引用本文： 張丹, 趙翔, 劉瀟遙, 阿依提拉·艾則孜, 馬翔. 高通量篩選DeBakeyⅠ型急性主動脈夾層患者外泌體miRNAs差異表達. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(2): 253-259. doi: 10.7507/1007-4848.202111073 復制
主動脈夾層（aortic dissection，AD）是一種致命性血管疾病[1-2]。若不能在發病初期的24 h內診斷與治療，死亡風險將顯著增加[3]。其中，急性主動脈夾層（acute aortic dissection，AAD）是指胸痛發生時間在14 d以內的AD，死亡率更高。目前盡管藥物治療、內科介入治療及外科手術治療經過多年的發展，投入了大量的經費及人力，治療效果仍然不能令人滿意，主要是因為目前對于AD治療主要為對癥治療，尚無針對其病因學及發病機制的靶向治療。因此，研究其發病機制、早期確定治療方案、最大程度降低死亡率是亟待解決的問題。
AAD的發病機制復雜，可能涉及多種通道、多個蛋白、多個核酸的參與以及環境因素的作用等。目前國內外關于AAD發病機制的研究取得一些成果。其中，血管中層平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）表型轉換異常是AAD發病機制的研究熱點。外泌體是細胞間信號傳遞與交流的重要載體，通過遠程信號或細胞與細胞接觸起作用[4-5]。其介導的細胞信號傳遞在血管重塑、動脈粥樣硬化斑塊形成以及心肌損傷與保護等過程中發揮舉足輕重的作用[6]。研究表明，miRNAs在疾病發病機理中可作為信號通路的新型生物標志物[7]，并在生理或不同病理狀態下差異性表達[8]。有研究[9]揭示17種器官或疾病來源的外泌體或微泡miRNAs表達譜，為胞外囊泡miRNAs的研究提供了要資源。例如，miR-21、miR-143/145可導致血管內膜撕裂，促使主動脈瘤形成[10-11]。因此，基于外泌體的內含物研究有被應用于臨床實踐的巨大潛力。
目前有關AAD miRNAs生物標志物的報道較少，尤其是來自血清外泌體的miRNAs。本研究擬分析血清外泌體miRNAs在AAD患者中的表達變化及意義。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入標準：（1）出現疼痛癥狀時間≤48 h；（2）在我院完善主動脈 CT 血管造影（computed tomography angiography，CTA）后，確診為DeBakey Ⅰ型AAD。排除標準[12]：（1）合并有心力衰竭、急性心肌梗死等；（2）診斷為結締組織病；（3）合并有腫瘤疾病者。根據嚴格的納入排除標準，選取我院2019年1月—9月主訴為撕裂樣胸背部疼痛就診，并完善主動脈 CTA 后確診為DeBakey Ⅰ型AAD的男性患者12例，其中胸痛發生時間在24 h以內及48 h以內各6例，年齡分別為（47.00±8.79）歲和（50.17±9.99）歲。選取同時期體檢中心的男性健康者6名為對照組[13]，年齡（49.17±4.26）歲。記錄患者年齡、體重指數、高血壓病史等一般資料；見表1。
表1
各組患者一般臨床指標比較［例（%）/
］
1.2 方法
1.2.1 血清提取及外泌體分離鑒定
收集研究對象外周全血5 mL，4 h內于4℃條件下5 000 r/min離心10 min后，抽取上清液分裝入離心管中獲得血清樣本，將收集的血清置于?80℃冰箱中進行保存。使用外泌體分離試劑盒（CELL公司）對提取的血清進行外泌體提取，500 μL血清500×g離心10 min，小心取出上清，移入新的離心管，16000×g離心10 min，將上清轉移至新的離心管，等體積添加Exo-spin? Buffer，4℃靜置至少1 h，16 000×g離心30 min，沉淀即為外泌體。進一步純化外泌體，100 μL磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）重懸，100 μL重懸液加入Exo-spin?純化柱中，50×g離心1 min，將純化柱放入新的1.5 mL離心管，柱子頂端加入200 μL PBS，50×g離心1 min，所得液體即為純化外泌體。并通過透射電子顯微鏡、濃度粒徑分析和蛋白質免疫印跡分析確定外泌體的特征。
