引用本文： 趙晨宇, 潘予韋, 賈六軍, 張巖, 段亞冰, 丁力, 孫寒松. 局部應用辛伐他汀和機械預處理方法預防靜脈移植物再狹窄的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(2): 291-298. doi: 10.7507/1007-4848.202103021 復制
冠狀動脈旁路移植術是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）的重要治療手段，對于改善患者生活質量起到積極作用[1]。但術后發生靜脈移植物狹窄，進而引起多種不良心血管事件發生，仍是心外科醫師所面臨的棘手問題。據統計，冠狀動脈旁路移植術后大隱靜脈橋的 10 年通暢率為 60%，遠低于乳內動脈橋[2-3]。在臨床工作中，在大隱靜脈獲取后到用于進行吻合這段時間里，游離下來的大隱靜脈通常被保存在含肝素的生理鹽水中待用。在這個時間窗內，一方面可以嘗試將這段血管暴露于含有某種特殊藥物的溶液中，到目前為止有學者嘗試用維拉帕米+硝酸甘油、罌粟堿等藥物對移植物進行處理，也有人嘗試在完成吻合的靜脈移植物周圍局部應用他汀藥物，均取得了一定成果，但尚未見在血管內局部應用他汀藥物對靜脈移植物內膜影響的研究報道；另一方面可以對靜脈移植物進行機械預處理使其提前適應動脈系統的高壓高流量環境，避免其在接入動脈系統后所發生的血流動力學和生物力學的突然改變造成血管結構破壞。
因此，本研究使用辛伐他汀作為預處理藥物在血管內局部應用，使用體外循環機滾壓泵產生的搏動性血流作為機械預處理方法，在兔頸外靜脈獲取后到用于進行移植吻合前的這一時間窗內，對其進行預處理以期達到預防靜脈橋血管狹窄的目的；與此同時，我們還檢測了經辛伐他汀處理后移植物血管組織和體外培養細胞的 YAP 及其下游靶基因的表達情況，對其抑制新生內膜形成的機制進行初步探究。最終為解決冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋血管再狹窄提供新的解決方案。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
選用新西蘭兔 12 只（由阜外醫院動物實驗中心動物合格供應商提供），雌雄不限。設空白對照組、辛伐他汀局部處理組、機械預處理組、藥物機械聯合預處理組（聯合處理組）。利用隨機數字表隨機選擇實驗動物入組，每組 3 只。提前進入設施飼養隔離檢疫，適應環境減少應激；術前檢查，確保動物健康，術前如有異常行為學特征及異常癥狀和體征則排除出實驗。
1.2 預處理方案
空白對照組：直接吻合至同側頸動脈；辛伐他汀局部處理組：靜脈兩端結扎，一側插入 22F 套管針，抽出血管內血液，注入辛伐他汀溶液（濃度 10 mg/mL），靜置 15 min；機械預處理組：使用體外循環機小滾壓泵 1 個、輸液器 2 個、三通閥 2 個、壓力換能器 1 個、22F 套管針 2 個組成的機械預處理裝置。使用生理鹽水 50 mL 預充管路，排除氣泡。靜脈兩端結扎后插入 22F 套管針，將靜脈接入管路，轉機，每 5 min 提高 10 mm Hg 循環壓力至 100 mm Hg，維持 10 min 后取下；聯合處理組：將上述管路的預充液更換為辛伐他汀溶液（濃度 10 mg/mL），余處理方法同前。
1.3 兔頸靜脈旁路移植模型建立
術前稱重，禁食水，并記錄其健康狀態。實驗動物建立耳緣靜脈通路行誘導麻醉，判斷麻醉起效時機，氣管插管接呼吸機輔助通氣，異氟烷維持麻醉。實驗動物固定于手術臺，連接監護儀實時監測動物術中心電圖、血壓、體溫情況。右側頸部備皮，消毒手術部位和鋪巾。選頸動脈搏動強烈處作一 5 cm 縱行手術切口，仔細分離皮下組織，顯露頸外靜脈。給予肝素 400 U/kg 靜脈注射，5 min 后，靜脈兩端以 0 號絲線結扎后按上述預處理方案給予相應處理。繼續鈍性分離深部肌肉組織顯露頸動脈，血管夾阻斷兩端，于中點處斜形剪開，生理鹽水沖洗。將預處理后的靜脈移植物遠端與頸動脈近端以 7-0 Prolene 線行端-端連續縫合，靜脈移植物近端與頸動脈遠端以 7-0 Prolene 線行端-端連續縫合。吻合完成后，開放動脈夾，排氣，打結，打水檢查有無出血。反復確認無活動性出血后縫皮。術后給予鎮痛、抗生素治療以預防感染，常規護理。
