引用本文： 凌云飛, 李田歌, 曹嶸, 錢永軍. 木犀草素對體外循環導致急性肺損傷的保護作用及其機制研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(8): 1181-1187. doi: 10.7507/1007-4848.202104025 復制
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是心外科體外循環（extracorporeal circulation，ECC）后常見的并發癥之一。轉流過程中在循環血液與管道材料接觸、血液稀釋、缺血-再灌注損傷、低溫、全身炎癥反應等因素影響下[1]，血液中的炎癥細胞被激活并釋放炎性因子白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，在炎性因子趨化作用下，中性粒細胞聚集沉積在肺泡間隙，影響肺泡內皮-上皮細胞功能，導致肺順應性下降，造成ALI[2]。若肺損傷不能及時緩解，在炎性細胞持續刺激作用下，后期易進展為纖維化，一旦纖維化產生，患者將發生不可逆的肺損傷，預后極差。
木犀草素（luteolin，Lut）是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗纖維化、抗凋亡、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[3-5]。研究[6-7]表明，木犀草素可以通過多種途徑抑制轉錄因子核因子 κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活性，減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的肺損傷。ECC 過程中，血液接觸轉流管道，激活炎癥細胞并釋放炎癥因子導致 ALI 的發生，與 LPS 誘導 ALI 的原理有本質上的不同。目前尚無研究報道木犀草素在 ECC 導致的 ALI 中是否具有保護作用，本研究旨在通過對比不同木犀草素霧化給藥預處理時間下肺組織的炎性水平和病理損傷程度，探究納米木犀草素制劑對 ECC 導致的 ALI 的保護作用，并初步探究其機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和材料
1.1.1 實驗動物
雄性Sprague Dawley（SD）大鼠 30 只，5～6 周齡，體重 160～190 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供［許可證號：SCXK（川）2019-028］。所有大鼠均按實驗動物規范于華西科技園無特定病原體（SPF）級動物房飼養。
1.1.2 實驗器材
StockⅡ體外循環機小泵（Munich，德國）；小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司，中國）；生物機能實驗系統（多功能監護儀）：BL-420E+（泰盟科技有限公司，中國）；體外循環管路：特制體外循環硅膠管路，長度 40 cm、內徑 0.8 mm（天津塑料研究所，中國）；氣管插管：20G 動脈穿刺針（Becton Dickinson 醫療設備，美國）；動靜脈插管：24G 靜脈留置針（Becton Dickinson 醫療設備，美國）；國產 5-0 帶針縫合線（上海醫療用品公司，中國）；顯微外科器械（上海顯微外科醫療用品公司，中國）；顯微外科用手術顯微鏡：PZMⅢ（WPI，美國）；低溫高速離心機：Legend Mach 1.6R（Sorvall，德國）；深低溫冰箱：BCD-222KSW（海爾，中國）；動物喉鏡：SMT-Ⅱ（上海伊麟醫療科技有限公司，中國）；石蠟包埋機：YB-6LF（湖北孝感亞光醫用電子技術公司，中國）；切片機：C-MIT-55-1（孚光精儀，美國）；病理顯微鏡（NIKON Eclipse Ci；成像：NIKON digitalsight，日本）；動物專用剃毛器：PHILIPS-T20（飛利浦，荷蘭）；SA-YLS-8B 小動物霧化給藥儀（賽昂斯，中國）；Scientz-48 高通量組織研磨儀；D3024R 離心機（SCILOGEX，美國）；酶標儀（BIO-RAD，美國）；電泳儀（BASIC，BIO-RAD，美國）；電泳槽（JY-SCZ2，君意，中國）；蛋白印跡儀/轉印儀（B33，耶拿，德國）。
1.1.3 實驗試劑