1.2.2 外泌體miRNAs提取、差異表達及生物信息學分析
使用TRIzol法提取RNA，然后對獲取的總RNA進行質檢，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop檢測RNA的純度（OD 260/280，OD 260/230），Qubit對RNA濃度進行精確定量，Agilent 2100精確檢測RNA的完整性。使用Small RNA Sample Pre Kit構建文庫，利用Small RNA的3’ 及5’ 端特殊結構（5’ 端有完整的磷酸基團，3’ 端有羥基），以總RNA為起始樣品，直接將Small RNA兩端加上接頭，然后反轉錄合成cDNA。隨后經過PCR擴增，PAGE膠電泳分離目標DNA片段，切膠回收得到的即為cDNA文庫。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度＞2 nM）。檢測合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后進行HiSeq測序。測序得到的原始數據，各組去除1例低質量數據后，對篩選后的數據選擇一定長度范圍內的sRNA定位到參考序列上，分析其在參考序列上的分布情況。與miRBase數據庫中指定范圍序列進行比對，得到各樣本匹配上的sRNA的詳細情況，并進行重復序列比對。將sRNA比對到mRNA的外顯子和內含子，找出來自mRNA降解片段的sRNA。通過截取一定長度sRNA比對上的參考序列，探尋其二級結構及Dicer酶切位點信息、能量等特征，預測樣品中新miRNAs。對各樣本中已知和新miRNAs進行表達量統計，并用TPM進行表達量歸一化處理。然后，用DEG進行差異分析。進一步對上述差異表達的外泌體miRNAs進行GO、KEGG等生物信息學分析。
1.3 統計學分析
應用SPSS 25.0軟件進行數據分析。計數資料用例（%）描述，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。正態分布的計量資料用均數±標準差（
±s）描述，非正態分布計量資料采用中位數（上下四分位數）［M（P25，P75）］描述，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或非參數檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。
1.4 倫理審查
本研究已獲得新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，審批編號：20210401-05。
2 結果
2.1 一般資料
AAD組與健康對照組在年齡方面差異無統計學意義（P>0.05）。AAD組有10例（83.33%）高血壓，對照組無高血壓患者，差異有統計學意義（P<0.05）。在吸煙史方面，胸痛發生時間在24 h與48 h以內AAD組與對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。而AAD組間一般資料差異均無統計學意義（P>0.05）；見表1。
2.2 外泌體鑒定
根據外泌體miRNAs分析需求，使用粒徑分析、透射電子顯微鏡和蛋白質印跡確定外泌體的特征。發現研究對象血清中的外泌體顯示出雙層膜，并且其大小范圍為30～150 nm，通過蛋白質印跡分析CD63和TSG101[14]證實為外泌體；見圖1。
圖1
外泌體鑒定結果
a：透射電子顯微鏡；b：濃度粒徑；c：蛋白質印跡
2.3 外泌體miRNAs表達差異
胸痛發生時間24 h以內AAD組與對照組比較，表達有顯著差異的miRNAs共61個，其中上調39個，下調22個；胸痛發生時間在48 h以內AAD組與對照組相比，表達有顯著差異的miRNAs共170個，其中上調91個，下調79個；胸痛發生時間48 h以內與胸痛發生時間24 h以內AAD組比較，表達有顯著差異的miRNAs共98個，其中上調42個，下調56個；見圖2。進一步分析發現，胸痛發生時間24 h和48 h以內AAD組表達均上調的為hsa-miR-574-5p，均下調的為hsa-miR-223-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-15b-5p和hsa-miR-155-5p。
