引用本文： 楊泉林, 劉歡, 單艷, 朱黎鳴, 孫曉寧, 楊曄, 王文碩, 魏來, 王春生. 二葉式主動脈瓣畸形大動物模型的建立. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2022, 29(11): 1485-1491. doi: 10.7507/1007-4848.202202052 復制
二葉式主動脈瓣畸形（bicuspid aortic valve，BAV）是最常見的先天性心血管疾病，總體人群中的發病率高達0.5%～2.0%，男女比例約為2∶1[1]。BAV合并主動脈擴張時稱為二葉式主動脈病（bicuspid aortopathy，BA），易發展為主動脈瘤、夾層和破裂，導致嚴重并發癥甚至猝死[2]。超過一半的BAV患者需手術干預或密切隨訪升主動脈擴張，因此BAV已成為重要的疾病負擔[3]。關于BA的發病機制，長久以來一直存在遺傳學和血流動力學假說的爭論。近年來，利用4D-Flow 磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技術已經觀察到BA患者中存在升主動脈內壁面切應力（wall shear stress，WSS）的增高[4]。到底是遺傳學上的內在因素還是瓣膜相關的局部血流動力學和切應力異常造成了主動脈擴張，目前缺乏科學的論證[5]，這種現狀的部分原因是缺乏理想的模式動物將上述兩種因素分開，從而從單純的某一角度進行實驗研究。本研究通過外科手術縫合相鄰瓣葉的方法構建豬的“功能性”BAV模型，使其僅具備BAV的形態學特點和血流動力學變化，而沒有遺傳背景的改變。并通過4D-Flow MRI驗證動物模型主動脈內局部異常增高的WSS[6-9]。該方法可以避免遺傳因素的影響，為下一步從純粹的血流動力學角度探討BAV患者WSS促進主動脈基質重構和擴張的作用機制提供平臺。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選擇2～3月齡普通級上海白豬4頭，體重50～55 kg，雌雄不限。所選動物由上海市甲干生物科技有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2020-0006，經檢驗符合上海市實驗動物質量合格標準。實驗地點為銀蛇（上海）醫療科技有限共公司，實驗動物使用許可證號SYXK（滬）2017-0001。實驗動物入選標準：術前不合并有任何心臟疾病及解剖異常。
1.2 建立動物模型
1.2.1 術前準備
術前在飼養間觀察1周，飼養間每日沖洗3～6次，每日多次噴灑消毒水，期間進行滅蟲處理。并行超聲心動圖檢查確定實驗動物主動脈瓣形態、大小、流速、跨瓣壓差等，排除不正常動物。必要時可于術前1周開始按體重的0.6%頸內靜脈穿刺取血行血液儲備，采血后充分補充營養。
1.2.2 麻醉前準備
術前12 h禁食，8 h禁水。術前使用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮（舒泰）1 mL/10 kg誘導麻醉，待動物鎮靜后，于耳緣靜脈留置靜脈套管針。麻醉起效后（當出現肌肉緊張度下降、活動減少、角膜反射減退后停止給藥），溫肥皂水清洗消毒，于前胸、頸部、腹股溝區備皮后，將實驗動物四肢固定并仰臥位于手術臺上，連接心電監護儀，右側股動脈穿刺置管接有創血壓監測，必要時留置導尿管。通過動物尾部皮膚進行經皮血氧飽和度監測。
1.2.3 麻醉和體外循環
行氣管內插管，調整插管深度合適后用繃帶固定。調整呼吸機參數，潮氣量8～10 mL/kg，呼吸頻率15次/min，吸入氧濃度50%，吸呼比1∶2。麻醉維持采用麻醉機持續吸入2%～4%（體積比）異氟烷，留置鼻溫、肛溫探頭。術中使用腎上腺素和去甲腎上腺素維持血壓、心率，必要時使用利多卡因控制室性早搏。靜脈注射肝素3 mg/kg，全身肝素化，活化凝血時間（activated clotting time，ACT）＞480 s后插升主動脈、腔房管、冷灌注管建立體外循環，降溫至30℃，阻斷升主動脈常規灌注停跳液（Del Nido液）。體外循環結束拔除靜脈引流后以4.5 mg/kg魚精蛋白中和肝素。術中接自體血回輸裝置。