木犀草素納米制劑（8 mg/mL，20 mL，華西藥學院實驗室制備）；PBS 緩沖液（10×，20 mL）；肝素水（1%，100 mL）；生理鹽水（0.9% NaCl，100 mL，青山利康中國）；異氟烷（100 mL）；TNF-α 抗體：大鼠 TNF-α ELISA Kit，Catalog No. EK382/3-48，EK382/3-96（Thermo，美國）；IL-6 抗體：大鼠 IL-6 ELISA Kit，Catalog No. EK306/3-480，EK306/3-960（Thermo，美國）；預染 MARKER（SPM103-1，常州天地人和，中國）；轉膜濾紙（1703965，BIO-RAD，美國）；PVDF 膜（18071300，羅氏，瑞士）；ECL 化學發光試劑盒（1705070，BIO-RAD，美國）；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（P0028，上海碧云天生物技術有限公司，中國）；考馬斯亮藍染色液（考馬斯亮藍 0.25 g，甲醇 450 mL，乙酸 100 mL）；考馬斯亮藍脫色液（甲醇 450 mL，乙酸 100 mL，H2O 定容至 1L）；10×麗春紅染色液；IκB 激酶（IKK）α 抗體（ab32041，Abcam，英國）；IKKβ 抗體（ab32041，Abcam，英國）；IKKγ（NEMO） 抗體（ab63551，Abcam，英國）；NF-κB p65 抗體（ab16502，Abcam，英國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 分組
采用隨機數字表法將 30 只 SD 大鼠隨機分為術前基線（baseline，BL）組、動靜脈部分轉流（ECC）組、木犀草素霧化給藥預處理 1 h 組、2 h 組、3 h 組，每組 6 只。
1.2.2 動物模型建立
大鼠使用異氟烷誘導麻醉（0.41 mL/min，氧流量4 L/min）誘導麻醉，機械通氣（呼吸頻率 90 次/min，通氣量 20 mL/min，呼吸比 1∶1），全身肝素化后，頸動靜脈插管，進行體外轉流。體外轉流管使用特制清潔硅膠管（ 長40 cm，內徑 0.8 mm），預充液為肝素水，預充量為 0.4 mL。滾壓泵（StockⅡ小泵，Munich，德國）用于將血從右頸動脈插管轉流入右頸外靜脈。泵轉速為 8～12 轉/min，轉流量為 20～25 mL/min，相當于大鼠心輸出量的 1/3～1/2，轉流開始后，在數分鐘內逐漸將流量加至上述水平，密切觀察大鼠生命體征。BL 組不予任何處理；ECC 組轉流 30 min，觀察 60 min；1 h、2 h、3 h 組分別于轉流前 1 h、2 h、3 h將實驗對象置于小動物霧化給藥儀霧化給藥木犀草素納米制劑（給藥箱氣體容積 8 L，大鼠呼吸頻率 90 次/min，潮氣量 5 mL/次，大鼠霧化時間 20 min，木犀草素納米制劑給藥劑量 10 mg/kg），后續操作同ECC 組。
1.2.3 樣本采集
實驗中設置多個時間節點：T0（轉流開始前），T1（轉流 30 min），T2（觀察 30 min），T3（觀察 60 min）。BL 組于 T0 時間點，ECC、1 h、2 h、3 h 組于 T3 時間點，沿胸骨正中線剪開胸骨，結扎主氣管，游離氣管、雙肺，將其與心臟一起取出。取右肺約 1 cm×1 cm 大小兩塊組織，一塊用檢測肺組織炎性因子；另一塊存于–80℃ 冰箱，待 Western blotting 檢測；用同樣的手法取左肺約 1 cm×1 cm 大小組織用于制備石蠟病理切片；見圖 1。
圖1
實驗分組及操作示意圖
1.2.4 肺組織炎性因子水平測定
稱取適量肺組織，用 9 倍勻漿介質研磨，然后將研磨液離心 10 min，3000～4000 r/min，取上清液制備成 10% 的組織勻漿，放 4℃ 冰箱，采用ELISA檢測炎性因子（TNF-α，IL-6）水平。
1.2.5 解剖病理指標的測定
制備左肺組織石蠟病理切片，對鏡下肺組織的 5 種病理改變進行綜合評估：肺泡腔壁水腫增厚；肺泡腔內出血；中性粒細胞浸潤肺泡腔；中性粒細胞浸潤肺泡壁；肺泡壁透明膜形成（0=無病變，1=有病變）。評分采取雙盲法，累加各項后的總分作為肺病理損傷評分，0 分正常，5 分損傷最嚴重。
1.2.6 蛋白免疫印跡檢測
選用存于–80℃ 冰箱中的右肺組織，使用Western blotting檢測肺組織樣本中 p65、IKKα、IKKβ、IKKγ 的蛋白含量。Western blotting按照標準方法步驟進行。
1.3 統計學分析