圖2
差異結果分析火山圖
a：胸痛發生時間24 h以內AAD組與對照組之間差異表達外泌體miRNAs火山圖；b：胸痛發生時間48 h以內AAD組與對照組之間差異表達外泌體miRNAs火山圖；c：胸痛發生時間48 h以內AAD組與胸痛發生時間24 h以內AAD組之間差異表達外泌體miRNAs火山圖
2.4 差異表達外泌體miRNAs的生物信息學分析
基于以上結果，為了明確miRNAs是否有共同的作用靶點參與AAD，進一步對上述5個差異表達的外泌體源性miRNAs進行GO富集分析，miRNAs的GO注釋被分為3個大類：生物進程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。KEGG數據庫被用于通路的富集分析，并進行靶基因預測。使用miRbase、miRWalk、ENCORI、TargetScanHuman公共數據庫查找篩選出來的miRNAs序列數據、注釋、預測基因靶標和已知既往報道過的參與miRNAs過程的蛋白信息。利用DIANA TOOLS進行信號通路預測，發現均富集在轉換生長因子-β、細胞周期、內質網蛋白合成等信號通路；見圖3。GO富集分析發現miRNAs靶基因主要集中在基因表達、蛋白合成受限等與AAD發病機制可能有關的通路（P＜0.05）；見圖4。對上述5種上調/下調的miRNAs進行靶基因預測，發現不同miRNA可同時調控一種或多種基因。比如hsa-miR-574-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-155-5p等同時靶向調控轉化生長因子-β受體2，而蛋白激酶 G1僅受hsa-miR-155-5p 調控。
圖3
5種miRNAs預測重合信號通路KEGG結果
圖4
5種miRNAs預測重合GO富集分析結果
3 討論
大約25%～50%的AAD患者在初治時被誤診，尤其在發病初期的24 h內，若不能盡早診斷與治療，死亡風險將顯著增加。AD發生與否與血壓控制情況已明確具有相關性[15]，但對于有高血壓病史但目前無AD患者來說，盡早診斷可能對預測那些更有可能發生AAD的人群更有用。因為一旦夾層破裂，患者可能在幾小時內死于大出血。因此，比起治愈這種疾病，提前診斷更為有益。
目前臨床上有部分AD患者內膜撕裂累及冠狀動脈[16]，引起肌鈣蛋白、心電圖改變，但這部分患者很難鑒別，需找尋新的標記物，探索新的診斷方法。目前檢測的很多指標一方面并不能進行常規快速檢測，另一方面無法在基層單位常規開展，從而降低其臨床意義。因此，探討外泌體miRNAs在AAD患者中的發病機制，對盡早診療、改善患者遠期預后及生活質量具有較大的臨床價值和實際意義。
有研究[17]篩查了胸主動脈夾層患者miRNAs表達譜（hsa-miR-143-3p 、 hsa-miR-22-3p），以鑒定引起疾病發病機理的候選miRNAs，發現其差異表達可能與絲裂原活化蛋白激酶7（mitogen-activated protein kinase 7，MAPK7）表達下降有關。另一項研究[18]證實miR-134-5p是控制人類VSMCs表型轉換和遷移的關鍵調節劑，也可參與胸主動脈夾層的疾病進展。針對動脈瘤大小進行差異表達miRNAs的分析[19]發現，小動脈瘤中有6個miRNAs明顯失調，大動脈瘤中有10個miRNAs表達變化超過2倍。以上結果提示miRNAs在AD中的研究越來越重要[20-21]。本實驗研究在以上基礎上對病死率更高的DeBakeyⅠ型AAD血清外泌體miRNAs表達譜差異進行分析，發現了一些既往未曾報道過或研究較少的與AAD相關的血清外泌體miRNAs。