1.3 手術
常規消毒，鋪巾，經胸骨正中入路，切開皮膚及皮下組織，正中劈開胸骨，倒T形切開心包，提吊心包顯露心臟，充分暴露心臟及大血管組織。肝素化后分別在升主動脈近無名動脈及右心耳處用4-0聚丙烯縫線縫制荷包，行主動脈弓部和右心耳插管建立體外循環。經升主動脈近端置入Y型灌注針，全身降溫后升主動脈阻斷經Y針順行性灌注停跳液。灌注完成后拔除Y型針，在主動脈前壁切開升主動脈，以6-0聚丙烯縫線連續縫合左右冠瓣對合緣，造成二瓣化形態；見圖1。關閉主動脈切口后排氣開放升主動脈，復溫，有心室顫動發生時立即使用電除顫復律，同時恢復機械通氣，調整酸堿度和電解質情況，逐步撤除體外循環，拔除插管并常規止血關胸，放置心包縱隔引流管后以鋼絲縫合胸骨。
圖1
連續縫合對合左右冠瓣瓣葉
主動脈瓣顯露滿意，以6-0聚丙烯縫線連續縫合左右冠瓣造成豬的主動脈瓣二瓣化形態
1.4 圍術期管理
1.4.1 術后一般處理
術后密切監測生命體征，待呼吸良好、體動反應劇烈后拔除氣管插管，面罩給氧2～4 h后返回飼養間，置于不銹鋼飼養籠內。維持室溫在25～28℃。術后及時給予鎮靜鎮痛等對癥處理。1周內每天靜脈滴注頭孢曲松2 g預防感染治療。每天以紫外線照射消毒房間。手術當天主要補充極化液，視引流量、尿量控制液體出入。如引流液較多，可給予羥乙基淀粉擴容。術后第1 d適當輸液并給予流質（糖+少量鹽水），入量控制在2 500 mL，防止容量過多引起心力衰竭。術后第2 d給予半流質（大米煮粥+食鹽菜泥），并額外增加1個雞蛋提高食欲，補充營養。第3 d起基本可以進行飼料飼養。引流量<100 mL/d后可拔除引流管。
1.4.2 呼吸系統管理
豬由于咽喉部狹長，氣道分泌物較多，容易造成氣道梗阻。同時，體外循環過程中引起的應激反應及全身炎癥反應可造成肺組織損傷，肺泡通透性增加，手術出血及體外循環導致血液稀釋，膠體滲透壓降低，最終導致術后肺組織滲出增多。因此，圍術期呼吸道管理十分重要，術中嚴密止血，術后盡早拔除引流管，必要時可通過及時輸血、補充膠體和利尿等來提高膠體滲透壓，防止肺間質水腫。
1.4.3 循環系統管理
豬脂肪比重大，有效循環容量較少，因此對失血更敏感，在建模過程中，失血性休克是造成動物預后不良的重要因素。術中采用較大比例的膠體預充，晶膠比1.0∶1.5左右，術后積極補充代血漿擴充血容量，對減少肺及組織水腫有重要作用。據研究，豬的血型較復雜，共15種，輸血前行血型鑒定及交叉配血較困難，但輸血后大約3～10 d后出現抗體，故初次輸血大多安全。由于豬的自我修復能力較強，失血后可促進骨髓造血功能，因此亦可采用術前1周按體重0.6%采血備用，術中自體血回輸的方法，對保證動物模型的順利建立起關鍵性作用。若術后早期出血較多，在保證引流液無菌的前提下，可將引流液加入抗生素后回輸入動物體內。
1.4.4 感染的防治及抗凝策略
圍術期中各個環節加強無菌保護是預防術后感染，保證實驗動物術后存活的重要環節。主要措施有：（1）術前單獨飼養，觀察1周，飼養間每日沖洗、多次噴灑消毒水，對動物進行滅蟲處理；（2）手術前1 d手術間和飼養間使用紫外線照射消毒，所有重復使用的手術器械術前均在2%戊二醛浸泡10 h以上；（3）術前半小時及術后1周內預防性使用抗生素，靜脈滴注足量抗生素預防感染。目前國內外尚無類似動物模型建立的報道，術后是否進行抗凝無定論。有學者測得豬的國際標準化比值為1.06±0.19，考慮到對主動脈瓣進行縫合存在血栓形成的可能，術后每日予阿司匹林100 mg+華法林抗凝，控制國際標準化比值在1.5～2.0。
1.5 觀察項目
1.5.1 超聲心動圖
選用Sonosite M-Turbo便攜式彩色超聲機，超聲探頭為P21x，探頭頻率4～8 MHz。實驗動物術前及術后2周、3個月在鎮靜下分別探查左心室長軸、心尖部四腔心和主動脈根部短軸切面，測量主動脈瓣口的血流速度、跨瓣壓差及瓣口面積等。
1.5.2 4D-Flow MRI
