組。經胸腹主動脈 CT 血管造影（CT angiography，CTA）、冠脈 CTA 等影像學檢查，明確主動脈夾層的診斷。排除馬方綜合征患者或者其他遺傳性血管疾病患者。<45 歲的患者納入低年齡組，45～60 歲的患者納入中年齡組，>60 歲的患者納入高年齡組。患者臨床資料見表 1。
表1
各組患者臨床資料比較［例（%）/］
1.2 組織樣本的收集與存儲
所有樣本均為術中收集的新鮮主動脈壁組織，其中對照組取冠脈旁路移植術時主動脈打孔處的主動脈壁組織，于無酶標本袋中編號后，通過液氮罐轉移至?80℃ 超低溫冰箱保存。
1.3 實驗主要試劑
主要試劑包括：SIRT1 mRNA 引物及內參基因 GAPDH （上海生工）、反轉錄試劑（TAKARA 公司）、SIRT1 抗體（CST 公司）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）抗體（萬類生物）、BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、一抗稀釋液等（上海碧云天）。
1.4 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）
取黃豆大小的組織，液氮研磨后采用 TRIZOL 法提取組織總 RNA，去 DNA 反應后通過反轉錄得到 cDNA 溶液，實驗設置 3 個復孔，采用 Thermal Cycler DiceTM Real Time 進行 qRT-PCR 反應，得到 CT 值，并計算 2?ΔΔCT 值。
1.5 Western blotting 檢測
取黃豆大小組織，組織勻漿后采用 RIPA Lysis Buffer 提取組織總蛋白，通過 BCA 蛋白質測定試劑盒定量總蛋白質濃度。根據目標蛋白的相對分子質量選擇對應濃度的分離膠（8%分離膠：SIRT1；10%分離膠：MCP-1、GAPDH），濃縮膠均為 5%濃度。電泳后，將蛋白質轉移到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉封閉后，將膜與一抗在 4℃ 條件下孵育 24 h（SIRT1，1∶1000；MCP-1，1∶500）。洗膜后，孵育二抗，最后采用化學發光試劑顯色。通過 Micro.Chemi 化學發光型凝膠成像系統進行圖像采集。運用 Image J 軟件計算上述蛋白的平均光密度值，將各組平均光密度值除以內參蛋白 GAPDH 的平均光密度值獲取各目標蛋白的相對表達量。
1.6 免疫組織化學染色
通過免疫組織化學染色檢測主動脈壁組織中 SIRT1 蛋白的表達。4% 多聚甲醛固定組織后，OCT 包埋，制作冰凍切片。用 3% 的過氧化氫消除內源性過氧化物酶的活性，10% 正常山羊血清封閉，一抗孵育過夜（SIRT1，1∶500），PBS 洗片后滴加二抗工作液，然后顯色劑顯色，蘇木素復染，流水沖洗 1 min 后鹽酸酒精分化數秒，酒精梯度脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。
1.7 統計學分析
采用 SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）描述，組間比較采用one-way ANOVA 分析。計數資料以頻數（%）描述，組間比較采用χ2檢驗。 P≤0.05 為差異有統計學意義。
1.8 倫理審查
本研究經中國醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審核批準，批準號：[2018]2018-149-2。
2 結果
2.1 SIRT1 mRNA 的表達
夾層組患者的 SIRT1 mRNA 表達量比對照組低，差異有統計學意義（P<0.001）。同時，SIRT1 mRNA 表達量在主動脈夾層患者中隨年齡的增長呈下降趨勢，差異有統計學意義（P<0.01）；見表2。
表2
各組患者 SIRT1 和 MCP-1 表達量比較（）
2.2 SIRT1 及 MCP-1 蛋白的表達