進一步對差異表達的外泌體miRNAs靶基因功能及信號通路進行分析。VSMCs在維持血管壁正常收縮功能中起重要作用。在調節內皮細胞表達的細胞黏附分子中MAPK通路起關鍵作用[22-23]。腫瘤壞死因子-α引起內皮細胞中3種MAPK亞型的強烈激活，參與內皮細胞核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路激活調控[24]，誘導基質金屬蛋白酶表達，使VSMCs表型轉換，促使AAD的發生。本研究中基質金屬蛋白酶16是has-miR-574-5p、has-miR-155-5p等miRNAs的靶基因，可能參與AAD的發生發展。研究[14-25]發現，miR-223在調節炎癥過程中會發生祖細胞的增殖以及粒細胞的分化和活化。血清中源自血小板的miR-223-3p進入內皮和血管平滑肌細胞，可作為內分泌遺傳信號，使血管生成減少[26-27]。本研究中hsa-miR-223-3p預測的靶基因miR-599具有抑制Ⅰ型膠原蛋白、V型膠原蛋白和蛋白聚糖表達的作用。轉換生長因子-β2是VSMCs中miR-599的直接靶基因[28]。miR-155是一種調節多種生物途徑的典型多功能miRNAs，可作為涉及動脈粥樣硬化發病機理中炎癥信號通路的新型調節劑。通過抑制內皮細胞對炎癥介導的反應[29]，在動脈粥樣硬化中表達上調，導致VSMCs增殖及其從中間層向新內膜的定向遷移[30]。hsa-miR-155-5p介導NF-κB信號通路，降低VSMCs中蛋白激酶G1（相關靶基因）的表達，下調VSMCs標記基因，抑制肌動蛋白聚合，改變細胞形態以及增加細胞增殖和遷移來誘導VSMCs表型從收縮狀態轉變為合成狀態[31]。
通過對差異表達的外泌體miRNAs進行靶基因和功能分析，進一步驗證了AAD發病機制。但本研究存在一定局限性，納入對象僅為DeBakey Ⅰ型AAD患者，此部分患者并不能代表其它類型AAD患者的特征，在今后的研究中應更加嚴謹地篩選樣本，使研究結果更具有代表性。本研究發現，差異表達的血清外泌體miRNAs并不能區分AAD患者發生胸痛的時間，但可對兩組間均差異表達的外泌體miRNAs進一步擴大樣本進行功能驗證，明確與AAD的關系。總之，本研究中AAD患者血清差異表達外泌體miRNAs與AAD病理生理過程密切相關。基于血清外泌體miRNAs的生物標志物可能為未來的臨床應用提供借鑒。
利益沖突：無。
作者貢獻：張丹負責論文撰寫和數據處理；馬翔負責論文設計；劉瀟遙、阿依提拉·艾則孜負責收取血樣與血清提取；趙翔負責數據整理及血樣質量控制。
主動脈夾層（aortic dissection，AD）是一種致命性血管疾病[1-2]。若不能在發病初期的24 h內診斷與治療，死亡風險將顯著增加[3]。其中，急性主動脈夾層（acute aortic dissection，AAD）是指胸痛發生時間在14 d以內的AD，死亡率更高。目前盡管藥物治療、內科介入治療及外科手術治療經過多年的發展，投入了大量的經費及人力，治療效果仍然不能令人滿意，主要是因為目前對于AD治療主要為對癥治療，尚無針對其病因學及發病機制的靶向治療。因此，研究其發病機制、早期確定治療方案、最大程度降低死亡率是亟待解決的問題。
AAD的發病機制復雜，可能涉及多種通道、多個蛋白、多個核酸的參與以及環境因素的作用等。目前國內外關于AAD發病機制的研究取得一些成果。其中，血管中層平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）表型轉換異常是AAD發病機制的研究熱點。外泌體是細胞間信號傳遞與交流的重要載體，通過遠程信號或細胞與細胞接觸起作用[4-5]。其介導的細胞信號傳遞在血管重塑、動脈粥樣硬化斑塊形成以及心肌損傷與保護等過程中發揮舉足輕重的作用[6]。研究表明，miRNAs在疾病發病機理中可作為信號通路的新型生物標志物[7]，并在生理或不同病理狀態下差異性表達[8]。有研究[9]揭示17種器官或疾病來源的外泌體或微泡miRNAs表達譜，為胞外囊泡miRNAs的研究提供了要資源。例如，miR-21、miR-143/145可導致血管內膜撕裂，促使主動脈瘤形成[10-11]。因此，基于外泌體的內含物研究有被應用于臨床實踐的巨大潛力。