術后3個月（此時主動脈瓣葉縫合處纖維化完成，瓣葉融合的形態基本上已穩定）行4D-Flow MRI檢查，了解主動脈內WSS變化情況，當升主動脈內收縮期出現WSS增高，與正常值之差>0.3 Pa，確認建模成功。具體檢查條件如下：所有豬均在3.0 T MRI（Ingenia CX，Philips Healthcare，Best，Netherlands）上進行非增強胸主動脈4D-Flow序列掃描，采用32通道體部線圈。應用心電門控及呼吸門控，采集整個心動周期胸主動脈4D-Flow數據。掃描參數如下：速率編碼200 cm/s，時間分辨率38～41 ms，空間分辨率2.5×2.5×2.5 mm3，視野350×250×100 mm3，回波時間/重復時間=2.85/48.56 ms，翻轉角 7°。每次掃描時間約8～12 min，具體時間取決于豬的心率、呼吸模式和呼吸門控效率。采用Vel-Wall法計算WSS，該方法是通過圖像識別來估計管壁位置并結合PC-MRI流速數據計算WSS。掃描所得原始數據采用cvi42軟件（Version 5.13，Circle Cardiovascular Imaging，Calgary，AB，Canada）進行重建和分析。
1.6 倫理審查
本研究已通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會審核批準，審批號：Y2018-008。本研究符合本單位動物實驗委員會所制訂的倫理學標準。
2 結果
2.1 超聲心動圖檢查結果
所有動物術后均恢復順利，無明顯術后并發癥。共構建出豬“功能性”BAV模型4個，總成功率100.0%。術后2周對4頭豬行超聲心動圖檢查，主動脈瓣開放及關閉均未見明顯異常，均未見瓣膜血栓形成。術后超聲心動圖可見主動脈瓣左右冠瓣之間假脊形態形成，符合BAV改變，且手術后主動脈瓣瓣口峰值流速較前加快；見圖2。跨瓣壓差及瓣口面積分別較術前略有增加和減少，但未構成主動脈瓣狹窄。主動脈瓣關閉不全程度在2+（輕度）或以下，左心室大小和收縮功能無明顯改變，升主動脈直徑較前有所增加。以2號實驗動物為例，術前、術后2周及術后3個月超聲心動圖所得血流動力學及心臟結構參數見表1。
圖2
術后超聲心動圖
a：術后超聲心動圖主動脈短軸切面提示主動脈瓣左右冠瓣間假脊形成（箭頭）；b：術后超聲心動圖主動脈長軸切面測量主動脈瓣瓣口峰值流速較前加快；L：左冠瓣；R：右冠瓣
表1
2號實驗動物術前、術后2周及術后3個月超聲心動圖資料
2.2 4D-Flow MRI檢測結果
4D-Flow MRI檢測結果提示實驗動物術后升主動脈及降主動脈內血流速度較術前增快。以4號實驗動物為例，主動脈內血流速度>1.4 m/s顯示為紅色；見圖3。4D-Flow MRI檢查結果提示實驗動物術后升主動脈及降主動脈內WSS較術前顯著增高。以4號實驗動物為例，主動脈內WSS超過1.36 Pa顯示為紅色；見圖4。
圖3
4D-Flow磁共振成像檢測升主動脈及降主動脈內血流速度
圖4
4D-Flow磁共振成像檢測升主動脈及降主動脈內壁面切應力
3 討論
雖然目前指南或研究[10-11]推薦升主動脈直徑超過45 mm應同期進行置換從而避免不良轉歸，最新研究[12]結果也表明，使用保留瓣膜的根部置換可以有效治療BA患者，然而臨床實踐中以主動脈直徑和常規影像學方法為基礎的評估方法存在極大的局限性，無法對患者發生主動脈并發癥的風險進行準確的個性化評估[13]。因此，臨床上亟需能在術前或術中對BAV患者的主動脈進行個體化危險分層的方法。
BAV患者瓣葉融合的表型不同會伴隨不同的主動脈病變風險。研究[14-15]表明，左右冠瓣融合（1型L/R）是BAV最常見的表型，最容易造成升主動脈的非對稱性擴張，這與升主動脈內增高的WSS關系最密切[16-17]，我們著重研究這一表型。