通過 Western blotting 檢測各組 SIRT1 和 MCP-1 的蛋白表達。與對照組相比，SIRT1 蛋白在主動脈夾層樣本中低表達（P<0.01）；與低年齡夾層患者相比，SIRT1 蛋白在中年齡和高年齡夾層患者樣本中表達降低，差異有統計學意義（P<0.01）。在低年齡和中年齡患者樣本中，夾層組 MCP-1 蛋白表達量較對照組多，差異有統計學意義（P<0.001）。與低年齡組相比，MCP-1 蛋白表達量在主動脈夾層患者中隨著年齡的增長呈上升趨勢，差異有統計學意義（P<0.001）；見圖1、表 2。通過免疫組織化學染色檢驗主動脈壁組織樣本中的 SIRT1 蛋白，結果顯示：與對照組相比，夾層組 SIRT1 表達量降低（P<0.05）；與低年齡夾層樣本相比，SIRT1 蛋白在中年齡和高年齡夾層樣本中表達量降低，差異有統計學意義（P<0.01）；見圖2、表 2。
圖1
Sirtuin1和 MCP-1 蛋白的表達情況
MCP-1：單核細胞趨化蛋白-1
圖2
SIRT1 蛋白在組織的表達情況
3 討論
主動脈夾層是一種十分兇險的心血管疾病，發病率呈逐年上升趨勢。夾層破裂前一般無明顯的癥狀和體征，夾層破裂后其主要表現通常是胸部劇烈撕裂樣疼痛，目前仍缺少有效的預防篩查措施[5]。
根據研究[3, 6-7]，SIRT1 在心血管組織中起著重要的作用，包括抑制氧化應激，減少炎癥、泡沫細胞形成，抵抗細胞衰老等。SIRT1 還能夠提高平滑肌細胞的功能，在主動脈夾層的進展過程中起作用。有研究[4]指出，隨著年齡的增長，SIRT1 的表達水平受到顯著影響。SIRT1 在年輕和年老患者中所表現出的內源性差異作用包括對細胞周期和細胞增殖的調節，這一點對主動脈夾層的進展尤為重要。但對于年輕夾層患者，SIRT1 在其主動脈壁中的表達是否降低尚無相關研究。
行冠脈旁路移植術時，主動脈壁打孔處多選在主動脈壁柔軟有彈性處，盡量避免選取鈣化等粥樣硬化改變的部位，所以本研究選取這部分組織作為對照組。尤其對于年輕的冠心病患者，其主動脈壁可以看作是正常的主動脈壁組織。測定這部分組織的 SIRT1 表達可以一定程度代表此年齡段正常人的 SIRT1 表達情況。
本研究還測定了組織中 MCP-1 蛋白的表達。MCP-1 屬于 CC 趨化因子家族的一個小細胞因子，在機體炎癥時，血管平滑肌細胞可分泌 MCP-1 因子[8]。研究[9]發現，MCP-1 在動脈粥樣硬化過程中發揮重要作用，且 SIRT1 和 MCP-1 之間存在負性調控關系。SIRT1 可通過多個信號通路抑制 MCP-1 的表達，包括 NF-κB/SIRT1/AMPK 和 TNF-α/SIRT1/MCP-1 等信號通路[10-11]。本研究中，與對照組比較，夾層組中所有年齡段患者SIRT1均呈低表達，MCP-1在低年齡組及中年齡組夾層患者呈高表達趨勢，而在高年齡夾層患者中無表達增高。我們推測其可能的原因是：隨著年齡的增長，主動脈出現脂質斑塊、鈣化等粥樣硬化改變的幾率增加，MCP-1在粥樣硬化組織中表達增高[9]，所以高年齡組中，即使不存在主動脈夾層改變，其MCP-1的表達也可能升高，因此兩組差異無統計學意義。在低年齡組及中年齡組中，主動脈壁組織脂質沉積、粥樣硬化的幾率較低，其MCP-1的表達主要受SIRT1調控，提示主動脈夾層發生發展中炎性反應可能發揮重要作用。
相關研究[8]指出，主動脈夾層患者主動脈壁組織的 SIRT1 較周圍相對正常的血管呈低表達趨勢。但在 A 型主動脈夾層中，SIRT1 在高齡患者和年輕患者中是否有表達差異尚無相關研究。本研究首次從 mRNA 和蛋白質學層面分析了在 A 型主動脈夾層中，人體主動脈壁組織 SIRT1 在不同年齡的表達情況。實驗結果表明，在主動脈夾層組織中，SIRT1 的表達具有年齡相關性，即高齡夾層患者的 SIRT1 表達水平較低年齡夾層患者低。但是無論低齡還是高齡夾層患者，SIRT1 的表達水平較相對正常的對照組均呈低表達，而 SIRT1 在年輕夾層患者中的作用機制需要進一步驗證。
SIRT1 對主動脈夾層的發生發展起著重要作用，研究 SIRT1 在主動脈夾層疾病中的作用機制有望為 A 型主動脈夾層的治療與篩查提供新思路。
利益沖突：無。
作者貢獻：張文負責實驗操作，文章初稿撰寫，數據整理與分析；谷天祥負責審閱、修改論文，經費支持。