目前有關AAD miRNAs生物標志物的報道較少，尤其是來自血清外泌體的miRNAs。本研究擬分析血清外泌體miRNAs在AAD患者中的表達變化及意義。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入標準：（1）出現疼痛癥狀時間≤48 h；（2）在我院完善主動脈 CT 血管造影（computed tomography angiography，CTA）后，確診為DeBakey Ⅰ型AAD。排除標準[12]：（1）合并有心力衰竭、急性心肌梗死等；（2）診斷為結締組織病；（3）合并有腫瘤疾病者。根據嚴格的納入排除標準，選取我院2019年1月—9月主訴為撕裂樣胸背部疼痛就診，并完善主動脈 CTA 后確診為DeBakey Ⅰ型AAD的男性患者12例，其中胸痛發生時間在24 h以內及48 h以內各6例，年齡分別為（47.00±8.79）歲和（50.17±9.99）歲。選取同時期體檢中心的男性健康者6名為對照組[13]，年齡（49.17±4.26）歲。記錄患者年齡、體重指數、高血壓病史等一般資料；見表1。
表1
各組患者一般臨床指標比較［例（%）/］
1.2 方法
1.2.1 血清提取及外泌體分離鑒定
收集研究對象外周全血5 mL，4 h內于4℃條件下5 000 r/min離心10 min后，抽取上清液分裝入離心管中獲得血清樣本，將收集的血清置于?80℃冰箱中進行保存。使用外泌體分離試劑盒（CELL公司）對提取的血清進行外泌體提取，500 μL血清500×g離心10 min，小心取出上清，移入新的離心管，16000×g離心10 min，將上清轉移至新的離心管，等體積添加Exo-spin? Buffer，4℃靜置至少1 h，16 000×g離心30 min，沉淀即為外泌體。進一步純化外泌體，100 μL磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）重懸，100 μL重懸液加入Exo-spin?純化柱中，50×g離心1 min，將純化柱放入新的1.5 mL離心管，柱子頂端加入200 μL PBS，50×g離心1 min，所得液體即為純化外泌體。并通過透射電子顯微鏡、濃度粒徑分析和蛋白質免疫印跡分析確定外泌體的特征。
1.2.2 外泌體miRNAs提取、差異表達及生物信息學分析
使用TRIzol法提取RNA，然后對獲取的總RNA進行質檢，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop檢測RNA的純度（OD 260/280，OD 260/230），Qubit對RNA濃度進行精確定量，Agilent 2100精確檢測RNA的完整性。使用Small RNA Sample Pre Kit構建文庫，利用Small RNA的3’ 及5’ 端特殊結構（5’ 端有完整的磷酸基團，3’ 端有羥基），以總RNA為起始樣品，直接將Small RNA兩端加上接頭，然后反轉錄合成cDNA。隨后經過PCR擴增，PAGE膠電泳分離目標DNA片段，切膠回收得到的即為cDNA文庫。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度＞2 nM）。檢測合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后進行HiSeq測序。測序得到的原始數據，各組去除1例低質量數據后，對篩選后的數據選擇一定長度范圍內的sRNA定位到參考序列上，分析其在參考序列上的分布情況。與miRBase數據庫中指定范圍序列進行比對，得到各樣本匹配上的sRNA的詳細情況，并進行重復序列比對。將sRNA比對到mRNA的外顯子和內含子，找出來自mRNA降解片段的sRNA。通過截取一定長度sRNA比對上的參考序列，探尋其二級結構及Dicer酶切位點信息、能量等特征，預測樣品中新miRNAs。對各樣本中已知和新miRNAs進行表達量統計，并用TPM進行表達量歸一化處理。然后，用DEG進行差異分析。進一步對上述差異表達的外泌體miRNAs進行GO、KEGG等生物信息學分析。
1.3 統計學分析