通過4D-Flow MRI，BAV患者主動脈內局部異常增高的WSS可以被精準和直觀地展現出來[18-19]。有研究[20]發現，BAV患者主動脈內部增高的WSS會造成細胞外基質調節異常［表現為基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和轉化生長因子-β1表達的異常］以及彈力纖維的退化。而MMPs分子中與主動脈基質重構關系最密切的是MMP-2和MMP-9[21]。WSS可能正是通過這些分子的介導促進了主動脈基質的重構，引起了主動脈壁基質成分和含量的變化，并進一步引起主動脈擴張[22]。因此，我們認為WSS可以獨立于遺傳因素，通過這些分子介導，最終促進主動脈壁基質重構和主動脈擴張。然而，由于其遺傳的復雜性，目前沒有可靠的基因修飾BAV的動物模型。通過手術縫合左右冠瓣瓣葉的方法構建豬的BAV模型，可以完全避免遺傳因素的影響，下一步可通過對動物模型主動脈組織內MMP-2和MMP-9的轉錄和表達水平測定，可進一步探討BAV患者WSS促進主動脈基質重構和擴張的作用機制，為單純探討WSS促進主動脈基質重構和擴張的機制提供平臺。
作為心血管大動物實驗選擇的理想對象，豬的心臟在解剖、血流動力學、病理生理等特點上同人體較接近，主動脈瓣及升主動脈結構和位置同人體接近，因此適合建立能真實模擬BAV的動物模型，探討BAV患者WSS促進主動脈基質重構和擴張的作用機制并提供一些對臨床研究有參考價值的實驗數據[23]。由于體外循環手術對動物的創傷仍較大，建議使用體重50 kg以上的豬，其心臟大小、血管粗細與成人相似，手術操作較為熟練，縮短手術時間，同時動物的耐受性較好，從而提高成功率。
常規心臟手術多采用平臥位，正中開胸過程中，我們發現豬的胸骨較人體窄，而上段特別是胸骨角處較人體明顯增厚。通過肋間隙定位好胸骨中線，沿胸骨中線使用開胸電鋸開胸，劈開上段胸骨時改為使用傳統胸骨刀更易劈開胸骨。避免劈歪胸骨導致胸骨骨折，甚至損傷乳內動脈，更重要的是影響術野顯露，增加術中操作難度，影響術后止血效果。
在游離組織時應注意盡可能減輕損傷，減少出血量，必要時應用電刀電凝止血，保持切口干燥，由于豬的左右胸腔是相通的，且較薄，開胸時盡量避免損傷胸膜，造成胸膜的密閉結構破壞，導致氣胸等呼吸道并發癥。另外，與人體心臟體外循環手術類似，進胸后通過適當心包提吊可以獲得較好的術野顯露。體外循環過程中若氧合器血平面難以維持，應警惕有血液漏入胸腔可能，需及時吸出胸腔內積血。
我們在操作過程中發現豬的升主動脈與人相比較細且短，位置較深，外科操作難度較臨床手術大。我們通過實踐摸索的方法有利于克服操作的難度。在主動脈弓僅有兩大分支，若主動脈插管位置不當或出現切口出血極難處理。經主動脈弓部以seldinger法插入股動脈插管（Fem-FlexⅡ femoral arterial cannula，Edwards Lifescience，Irvine，CA，USA）能夠達到滿意的灌注效果。主動脈阻斷的位置應盡量靠近遠端，為切開升主動脈近端保留足夠空間。升主動脈遠端需游離、套帶，以保證完全阻斷。因此操作時需充分向上游離升主動脈，導絲引導法，穿刺升主動脈置入導絲，擴張后引入升主動脈插管，此法成功率高、安全、可靠且穩定。左心的回血會對顯露造成極大影響，術后左房壓力過高容易導致心臟復跳困難，發生頑固性心室顫動，甚至無法順利停機。我們發現豬的心臟較人稍稍左旋，左心房較不易暴露，采用右上肺靜脈入路可能比左心耳入路更易操作，同時可避免損傷二尖瓣。主動脈瓣三個交界的牽引線可改善顯露。縫合主動脈瓣瓣葉時應避免針距過大造成瓣葉縮短限制主動脈瓣的對合，導致主動脈瓣關閉不全。同時，應避免縫合的組織過多造成瓣葉僵硬開放受限，導致主動脈瓣狹窄。
心臟超聲結果顯示，建模后主動脈瓣口血流速度略增快，未見瓣口明顯狹窄或跨瓣壓差顯著增大，無2+以上主動脈瓣關閉不全。另外在術后3個月，我們通過心臟超聲觀察到部分模式動物的升主動脈直徑較前增寬，表明升主動脈擴張與血流動力學改變可能存在關系，該結論仍有待于進一步研究。
目前國內外尚無建立“功能性”BAV大動物模型的報道[24]。本實驗中模式動物的心臟結構穩定，確定了模型的可靠性。在此基礎上，我們摸索出了對豬進行4D-Flow MRI檢查的方法。正常豬的主動脈內WSS平均值為0.2～0.3 Pa[25]。本實驗中模式動物術后升主動脈內WSS達到了1.3 Pa以上，已明顯高于正常動物，因此可得出模型構建成功的結論。
本研究對手術過程進行優化，獲得了滿意的動物模型及成熟、穩定的建模方法，能高度模擬BAV的解剖結構，避免了遺傳因素的影響，可為BA發生機制的進一步研究提供條件。