數據整理及作圖采用 Microsoft Office Excel 2016（USA）和 GraphPad Prism 8.0。各組數據比較前行方差齊性檢驗，如方差齊則進一步行 t 檢驗或方差分析，如方差不齊則行變量變換再行 t 檢驗或方差分析；使用單因素方差分析進行多組間比較分析，若方差分析各組間有差異，再行兩兩比較。統計數據分析采用 SPSS 25.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA），P≤0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織炎性因子水平比較
ECC 組、1 h、2 h、3 h 組術前 T0 時間點的肺組織炎性水平用 BL 組基線值代替。ECC、1 h、2 h、3 h 組轉流后肺組織中的 IL-6、TNF-α 水平較術前（BL 組）增高，其中 3 h 組肺組織 TNF-α 含量與術前水平差異無統計學意義，其余差異均有統計學意義（P<0.05，圖 2）；1 h、2 h、3 h 組肺組織 IL-6 水平相較 ECC 組均有所降低，差異有統計學意義（P<0.05）；1 h、2 h、3 h 組肺組織 TNF-α 水平相較 ECC 組均有所降低，其中 3 h 組肺組織 TNF-α 水平與 ECC 組的差異有統計學意義（P<0.05，圖 2）；1 h、2 h、3 h 三組內方差分析結果表明，T3 時間點肺組織中 IL-6、TNF-α 水平隨著霧化吸入藥物預處理的時間延長而降低，3 h 組較 1 h、2 h 組的肺組織中 IL-6、TNF-α 水平降低，差異有統計學意義（P<0.05，圖 2）。
表1
實驗前后各組肺組織病理評分比較（每組 n=6，
）
圖2
各組間 T3 時間點肺組織炎性因子水平比較
*：
2.2 肺損傷水平比較
ECC 組大鼠的肺組織病理切片可見明顯的肺損傷表現：中性粒細胞浸潤、腔內出血、透明膜形成、細胞內皮增厚等。1 h、2 h、3 h 組也存在部分肺損傷表現，但損傷程度與 ECC 組相比較輕，其中 3 h 組的肺損傷程度較其他兩組輕，僅有少量中性粒細胞浸潤（圖 3）。對各組肺組織進行病理評分，除 3 h 組外，其余各組術后肺組織病理評分高于術前（BL 組）評分，差異有統計學意義（P<0.05，表 1）；1 h、2 h、3 h 組評分均低于 ECC 組，差異有統計學意義（P<0.05，表 1）；3 h 組評分低于 1 h 組和 2 h 組，差異有統計學意義（P<0.05，表 1）。
圖3
各組肺組織病理切片（×200，HE）
a：BL 組；b：1 h 組，肺泡壁增厚、水腫炎性細胞浸潤（黑色箭頭），肺泡腔內出血（藍色箭頭）；c：2 h 組，中性粒細胞浸潤（紅色箭頭）；d：3 h 組，透明膜形成（綠色箭頭）
2.3 蛋白免疫印跡檢測結果
2.3.1 肺組織中 p65 水平
ECC、1 h、2 h、3 h 組肺組織中的 p65 條帶灰度相較于 BL 組，均明顯增加，且隨著霧化吸入木犀草素預處理時間的提前，p65 條帶灰度逐漸下降（圖 4）。
圖4
霧化吸入木犀草素納米制劑預處理時間對體外循環后急性肺損傷大鼠肺組織中 p65 的影響
2.3.2 肺組織中 IKKα、 IKKβ、IKKγ 水平
3 h 組 IKKα 的含量顯著高于 BL 組和 ECC 組，差異有統計學意義（P<0.05，圖 5），其他各組間單因素方差分析中差異無統計學意義；3 h 組 IKKβ 的含量較 ECC 組顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05，圖 5），1 h、2 h組 IKKβ 含量有高于 ECC 組的趨勢，但差異無統計學意義；1 h、2 h、3 h 組 IKKγ 含量有高于 ECC 組的趨勢，但差異均無統計學意義。
圖5
霧化吸入木犀草素納米制劑預處理時間對體外循環后急性肺損傷大鼠肺組織中 IKK 的影響
a：Western blotting（WB）條帶；b：IKKα、IKKβ、IKKγ WB灰度值的相對表達量；*：
3 討論
本實驗通過檢測肺組織炎性因子水平和評估肺組織病理損傷程度，證明了木犀草素在 ECC 導致的 ALI 中具有保護作用。霧化吸入木犀草素納米制劑能顯著降低肺組織中的 IL-6 和 TNF-α 等炎性因子的水平、減輕肺組織病理損傷、緩解大鼠體外轉流后的ALI，達到肺保護的效果，且轉流前 3 h 對大鼠進行霧化木犀草素納米制劑比提前 1 h 和 2 h有更好的肺保護效果。