應用SPSS 25.0軟件進行數據分析。計數資料用例（%）描述，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）描述，非正態分布計量資料采用中位數（上下四分位數）［M（P25，P75）］描述，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或非參數檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。
1.4 倫理審查
本研究已獲得新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，審批編號：20210401-05。
2 結果
2.1 一般資料
AAD組與健康對照組在年齡方面差異無統計學意義（P>0.05）。AAD組有10例（83.33%）高血壓，對照組無高血壓患者，差異有統計學意義（P<0.05）。在吸煙史方面，胸痛發生時間在24 h與48 h以內AAD組與對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。而AAD組間一般資料差異均無統計學意義（P>0.05）；見表1。
2.2 外泌體鑒定
根據外泌體miRNAs分析需求，使用粒徑分析、透射電子顯微鏡和蛋白質印跡確定外泌體的特征。發現研究對象血清中的外泌體顯示出雙層膜，并且其大小范圍為30～150 nm，通過蛋白質印跡分析CD63和TSG101[14]證實為外泌體；見圖1。
圖1
外泌體鑒定結果
a：透射電子顯微鏡；b：濃度粒徑；c：蛋白質印跡
2.3 外泌體miRNAs表達差異
胸痛發生時間24 h以內AAD組與對照組比較，表達有顯著差異的miRNAs共61個，其中上調39個，下調22個；胸痛發生時間在48 h以內AAD組與對照組相比，表達有顯著差異的miRNAs共170個，其中上調91個，下調79個；胸痛發生時間48 h以內與胸痛發生時間24 h以內AAD組比較，表達有顯著差異的miRNAs共98個，其中上調42個，下調56個；見圖2。進一步分析發現，胸痛發生時間24 h和48 h以內AAD組表達均上調的為hsa-miR-574-5p，均下調的為hsa-miR-223-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-15b-5p和hsa-miR-155-5p。
圖2
差異結果分析火山圖
a：胸痛發生時間24 h以內AAD組與對照組之間差異表達外泌體miRNAs火山圖；b：胸痛發生時間48 h以內AAD組與對照組之間差異表達外泌體miRNAs火山圖；c：胸痛發生時間48 h以內AAD組與胸痛發生時間24 h以內AAD組之間差異表達外泌體miRNAs火山圖
2.4 差異表達外泌體miRNAs的生物信息學分析
基于以上結果，為了明確miRNAs是否有共同的作用靶點參與AAD，進一步對上述5個差異表達的外泌體源性miRNAs進行GO富集分析，miRNAs的GO注釋被分為3個大類：生物進程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。KEGG數據庫被用于通路的富集分析，并進行靶基因預測。使用miRbase、miRWalk、ENCORI、TargetScanHuman公共數據庫查找篩選出來的miRNAs序列數據、注釋、預測基因靶標和已知既往報道過的參與miRNAs過程的蛋白信息。利用DIANA TOOLS進行信號通路預測，發現均富集在轉換生長因子-β、細胞周期、內質網蛋白合成等信號通路；見圖3。GO富集分析發現miRNAs靶基因主要集中在基因表達、蛋白合成受限等與AAD發病機制可能有關的通路（P＜0.05）；見圖4。對上述5種上調/下調的miRNAs進行靶基因預測，發現不同miRNA可同時調控一種或多種基因。比如hsa-miR-574-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-155-5p等同時靶向調控轉化生長因子-β受體2，而蛋白激酶 G1僅受hsa-miR-155-5p 調控。
圖3
5種miRNAs預測重合信號通路KEGG結果
圖4
5種miRNAs預測重合GO富集分析結果
3 討論