利益沖突：無。
作者貢獻：楊泉林、劉歡、單艷、朱黎鳴負責實驗操作，論文初稿撰寫；楊曄、王文碩負責數據整理與分析；劉歡、單艷、孫曉寧、魏來、王春生負責論文設計、審閱、修改，經費支持。
二葉式主動脈瓣畸形（bicuspid aortic valve，BAV）是最常見的先天性心血管疾病，總體人群中的發病率高達0.5%～2.0%，男女比例約為2∶1[1]。BAV合并主動脈擴張時稱為二葉式主動脈病（bicuspid aortopathy，BA），易發展為主動脈瘤、夾層和破裂，導致嚴重并發癥甚至猝死[2]。超過一半的BAV患者需手術干預或密切隨訪升主動脈擴張，因此BAV已成為重要的疾病負擔[3]。關于BA的發病機制，長久以來一直存在遺傳學和血流動力學假說的爭論。近年來，利用4D-Flow 磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技術已經觀察到BA患者中存在升主動脈內壁面切應力（wall shear stress，WSS）的增高[4]。到底是遺傳學上的內在因素還是瓣膜相關的局部血流動力學和切應力異常造成了主動脈擴張，目前缺乏科學的論證[5]，這種現狀的部分原因是缺乏理想的模式動物將上述兩種因素分開，從而從單純的某一角度進行實驗研究。本研究通過外科手術縫合相鄰瓣葉的方法構建豬的“功能性”BAV模型，使其僅具備BAV的形態學特點和血流動力學變化，而沒有遺傳背景的改變。并通過4D-Flow MRI驗證動物模型主動脈內局部異常增高的WSS[6-9]。該方法可以避免遺傳因素的影響，為下一步從純粹的血流動力學角度探討BAV患者WSS促進主動脈基質重構和擴張的作用機制提供平臺。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選擇2～3月齡普通級上海白豬4頭，體重50～55 kg，雌雄不限。所選動物由上海市甲干生物科技有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2020-0006，經檢驗符合上海市實驗動物質量合格標準。實驗地點為銀蛇（上海）醫療科技有限共公司，實驗動物使用許可證號SYXK（滬）2017-0001。實驗動物入選標準：術前不合并有任何心臟疾病及解剖異常。
1.2 建立動物模型
1.2.1 術前準備
術前在飼養間觀察1周，飼養間每日沖洗3～6次，每日多次噴灑消毒水，期間進行滅蟲處理。并行超聲心動圖檢查確定實驗動物主動脈瓣形態、大小、流速、跨瓣壓差等，排除不正常動物。必要時可于術前1周開始按體重的0.6%頸內靜脈穿刺取血行血液儲備，采血后充分補充營養。
1.2.2 麻醉前準備
術前12 h禁食，8 h禁水。術前使用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮（舒泰）1 mL/10 kg誘導麻醉，待動物鎮靜后，于耳緣靜脈留置靜脈套管針。麻醉起效后（當出現肌肉緊張度下降、活動減少、角膜反射減退后停止給藥），溫肥皂水清洗消毒，于前胸、頸部、腹股溝區備皮后，將實驗動物四肢固定并仰臥位于手術臺上，連接心電監護儀，右側股動脈穿刺置管接有創血壓監測，必要時留置導尿管。通過動物尾部皮膚進行經皮血氧飽和度監測。
1.2.3 麻醉和體外循環
行氣管內插管，調整插管深度合適后用繃帶固定。調整呼吸機參數，潮氣量8～10 mL/kg，呼吸頻率15次/min，吸入氧濃度50%，吸呼比1∶2。麻醉維持采用麻醉機持續吸入2%～4%（體積比）異氟烷，留置鼻溫、肛溫探頭。術中使用腎上腺素和去甲腎上腺素維持血壓、心率，必要時使用利多卡因控制室性早搏。靜脈注射肝素3 mg/kg，全身肝素化，活化凝血時間（activated clotting time，ACT）＞480 s后插升主動脈、腔房管、冷灌注管建立體外循環，降溫至30℃，阻斷升主動脈常規灌注停跳液（Del Nido液）。體外循環結束拔除靜脈引流后以4.5 mg/kg魚精蛋白中和肝素。術中接自體血回輸裝置。
1.3 手術