部分關于木犀草素在動物體內藥物代謝的研究顯示，給藥方式、藥物濃度不同，木犀草素在動物體內的代謝水平有很大差異，藥物半衰期的時長也不同。研究顯示口服木犀草素在動物體內的藥物半衰期為（132±12）min[8]、3.8 h[9]、（5.25±1.28）h[10]不等，考慮到實驗中 ECC 操作和觀察耗時，本實驗最終選擇提前 1 h、2 h 和 3 h 三個時間點進行霧化，以確保大鼠體內的木犀草素在實驗結束之前有足夠的效應含量，同時探究提前霧化的時間與肺保護作用的關聯。本實驗雖然證實了提前 3 h 霧化吸入木犀草素納米制劑的肺保護作用最好，但沒有得出最適提前霧化時間，且沒有將木犀草素的肺保護作用與肺泡藥物濃度聯系起來，以上問題有待進一步研究。
研究[11-14]表明，ALI的發生與 NF-κB 家族信號通路有關。在 TNF-α、LPS 等胞外因素的刺激下，IKK 得到了激活[15]，在此基礎上磷酸化 IκB 蛋白，然后再進行泛素化，隨后 IκB 被蛋白酶解，釋放出的 NF-κB 二聚體（p50/p65）發生核轉移進入細胞核中，與靶向基因結合，促進基因轉錄釋放炎性因子，其中 IKK 復合物在這一過程中發揮了重要的作用。IKK 復合物由 α、β、γ 三部分構成，IKKα 主要參與非經典的 NF-κB 信號通路，活化后的 IKKα 誘發下游的 p100 加工處理為 p52，使信號通路激活[16]；IKKβ 是 NF-κB 經典通路激活的主要激酶[17]，磷酸化的 IKKβ（phosphorylated I-κB kinase β，p-IKKβ）會促進下游 IκB 的磷酸化，p-IκB 形成后，可以誘導后續反應的進行，最終產生 TNF-α、IL-1 等炎性因子，促使炎癥反應發生[18-19]；IKKγ 是 IKK 復合物中的非催化亞基，可以通過與其他兩部分直接作用，介導 IKK 復合物的形成組裝，且其還能促進 IKK 復合物與 IκB 蛋白發生作用[20]。
本實驗中，ECC 組 p65 的含量增加驗證了 p50/p65 二聚體的大量產生，即 NF-κB 經典信號通路得到激活，而 1 h、2 h、3 h 組的 p65 含量逐漸降低，其中 3 h 組的 p65 蛋白含量最低，說明霧化吸入木犀草素后 NF-κB 經典途徑得到了抑制。ECC 組的 IKKβ 含量減少，說明大部分 IKKβ 已經完成了磷酸化，而 1 h、2 h、3 h 組 IKKβ 的含量均較 ECC 組有所增加，其中 3 h 組的差異最為明顯，說明了木犀草素納米制劑可有效增加細胞中 IKKβ 含量，側面印證了其可以降低細胞中 p-IKKβ 的產生。木犀草素對 IKKβ 磷酸化的抑制作用可能是其抑制 NF-κB 信號通路的關鍵環節。
IKKα 和 IKKγ 是 IKK 復合體的重要組成部分。本實驗中，肺組織 IKKα 含量在 3 h 組中明顯增加，提示著木犀草素的抗炎作用有可能與 NF-κB 的非經典途徑有關，但由于未對該途徑中的關鍵蛋白進行檢測，尚不能確定此關系。IKKγ 在各組中的含量差異無統計學意義，僅表明木犀草素處理后肺組織中的 IKKγ 含量有增加趨勢，因此不能認為木犀草素抑制 NF-κB 信號通路的作用機制與 IKKγ 的激活有關。IKKα 與 IKKγ 在本實驗中展現的變化趨勢為進一步的實驗提供了可能的設計方向。
本實驗的不足之處在于未對木犀草素干預 IKK 復合物的上游信號通路的具體環節進行研究。部分研究顯示，IKK 復合物的上游信號銜接蛋白包括 TNF 受體相關因子[21]和受體作用蛋白等，IKK 復合物激酶包括 TGFβ-激活性激酶 1[22-23]和 NF-κB 誘導激酶[23]，以上問題需要進一步的實驗探究。另一方面，本研究雖然通過動物實驗證明了木犀草素對 ECC 所致的 ALI 具有保護作用且對機制進行了初步探索，但并未考慮造成 ALI 的原因對實驗結果可能的影響。如前言部分所述，ECC 導致 ALI 損傷的原因有很多，本研究的動物模型為 ECC 中轉流管作為異物直接接觸導致的 ALI，而缺血-再灌注損傷、低溫等因素并未納入研究，后續可以通過控制變量的成組實驗，深入探究木犀草素對于哪一種原因導致的 ALI 效果更好。
綜上所述，木犀草素在 ECC 導致的 ALI 中具有保護作用，且提前霧化吸入木犀草素納米制劑的時間越長，保護作用也越好，其中提前 3 h 霧化組的肺損傷保護作用最好。木犀草素可以通過抑制 IKKβ 磷酸化過程，從而抑制 NF-κB 經典信號通路，且提前 3 h 霧化組對 NF-κB 信號通路的抑制作用最明顯。本研究為木犀草素應用于 ECC 導致的 ALI 的治療提供了理論依據，提示木犀草素可作為 ALI 保護藥物應用于需要進行 ECC 的手術。