1.4 靜脈移植物血管超聲評價
于術后 7 d、14 d 和 21 d 對各組實驗動物術側進行血管超聲檢查。實驗動物晨起禁食水，建立耳緣靜脈通路，注入 1% 丙泊酚注射液 3 mL，待動物麻醉后左側臥位置于檢查臺上行超聲檢查。檢查項目包括：二維超聲觀察靜脈移植物管腔有無異常回聲、靜脈移植物管壁改變情況，多普勒超聲檢測移植物血管內血流速度并記錄數據。
1.5 靜脈移植物病理學檢查
術后 3 周，實驗動物在符合動物實驗倫理條件下進行安樂死并取材。剪開手術切口，剪下靜脈移植物，4% 多聚甲醛溶液固定 24 h。然后 PBS緩沖液充分沖洗樣品，全自動組織脫水機脫水，石蠟包埋，取血管橫切面進行切片，厚度 3.5 μm。蘇木精-伊紅染色（HE 染色）后樹脂封片。顯微鏡下觀察并拍照，Photoshop 12.0 軟件測量新生內膜厚度。
1.6 體外實驗方法
1.6.1 細胞培養
將凍存的人臍血管內皮細胞（HUVEC）復蘇后加入含有 10% 胎牛血清及 1% 青霉素、鏈霉素溶液的 DMEM 培養基中，37℃、5% CO2 培養。每 48 h 更換新鮮培養基，待細胞匯合度至 80%～90% 時使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化，按 1∶3 比例傳代。
1.6.2 細胞增殖抑制實驗
將培養傳至第 4 代的 HUVEC 以 3 000 個細胞/孔接種至 96 孔板。在 37℃、5% CO2 環境中培養 6～8 h，待細胞貼壁后進行實驗。設置高濃度組（辛伐他汀溶液 5 mmol/L）、低濃度組（辛伐他汀溶液 2.5 mmol/L）、溶劑對照組（無水乙醇），分別處理。在處理后的第 3 h、第 11 h 和第 24 h 三個時間點分別檢測細胞增殖情況。每孔加入 10 μL增強型 CCK-8 溶液（Enhanced Cell Counting Kit-8 試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司），在 37℃ 環境中孵育 1 h 后使用酶標儀測量 450 nm 吸光度，記錄數據。
1.6.3 Western-blot 檢測
辛伐他汀（2.5 mmol/L）和溶劑處理 24 h 后，收集 HUVEC，進行 10% SDS-PAGE 膠電泳，轉膜，5% TBST 配脫脂牛奶封閉 1 h 后裁剪對應大小條帶，加入一抗 Yap（#14074）、p-YAPS127（#13008）、β-actin（AF5001）后置于 4℃ 環境中孵育過夜。次日回收一抗，使用 TBST 充分洗膜后加入對應種屬二抗：HRP 標記山羊抗兔 IgG（A0277）、HRP 標記山羊抗小鼠 IgG（A0286），放入搖床內孵育 1 h，充分洗膜后顯影并拍照記錄。
1.6.4 引物設計
在 NCBI 上檢索人ccn1（cyr61）、ccn2（ctgf）、ccn3（fstl1）基因序列，使用 Integrated DNA Technologies 引物設計網站（https://sg.idtdna.com/pages）設計引物；見表 1。
表1
YAP 下游靶基因引物設計
1.6.5 mRNA 的提取、反轉錄及 RT-qPCR
使用 Trizol 液收取剪碎的移植物血管組織和辛伐他汀（2.5 mmol/L）及乙醇溶劑處理 24 h 的 HUVEC，提取總 mRNA，反轉錄為 cDNA 后進行 RT-qPCR 檢測 YAP 及其下游靶基因表達情況。
1.7 統計學分析
采用 IBM SPSS Statistic 24.0 軟件對數據進行統計學分析。正態分布的計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，采用兩獨立樣本 t 檢驗進行組間比較。P≤0.05 為差異有統計學意義。