常規消毒，鋪巾，經胸骨正中入路，切開皮膚及皮下組織，正中劈開胸骨，倒T形切開心包，提吊心包顯露心臟，充分暴露心臟及大血管組織。肝素化后分別在升主動脈近無名動脈及右心耳處用4-0聚丙烯縫線縫制荷包，行主動脈弓部和右心耳插管建立體外循環。經升主動脈近端置入Y型灌注針，全身降溫后升主動脈阻斷經Y針順行性灌注停跳液。灌注完成后拔除Y型針，在主動脈前壁切開升主動脈，以6-0聚丙烯縫線連續縫合左右冠瓣對合緣，造成二瓣化形態；見圖1。關閉主動脈切口后排氣開放升主動脈，復溫，有心室顫動發生時立即使用電除顫復律，同時恢復機械通氣，調整酸堿度和電解質情況，逐步撤除體外循環，拔除插管并常規止血關胸，放置心包縱隔引流管后以鋼絲縫合胸骨。
圖1
連續縫合對合左右冠瓣瓣葉
主動脈瓣顯露滿意，以6-0聚丙烯縫線連續縫合左右冠瓣造成豬的主動脈瓣二瓣化形態
1.4 圍術期管理
1.4.1 術后一般處理
術后密切監測生命體征，待呼吸良好、體動反應劇烈后拔除氣管插管，面罩給氧2～4 h后返回飼養間，置于不銹鋼飼養籠內。維持室溫在25～28℃。術后及時給予鎮靜鎮痛等對癥處理。1周內每天靜脈滴注頭孢曲松2 g預防感染治療。每天以紫外線照射消毒房間。手術當天主要補充極化液，視引流量、尿量控制液體出入。如引流液較多，可給予羥乙基淀粉擴容。術后第1 d適當輸液并給予流質（糖+少量鹽水），入量控制在2 500 mL，防止容量過多引起心力衰竭。術后第2 d給予半流質（大米煮粥+食鹽菜泥），并額外增加1個雞蛋提高食欲，補充營養。第3 d起基本可以進行飼料飼養。引流量<100 mL/d后可拔除引流管。
1.4.2 呼吸系統管理
豬由于咽喉部狹長，氣道分泌物較多，容易造成氣道梗阻。同時，體外循環過程中引起的應激反應及全身炎癥反應可造成肺組織損傷，肺泡通透性增加，手術出血及體外循環導致血液稀釋，膠體滲透壓降低，最終導致術后肺組織滲出增多。因此，圍術期呼吸道管理十分重要，術中嚴密止血，術后盡早拔除引流管，必要時可通過及時輸血、補充膠體和利尿等來提高膠體滲透壓，防止肺間質水腫。
1.4.3 循環系統管理
豬脂肪比重大，有效循環容量較少，因此對失血更敏感，在建模過程中，失血性休克是造成動物預后不良的重要因素。術中采用較大比例的膠體預充，晶膠比1.0∶1.5左右，術后積極補充代血漿擴充血容量，對減少肺及組織水腫有重要作用。據研究，豬的血型較復雜，共15種，輸血前行血型鑒定及交叉配血較困難，但輸血后大約3～10 d后出現抗體，故初次輸血大多安全。由于豬的自我修復能力較強，失血后可促進骨髓造血功能，因此亦可采用術前1周按體重0.6%采血備用，術中自體血回輸的方法，對保證動物模型的順利建立起關鍵性作用。若術后早期出血較多，在保證引流液無菌的前提下，可將引流液加入抗生素后回輸入動物體內。
1.4.4 感染的防治及抗凝策略
圍術期中各個環節加強無菌保護是預防術后感染，保證實驗動物術后存活的重要環節。主要措施有：（1）術前單獨飼養，觀察1周，飼養間每日沖洗、多次噴灑消毒水，對動物進行滅蟲處理；（2）手術前1 d手術間和飼養間使用紫外線照射消毒，所有重復使用的手術器械術前均在2%戊二醛浸泡10 h以上；（3）術前半小時及術后1周內預防性使用抗生素，靜脈滴注足量抗生素預防感染。目前國內外尚無類似動物模型建立的報道，術后是否進行抗凝無定論。有學者測得豬的國際標準化比值為1.06±0.19，考慮到對主動脈瓣進行縫合存在血栓形成的可能，術后每日予阿司匹林100 mg+華法林抗凝，控制國際標準化比值在1.5～2.0。
1.5 觀察項目
1.5.1 超聲心動圖
選用Sonosite M-Turbo便攜式彩色超聲機，超聲探頭為P21x，探頭頻率4～8 MHz。實驗動物術前及術后2周、3個月在鎮靜下分別探查左心室長軸、心尖部四腔心和主動脈根部短軸切面，測量主動脈瓣口的血流速度、跨瓣壓差及瓣口面積等。
1.5.2 4D-Flow MRI