利益沖突：無。
作者貢獻：凌云飛負責動物模型建立和生物學檢測、論文撰寫；曹嶸負責設計和完成實驗；李田歌負責實驗設計和論文撰寫；錢永軍負責文獻檢索和論文審校。
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是心外科體外循環（extracorporeal circulation，ECC）后常見的并發癥之一。轉流過程中在循環血液與管道材料接觸、血液稀釋、缺血-再灌注損傷、低溫、全身炎癥反應等因素影響下[1]，血液中的炎癥細胞被激活并釋放炎性因子白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，在炎性因子趨化作用下，中性粒細胞聚集沉積在肺泡間隙，影響肺泡內皮-上皮細胞功能，導致肺順應性下降，造成ALI[2]。若肺損傷不能及時緩解，在炎性細胞持續刺激作用下，后期易進展為纖維化，一旦纖維化產生，患者將發生不可逆的肺損傷，預后極差。
木犀草素（luteolin，Lut）是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗纖維化、抗凋亡、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[3-5]。研究[6-7]表明，木犀草素可以通過多種途徑抑制轉錄因子核因子 κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活性，減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的肺損傷。ECC 過程中，血液接觸轉流管道，激活炎癥細胞并釋放炎癥因子導致 ALI 的發生，與 LPS 誘導 ALI 的原理有本質上的不同。目前尚無研究報道木犀草素在 ECC 導致的 ALI 中是否具有保護作用，本研究旨在通過對比不同木犀草素霧化給藥預處理時間下肺組織的炎性水平和病理損傷程度，探究納米木犀草素制劑對 ECC 導致的 ALI 的保護作用，并初步探究其機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和材料
1.1.1 實驗動物
雄性Sprague Dawley（SD）大鼠 30 只，5～6 周齡，體重 160～190 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供［許可證號：SCXK（川）2019-028］。所有大鼠均按實驗動物規范于華西科技園無特定病原體（SPF）級動物房飼養。
1.1.2 實驗器材
StockⅡ體外循環機小泵（Munich，德國）；小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司，中國）；生物機能實驗系統（多功能監護儀）：BL-420E+（泰盟科技有限公司，中國）；體外循環管路：特制體外循環硅膠管路，長度 40 cm、內徑 0.8 mm（天津塑料研究所，中國）；氣管插管：20G 動脈穿刺針（Becton Dickinson 醫療設備，美國）；動靜脈插管：24G 靜脈留置針（Becton Dickinson 醫療設備，美國）；國產 5-0 帶針縫合線（上海醫療用品公司，中國）；顯微外科器械（上海顯微外科醫療用品公司，中國）；顯微外科用手術顯微鏡：PZMⅢ（WPI，美國）；低溫高速離心機：Legend Mach 1.6R（Sorvall，德國）；深低溫冰箱：BCD-222KSW（海爾，中國）；動物喉鏡：SMT-Ⅱ（上海伊麟醫療科技有限公司，中國）；石蠟包埋機：YB-6LF（湖北孝感亞光醫用電子技術公司，中國）；切片機：C-MIT-55-1（孚光精儀，美國）；病理顯微鏡（NIKON Eclipse Ci；成像：NIKON digitalsight，日本）；動物專用剃毛器：PHILIPS-T20（飛利浦，荷蘭）；SA-YLS-8B 小動物霧化給藥儀（賽昂斯，中國）；Scientz-48 高通量組織研磨儀；D3024R 離心機（SCILOGEX，美國）；酶標儀（BIO-RAD，美國）；電泳儀（BASIC，BIO-RAD，美國）；電泳槽（JY-SCZ2，君意，中國）；蛋白印跡儀/轉印儀（B33，耶拿，德國）。
1.1.3 實驗試劑