大約25%～50%的AAD患者在初治時被誤診，尤其在發病初期的24 h內，若不能盡早診斷與治療，死亡風險將顯著增加。AD發生與否與血壓控制情況已明確具有相關性[15]，但對于有高血壓病史但目前無AD患者來說，盡早診斷可能對預測那些更有可能發生AAD的人群更有用。因為一旦夾層破裂，患者可能在幾小時內死于大出血。因此，比起治愈這種疾病，提前診斷更為有益。
目前臨床上有部分AD患者內膜撕裂累及冠狀動脈[16]，引起肌鈣蛋白、心電圖改變，但這部分患者很難鑒別，需找尋新的標記物，探索新的診斷方法。目前檢測的很多指標一方面并不能進行常規快速檢測，另一方面無法在基層單位常規開展，從而降低其臨床意義。因此，探討外泌體miRNAs在AAD患者中的發病機制，對盡早診療、改善患者遠期預后及生活質量具有較大的臨床價值和實際意義。
有研究[17]篩查了胸主動脈夾層患者miRNAs表達譜（hsa-miR-143-3p 、 hsa-miR-22-3p），以鑒定引起疾病發病機理的候選miRNAs，發現其差異表達可能與絲裂原活化蛋白激酶7（mitogen-activated protein kinase 7，MAPK7）表達下降有關。另一項研究[18]證實miR-134-5p是控制人類VSMCs表型轉換和遷移的關鍵調節劑，也可參與胸主動脈夾層的疾病進展。針對動脈瘤大小進行差異表達miRNAs的分析[19]發現，小動脈瘤中有6個miRNAs明顯失調，大動脈瘤中有10個miRNAs表達變化超過2倍。以上結果提示miRNAs在AD中的研究越來越重要[20-21]。本實驗研究在以上基礎上對病死率更高的DeBakeyⅠ型AAD血清外泌體miRNAs表達譜差異進行分析，發現了一些既往未曾報道過或研究較少的與AAD相關的血清外泌體miRNAs。
進一步對差異表達的外泌體miRNAs靶基因功能及信號通路進行分析。VSMCs在維持血管壁正常收縮功能中起重要作用。在調節內皮細胞表達的細胞黏附分子中MAPK通路起關鍵作用[22-23]。腫瘤壞死因子-α引起內皮細胞中3種MAPK亞型的強烈激活，參與內皮細胞核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路激活調控[24]，誘導基質金屬蛋白酶表達，使VSMCs表型轉換，促使AAD的發生。本研究中基質金屬蛋白酶16是has-miR-574-5p、has-miR-155-5p等miRNAs的靶基因，可能參與AAD的發生發展。研究[14-25]發現，miR-223在調節炎癥過程中會發生祖細胞的增殖以及粒細胞的分化和活化。血清中源自血小板的miR-223-3p進入內皮和血管平滑肌細胞，可作為內分泌遺傳信號，使血管生成減少[26-27]。本研究中hsa-miR-223-3p預測的靶基因miR-599具有抑制Ⅰ型膠原蛋白、V型膠原蛋白和蛋白聚糖表達的作用。轉換生長因子-β2是VSMCs中miR-599的直接靶基因[28]。miR-155是一種調節多種生物途徑的典型多功能miRNAs，可作為涉及動脈粥樣硬化發病機理中炎癥信號通路的新型調節劑。通過抑制內皮細胞對炎癥介導的反應[29]，在動脈粥樣硬化中表達上調，導致VSMCs增殖及其從中間層向新內膜的定向遷移[30]。hsa-miR-155-5p介導NF-κB信號通路，降低VSMCs中蛋白激酶G1（相關靶基因）的表達，下調VSMCs標記基因，抑制肌動蛋白聚合，改變細胞形態以及增加細胞增殖和遷移來誘導VSMCs表型從收縮狀態轉變為合成狀態[31]。
通過對差異表達的外泌體miRNAs進行靶基因和功能分析，進一步驗證了AAD發病機制。但本研究存在一定局限性，納入對象僅為DeBakey Ⅰ型AAD患者，此部分患者并不能代表其它類型AAD患者的特征，在今后的研究中應更加嚴謹地篩選樣本，使研究結果更具有代表性。本研究發現，差異表達的血清外泌體miRNAs并不能區分AAD患者發生胸痛的時間，但可對兩組間均差異表達的外泌體miRNAs進一步擴大樣本進行功能驗證，明確與AAD的關系。總之，本研究中AAD患者血清差異表達外泌體miRNAs與AAD病理生理過程密切相關。基于血清外泌體miRNAs的生物標志物可能為未來的臨床應用提供借鑒。
利益沖突：無。
作者貢獻：張丹負責論文撰寫和數據處理；馬翔負責論文設計；劉瀟遙、阿依提拉·艾則孜負責收取血樣與血清提取；趙翔負責數據整理及血樣質量控制。