術后3個月（此時主動脈瓣葉縫合處纖維化完成，瓣葉融合的形態基本上已穩定）行4D-Flow MRI檢查，了解主動脈內WSS變化情況，當升主動脈內收縮期出現WSS增高，與正常值之差>0.3 Pa，確認建模成功。具體檢查條件如下：所有豬均在3.0 T MRI（Ingenia CX，Philips Healthcare，Best，Netherlands）上進行非增強胸主動脈4D-Flow序列掃描，采用32通道體部線圈。應用心電門控及呼吸門控，采集整個心動周期胸主動脈4D-Flow數據。掃描參數如下：速率編碼200 cm/s，時間分辨率38～41 ms，空間分辨率2.5×2.5×2.5 mm3，視野350×250×100 mm3，回波時間/重復時間=2.85/48.56 ms，翻轉角 7°。每次掃描時間約8～12 min，具體時間取決于豬的心率、呼吸模式和呼吸門控效率。采用Vel-Wall法計算WSS，該方法是通過圖像識別來估計管壁位置并結合PC-MRI流速數據計算WSS。掃描所得原始數據采用cvi42軟件（Version 5.13，Circle Cardiovascular Imaging，Calgary，AB，Canada）進行重建和分析。
1.6 倫理審查
本研究已通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會審核批準，審批號：Y2018-008。本研究符合本單位動物實驗委員會所制訂的倫理學標準。
2 結果
2.1 超聲心動圖檢查結果
所有動物術后均恢復順利，無明顯術后并發癥。共構建出豬“功能性”BAV模型4個，總成功率100.0%。術后2周對4頭豬行超聲心動圖檢查，主動脈瓣開放及關閉均未見明顯異常，均未見瓣膜血栓形成。術后超聲心動圖可見主動脈瓣左右冠瓣之間假脊形態形成，符合BAV改變，且手術后主動脈瓣瓣口峰值流速較前加快；見圖2。跨瓣壓差及瓣口面積分別較術前略有增加和減少，但未構成主動脈瓣狹窄。主動脈瓣關閉不全程度在2+（輕度）或以下，左心室大小和收縮功能無明顯改變，升主動脈直徑較前有所增加。以2號實驗動物為例，術前、術后2周及術后3個月超聲心動圖所得血流動力學及心臟結構參數見表1。
圖2
術后超聲心動圖
a：術后超聲心動圖主動脈短軸切面提示主動脈瓣左右冠瓣間假脊形成（箭頭）；b：術后超聲心動圖主動脈長軸切面測量主動脈瓣瓣口峰值流速較前加快；L：左冠瓣；R：右冠瓣
表1
2號實驗動物術前、術后2周及術后3個月超聲心動圖資料
2.2 4D-Flow MRI檢測結果
4D-Flow MRI檢測結果提示實驗動物術后升主動脈及降主動脈內血流速度較術前增快。以4號實驗動物為例，主動脈內血流速度>1.4 m/s顯示為紅色；見圖3。4D-Flow MRI檢查結果提示實驗動物術后升主動脈及降主動脈內WSS較術前顯著增高。以4號實驗動物為例，主動脈內WSS超過1.36 Pa顯示為紅色；見圖4。
圖3
4D-Flow磁共振成像檢測升主動脈及降主動脈內血流速度
圖4
4D-Flow磁共振成像檢測升主動脈及降主動脈內壁面切應力
3 討論
雖然目前指南或研究[10-11]推薦升主動脈直徑超過45 mm應同期進行置換從而避免不良轉歸，最新研究[12]結果也表明，使用保留瓣膜的根部置換可以有效治療BA患者，然而臨床實踐中以主動脈直徑和常規影像學方法為基礎的評估方法存在極大的局限性，無法對患者發生主動脈并發癥的風險進行準確的個性化評估[13]。因此，臨床上亟需能在術前或術中對BAV患者的主動脈進行個體化危險分層的方法。
BAV患者瓣葉融合的表型不同會伴隨不同的主動脈病變風險。研究[14-15]表明，左右冠瓣融合（1型L/R）是BAV最常見的表型，最容易造成升主動脈的非對稱性擴張，這與升主動脈內增高的WSS關系最密切[16-17]，我們著重研究這一表型。
通過4D-Flow MRI，BAV患者主動脈內局部異常增高的WSS可以被精準和直觀地展現出來[18-19]。有研究[20]發現，BAV患者主動脈內部增高的WSS會造成細胞外基質調節異常［表現為基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和轉化生長因子-β1表達的異常］以及彈力纖維的退化。而MMPs分子中與主動脈基質重構關系最密切的是MMP-2和MMP-9[21]。WSS可能正是通過這些分子的介導促進了主動脈基質的重構，引起了主動脈壁基質成分和含量的變化，并進一步引起主動脈擴張[22]。因此，我們認為WSS可以獨立于遺傳因素，通過這些分子介導，最終促進主動脈壁基質重構和主動脈擴張。然而，由于其遺傳的復雜性，目前沒有可靠的基因修飾BAV的動物模型。通過手術縫合左右冠瓣瓣葉的方法構建豬的BAV模型，可以完全避免遺傳因素的影響，下一步可通過對動物模型主動脈組織內MMP-2和MMP-9的轉錄和表達水平測定，可進一步探討BAV患者WSS促進主動脈基質重構和擴張的作用機制，為單純探討WSS促進主動脈基質重構和擴張的機制提供平臺。