木犀草素納米制劑（8 mg/mL，20 mL，華西藥學院實驗室制備）；PBS 緩沖液（10×，20 mL）；肝素水（1%，100 mL）；生理鹽水（0.9% NaCl，100 mL，青山利康中國）；異氟烷（100 mL）；TNF-α 抗體：大鼠 TNF-α ELISA Kit，Catalog No. EK382/3-48，EK382/3-96（Thermo，美國）；IL-6 抗體：大鼠 IL-6 ELISA Kit，Catalog No. EK306/3-480，EK306/3-960（Thermo，美國）；預染 MARKER（SPM103-1，常州天地人和，中國）；轉膜濾紙（1703965，BIO-RAD，美國）；PVDF 膜（18071300，羅氏，瑞士）；ECL 化學發光試劑盒（1705070，BIO-RAD，美國）；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（P0028，上海碧云天生物技術有限公司，中國）；考馬斯亮藍染色液（考馬斯亮藍 0.25 g，甲醇 450 mL，乙酸 100 mL）；考馬斯亮藍脫色液（甲醇 450 mL，乙酸 100 mL，H2O 定容至 1L）；10×麗春紅染色液；IκB 激酶（IKK）α 抗體（ab32041，Abcam，英國）；IKKβ 抗體（ab32041，Abcam，英國）；IKKγ（NEMO） 抗體（ab63551，Abcam，英國）；NF-κB p65 抗體（ab16502，Abcam，英國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 分組
采用隨機數字表法將 30 只 SD 大鼠隨機分為術前基線（baseline，BL）組、動靜脈部分轉流（ECC）組、木犀草素霧化給藥預處理 1 h 組、2 h 組、3 h 組，每組 6 只。
1.2.2 動物模型建立
大鼠使用異氟烷誘導麻醉（0.41 mL/min，氧流量4 L/min）誘導麻醉，機械通氣（呼吸頻率 90 次/min，通氣量 20 mL/min，呼吸比 1∶1），全身肝素化后，頸動靜脈插管，進行體外轉流。體外轉流管使用特制清潔硅膠管（ 長40 cm，內徑 0.8 mm），預充液為肝素水，預充量為 0.4 mL。滾壓泵（StockⅡ小泵，Munich，德國）用于將血從右頸動脈插管轉流入右頸外靜脈。泵轉速為 8～12 轉/min，轉流量為 20～25 mL/min，相當于大鼠心輸出量的 1/3～1/2，轉流開始后，在數分鐘內逐漸將流量加至上述水平，密切觀察大鼠生命體征。BL 組不予任何處理；ECC 組轉流 30 min，觀察 60 min；1 h、2 h、3 h 組分別于轉流前 1 h、2 h、3 h將實驗對象置于小動物霧化給藥儀霧化給藥木犀草素納米制劑（給藥箱氣體容積 8 L，大鼠呼吸頻率 90 次/min，潮氣量 5 mL/次，大鼠霧化時間 20 min，木犀草素納米制劑給藥劑量 10 mg/kg），后續操作同ECC 組。
1.2.3 樣本采集
實驗中設置多個時間節點：T0（轉流開始前），T1（轉流 30 min），T2（觀察 30 min），T3（觀察 60 min）。BL 組于 T0 時間點，ECC、1 h、2 h、3 h 組于 T3 時間點，沿胸骨正中線剪開胸骨，結扎主氣管，游離氣管、雙肺，將其與心臟一起取出。取右肺約 1 cm×1 cm 大小兩塊組織，一塊用檢測肺組織炎性因子；另一塊存于–80℃ 冰箱，待 Western blotting 檢測；用同樣的手法取左肺約 1 cm×1 cm 大小組織用于制備石蠟病理切片；見圖 1。
圖1
實驗分組及操作示意圖
1.2.4 肺組織炎性因子水平測定
稱取適量肺組織，用 9 倍勻漿介質研磨，然后將研磨液離心 10 min，3000～4000 r/min，取上清液制備成 10% 的組織勻漿，放 4℃ 冰箱，采用ELISA檢測炎性因子（TNF-α，IL-6）水平。
1.2.5 解剖病理指標的測定
制備左肺組織石蠟病理切片，對鏡下肺組織的 5 種病理改變進行綜合評估：肺泡腔壁水腫增厚；肺泡腔內出血；中性粒細胞浸潤肺泡腔；中性粒細胞浸潤肺泡壁；肺泡壁透明膜形成（0=無病變，1=有病變）。評分采取雙盲法，累加各項后的總分作為肺病理損傷評分，0 分正常，5 分損傷最嚴重。
1.2.6 蛋白免疫印跡檢測
選用存于–80℃ 冰箱中的右肺組織，使用Western blotting檢測肺組織樣本中 p65、IKKα、IKKβ、IKKγ 的蛋白含量。Western blotting按照標準方法步驟進行。
1.3 統計學分析
數據整理及作圖采用 Microsoft Office Excel 2016（USA）和 GraphPad Prism 8.0。各組數據比較前行方差齊性檢驗，如方差齊則進一步行 t 檢驗或方差分析，如方差不齊則行變量變換再行 t 檢驗或方差分析；使用單因素方差分析進行多組間比較分析，若方差分析各組間有差異，再行兩兩比較。統計數據分析采用 SPSS 25.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA），P≤0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織炎性因子水平比較
ECC 組、1 h、2 h、3 h 組術前 T0 時間點的肺組織炎性水平用 BL 組基線值代替。ECC、1 h、2 h、3 h 組轉流后肺組織中的 IL-6、TNF-α 水平較術前（BL 組）增高，其中 3 h 組肺組織 TNF-α 含量與術前水平差異無統計學意義，其余差異均有統計學意義（P<0.05，圖 2）；1 h、2 h、3 h 組肺組織 IL-6 水平相較 ECC 組均有所降低，差異有統計學意義（P<0.05）；1 h、2 h、3 h 組肺組織 TNF-α 水平相較 ECC 組均有所降低，其中 3 h 組肺組織 TNF-α 水平與 ECC 組的差異有統計學意義（P<0.05，圖 2）；1 h、2 h、3 h 三組內方差分析結果表明，T3 時間點肺組織中 IL-6、TNF-α 水平隨著霧化吸入藥物預處理的時間延長而降低，3 h 組較 1 h、2 h 組的肺組織中 IL-6、TNF-α 水平降低，差異有統計學意義（P<0.05，圖 2）。
表1
實驗前后各組肺組織病理評分比較（每組 n=6，）
圖2
各組間 T3 時間點肺組織炎性因子水平比較
*：
2.2 肺損傷水平比較
ECC 組大鼠的肺組織病理切片可見明顯的肺損傷表現：中性粒細胞浸潤、腔內出血、透明膜形成、細胞內皮增厚等。1 h、2 h、3 h 組也存在部分肺損傷表現，但損傷程度與 ECC 組相比較輕，其中 3 h 組的肺損傷程度較其他兩組輕，僅有少量中性粒細胞浸潤（圖 3）。對各組肺組織進行病理評分，除 3 h 組外，其余各組術后肺組織病理評分高于術前（BL 組）評分，差異有統計學意義（P<0.05，表 1）；1 h、2 h、3 h 組評分均低于 ECC 組，差異有統計學意義（P<0.05，表 1）；3 h 組評分低于 1 h 組和 2 h 組，差異有統計學意義（P<0.05，表 1）。
圖3
各組肺組織病理切片（×200，HE）
a：BL 組；b：1 h 組，肺泡壁增厚、水腫炎性細胞浸潤（黑色箭頭），肺泡腔內出血（藍色箭頭）；c：2 h 組，中性粒細胞浸潤（紅色箭頭）；d：3 h 組，透明膜形成（綠色箭頭）
2.3 蛋白免疫印跡檢測結果
2.3.1 肺組織中 p65 水平
ECC、1 h、2 h、3 h 組肺組織中的 p65 條帶灰度相較于 BL 組，均明顯增加，且隨著霧化吸入木犀草素預處理時間的提前，p65 條帶灰度逐漸下降（圖 4）。
圖4
霧化吸入木犀草素納米制劑預處理時間對體外循環后急性肺損傷大鼠肺組織中 p65 的影響
2.3.2 肺組織中 IKKα、 IKKβ、IKKγ 水平
3 h 組 IKKα 的含量顯著高于 BL 組和 ECC 組，差異有統計學意義（P<0.05，圖 5），其他各組間單因素方差分析中差異無統計學意義；3 h 組 IKKβ 的含量較 ECC 組顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05，圖 5），1 h、2 h組 IKKβ 含量有高于 ECC 組的趨勢，但差異無統計學意義；1 h、2 h、3 h 組 IKKγ 含量有高于 ECC 組的趨勢，但差異均無統計學意義。
圖5
霧化吸入木犀草素納米制劑預處理時間對體外循環后急性肺損傷大鼠肺組織中 IKK 的影響
a：Western blotting（WB）條帶；b：IKKα、IKKβ、IKKγ WB灰度值的相對表達量；*：
3 討論
本實驗通過檢測肺組織炎性因子水平和評估肺組織病理損傷程度，證明了木犀草素在 ECC 導致的 ALI 中具有保護作用。霧化吸入木犀草素納米制劑能顯著降低肺組織中的 IL-6 和 TNF-α 等炎性因子的水平、減輕肺組織病理損傷、緩解大鼠體外轉流后的ALI，達到肺保護的效果，且轉流前 3 h 對大鼠進行霧化木犀草素納米制劑比提前 1 h 和 2 h有更好的肺保護效果。