作為心血管大動物實驗選擇的理想對象，豬的心臟在解剖、血流動力學、病理生理等特點上同人體較接近，主動脈瓣及升主動脈結構和位置同人體接近，因此適合建立能真實模擬BAV的動物模型，探討BAV患者WSS促進主動脈基質重構和擴張的作用機制并提供一些對臨床研究有參考價值的實驗數據[23]。由于體外循環手術對動物的創傷仍較大，建議使用體重50 kg以上的豬，其心臟大小、血管粗細與成人相似，手術操作較為熟練，縮短手術時間，同時動物的耐受性較好，從而提高成功率。
常規心臟手術多采用平臥位，正中開胸過程中，我們發現豬的胸骨較人體窄，而上段特別是胸骨角處較人體明顯增厚。通過肋間隙定位好胸骨中線，沿胸骨中線使用開胸電鋸開胸，劈開上段胸骨時改為使用傳統胸骨刀更易劈開胸骨。避免劈歪胸骨導致胸骨骨折，甚至損傷乳內動脈，更重要的是影響術野顯露，增加術中操作難度，影響術后止血效果。
在游離組織時應注意盡可能減輕損傷，減少出血量，必要時應用電刀電凝止血，保持切口干燥，由于豬的左右胸腔是相通的，且較薄，開胸時盡量避免損傷胸膜，造成胸膜的密閉結構破壞，導致氣胸等呼吸道并發癥。另外，與人體心臟體外循環手術類似，進胸后通過適當心包提吊可以獲得較好的術野顯露。體外循環過程中若氧合器血平面難以維持，應警惕有血液漏入胸腔可能，需及時吸出胸腔內積血。
我們在操作過程中發現豬的升主動脈與人相比較細且短，位置較深，外科操作難度較臨床手術大。我們通過實踐摸索的方法有利于克服操作的難度。在主動脈弓僅有兩大分支，若主動脈插管位置不當或出現切口出血極難處理。經主動脈弓部以seldinger法插入股動脈插管（Fem-FlexⅡ femoral arterial cannula，Edwards Lifescience，Irvine，CA，USA）能夠達到滿意的灌注效果。主動脈阻斷的位置應盡量靠近遠端，為切開升主動脈近端保留足夠空間。升主動脈遠端需游離、套帶，以保證完全阻斷。因此操作時需充分向上游離升主動脈，導絲引導法，穿刺升主動脈置入導絲，擴張后引入升主動脈插管，此法成功率高、安全、可靠且穩定。左心的回血會對顯露造成極大影響，術后左房壓力過高容易導致心臟復跳困難，發生頑固性心室顫動，甚至無法順利停機。我們發現豬的心臟較人稍稍左旋，左心房較不易暴露，采用右上肺靜脈入路可能比左心耳入路更易操作，同時可避免損傷二尖瓣。主動脈瓣三個交界的牽引線可改善顯露。縫合主動脈瓣瓣葉時應避免針距過大造成瓣葉縮短限制主動脈瓣的對合，導致主動脈瓣關閉不全。同時，應避免縫合的組織過多造成瓣葉僵硬開放受限，導致主動脈瓣狹窄。
心臟超聲結果顯示，建模后主動脈瓣口血流速度略增快，未見瓣口明顯狹窄或跨瓣壓差顯著增大，無2+以上主動脈瓣關閉不全。另外在術后3個月，我們通過心臟超聲觀察到部分模式動物的升主動脈直徑較前增寬，表明升主動脈擴張與血流動力學改變可能存在關系，該結論仍有待于進一步研究。
目前國內外尚無建立“功能性”BAV大動物模型的報道[24]。本實驗中模式動物的心臟結構穩定，確定了模型的可靠性。在此基礎上，我們摸索出了對豬進行4D-Flow MRI檢查的方法。正常豬的主動脈內WSS平均值為0.2～0.3 Pa[25]。本實驗中模式動物術后升主動脈內WSS達到了1.3 Pa以上，已明顯高于正常動物，因此可得出模型構建成功的結論。
本研究對手術過程進行優化，獲得了滿意的動物模型及成熟、穩定的建模方法，能高度模擬BAV的解剖結構，避免了遺傳因素的影響，可為BA發生機制的進一步研究提供條件。
利益沖突：無。
作者貢獻：楊泉林、劉歡、單艷、朱黎鳴負責實驗操作，論文初稿撰寫；楊曄、王文碩負責數據整理與分析；劉歡、單艷、孫曉寧、魏來、王春生負責論文設計、審閱、修改，經費支持。