部分關于木犀草素在動物體內藥物代謝的研究顯示，給藥方式、藥物濃度不同，木犀草素在動物體內的代謝水平有很大差異，藥物半衰期的時長也不同。研究顯示口服木犀草素在動物體內的藥物半衰期為（132±12）min[8]、3.8 h[9]、（5.25±1.28）h[10]不等，考慮到實驗中 ECC 操作和觀察耗時，本實驗最終選擇提前 1 h、2 h 和 3 h 三個時間點進行霧化，以確保大鼠體內的木犀草素在實驗結束之前有足夠的效應含量，同時探究提前霧化的時間與肺保護作用的關聯。本實驗雖然證實了提前 3 h 霧化吸入木犀草素納米制劑的肺保護作用最好，但沒有得出最適提前霧化時間，且沒有將木犀草素的肺保護作用與肺泡藥物濃度聯系起來，以上問題有待進一步研究。
研究[11-14]表明，ALI的發生與 NF-κB 家族信號通路有關。在 TNF-α、LPS 等胞外因素的刺激下，IKK 得到了激活[15]，在此基礎上磷酸化 IκB 蛋白，然后再進行泛素化，隨后 IκB 被蛋白酶解，釋放出的 NF-κB 二聚體（p50/p65）發生核轉移進入細胞核中，與靶向基因結合，促進基因轉錄釋放炎性因子，其中 IKK 復合物在這一過程中發揮了重要的作用。IKK 復合物由 α、β、γ 三部分構成，IKKα 主要參與非經典的 NF-κB 信號通路，活化后的 IKKα 誘發下游的 p100 加工處理為 p52，使信號通路激活[16]；IKKβ 是 NF-κB 經典通路激活的主要激酶[17]，磷酸化的 IKKβ（phosphorylated I-κB kinase β，p-IKKβ）會促進下游 IκB 的磷酸化，p-IκB 形成后，可以誘導后續反應的進行，最終產生 TNF-α、IL-1 等炎性因子，促使炎癥反應發生[18-19]；IKKγ 是 IKK 復合物中的非催化亞基，可以通過與其他兩部分直接作用，介導 IKK 復合物的形成組裝，且其還能促進 IKK 復合物與 IκB 蛋白發生作用[20]。
本實驗中，ECC 組 p65 的含量增加驗證了 p50/p65 二聚體的大量產生，即 NF-κB 經典信號通路得到激活，而 1 h、2 h、3 h 組的 p65 含量逐漸降低，其中 3 h 組的 p65 蛋白含量最低，說明霧化吸入木犀草素后 NF-κB 經典途徑得到了抑制。ECC 組的 IKKβ 含量減少，說明大部分 IKKβ 已經完成了磷酸化，而 1 h、2 h、3 h 組 IKKβ 的含量均較 ECC 組有所增加，其中 3 h 組的差異最為明顯，說明了木犀草素納米制劑可有效增加細胞中 IKKβ 含量，側面印證了其可以降低細胞中 p-IKKβ 的產生。木犀草素對 IKKβ 磷酸化的抑制作用可能是其抑制 NF-κB 信號通路的關鍵環節。
IKKα 和 IKKγ 是 IKK 復合體的重要組成部分。本實驗中，肺組織 IKKα 含量在 3 h 組中明顯增加，提示著木犀草素的抗炎作用有可能與 NF-κB 的非經典途徑有關，但由于未對該途徑中的關鍵蛋白進行檢測，尚不能確定此關系。IKKγ 在各組中的含量差異無統計學意義，僅表明木犀草素處理后肺組織中的 IKKγ 含量有增加趨勢，因此不能認為木犀草素抑制 NF-κB 信號通路的作用機制與 IKKγ 的激活有關。IKKα 與 IKKγ 在本實驗中展現的變化趨勢為進一步的實驗提供了可能的設計方向。
本實驗的不足之處在于未對木犀草素干預 IKK 復合物的上游信號通路的具體環節進行研究。部分研究顯示，IKK 復合物的上游信號銜接蛋白包括 TNF 受體相關因子[21]和受體作用蛋白等，IKK 復合物激酶包括 TGFβ-激活性激酶 1[22-23]和 NF-κB 誘導激酶[23]，以上問題需要進一步的實驗探究。另一方面，本研究雖然通過動物實驗證明了木犀草素對 ECC 所致的 ALI 具有保護作用且對機制進行了初步探索，但并未考慮造成 ALI 的原因對實驗結果可能的影響。如前言部分所述，ECC 導致 ALI 損傷的原因有很多，本研究的動物模型為 ECC 中轉流管作為異物直接接觸導致的 ALI，而缺血-再灌注損傷、低溫等因素并未納入研究，后續可以通過控制變量的成組實驗，深入探究木犀草素對于哪一種原因導致的 ALI 效果更好。
綜上所述，木犀草素在 ECC 導致的 ALI 中具有保護作用，且提前霧化吸入木犀草素納米制劑的時間越長，保護作用也越好，其中提前 3 h 霧化組的肺損傷保護作用最好。木犀草素可以通過抑制 IKKβ 磷酸化過程，從而抑制 NF-κB 經典信號通路，且提前 3 h 霧化組對 NF-κB 信號通路的抑制作用最明顯。本研究為木犀草素應用于 ECC 導致的 ALI 的治療提供了理論依據，提示木犀草素可作為 ALI 保護藥物應用于需要進行 ECC 的手術。
利益沖突：無。
作者貢獻：凌云飛負責動物模型建立和生物學檢測、論文撰寫；曹嶸負責設計和完成實驗；李田歌負責實驗設計和論文撰寫；錢永軍負責文獻檢索和論文審校。