1.8 倫理審查
本實驗已通過中國醫學科學院阜外醫院實驗動物管理和使用委員會實驗動物福利倫理審批，倫理批號：0102-4-15-ZX（X）-18。
2 結果
2.1 靜脈移植物的大體外觀
在實驗動物實施安樂死術后對手術部位進行解剖，充分顯露頸動脈-靜脈移植物-頸動脈解剖結構，顯示辛伐他汀局部處理組和機械預處理組的靜脈移植物與周圍粘連不重，管徑變化不明顯；聯合處理組、空白對照組的靜脈移植物與周圍組織粘連較明顯，管徑有所增粗；見圖 1。
圖1
靜脈移植物大體觀
辛伐他汀局部處理組（a）、機械預處理組（b）、聯合處理組（c）、空白對照組（d）手術部位靜脈移植物管徑和周圍組織粘連情況；白色箭頭示頸動脈，黑色箭頭示靜脈移植物
2.2 靜脈移植物的超聲影像學改變
實驗動物在術后 1 周、2 周、3 周分別接受術側血管超聲檢查以評估移植部位血流和管壁結構變化。二維超聲顯示，到術后第 3 周末，4 組實驗動物的靜脈移植物管壁均有不同程度的增厚；見圖 2a～d。多普勒超聲結果顯示，血流速度測量標記放置在靜脈移植物內的近端吻合口附近，通過對該位置血流速度變化的監測，間接反映移植物內膜增生情況。組內縱向對比顯示，除辛伐他汀局部處理組外，空白對照組、機械預處理組、聯合處理組的血流速度術后呈逐漸上升趨勢，在術后第 3 周末分別達（0.94±0.05）m/s、（0.75±0.03）m/s、（0.88±0.08）m/s，較第 1 周末分別升高了 118%（P<0.001）、56%（P<0.001）、74%（P<0.01），辛伐他汀局部處理組的血流速度為（0.55±0.10）m/s，較前未見明顯變化（P>0.05）；組間橫向對比顯示，與空白對照組術后第 3 周末的流速相比，辛伐他汀局部處理組和機械預處理組差異均具有統計學意義（P<0.01）；見圖 2e。
圖2
靜脈移植物超聲影像改變
二維超聲下辛伐他汀局部處理組（a）、機械預處理組（b）、聯合處理組（c）、空白對照組（d）的靜脈移植物管壁管腔情況；白色箭頭示增厚的管壁，管腔內未見明顯血栓回聲；f：術后各組靜脈移植物內血流速度變化；除辛伐他汀局部處理組外，其它 3 組術后第 3 周末靜脈移植物內流速均較術后第 1 周明顯升高；與空白對照組相比，辛伐他汀局部處理組和機械預處理組靜脈移植物內流速增加不明顯；**
2.3 靜脈移植物的病理學改變
各組實驗動物在術后第 3 周處死取材，所有靜脈移植物經脫水、包埋、切片、染色等標準石蠟切片制作程序處理后置于顯微鏡下觀察，測量新生內膜厚度。結果顯示：辛伐他汀局部處理組、機械預處理組、聯合處理組、空白對照組的新生內膜厚度分別為：（45.56±4.11）μm、（201.28±16.71）μm、（143.57±7.82）μm、（249.45±13.33）μm。與空白對照組相比，局部應用辛伐他汀處理的靜脈移植物內膜增生厚度降低了 81.7%，應用機械預處理方法的靜脈移植物內膜增生厚度降低了 19.3%，應用機械預處理聯合局部應用辛伐他汀方法降低了 42.4%。各組的新生內膜厚度與空白對照組差異均有統計學意義（P<0.05）；見圖 3。
圖3
不同組別靜脈移植物 HE 切片染色（×10）
辛伐他汀局部處理組（a）、機械預處理組（b）、聯合處理組（c）、空白對照組（d）在術后 3 周末的靜脈移植物新生內膜情況；Bar=100 μm
2.4 各預處理方法對靜脈移植物相關靶基因的影響
將獲得的靜脈移植物置于預先加入 RNA 提取試劑 Trizol 的 Eppendorf 管中，剪碎并勻漿處理，用三氯甲烷-異丙醇法提取 mRNA。反轉錄獲得 cDNA 后，行 RT-qPCR 檢測 Hippo 通路經典下游靶基因 ccn1、ccn2、fstl2、ankrd1 表達量。結果顯示：與空白對照組相比，辛伐他汀局部處理組的 ccn1 表達量明顯降低（P<0.05），聯合處理組的 ccn2 表達量明顯降低（P<0.05），其余差異無統計學意義；見圖 4。
圖4
各預處理方法對靜脈移植物相關靶基因的影響
RT-qPCR 結果顯示辛伐他汀局部處理組的靶基因
2.5 辛伐他汀對 YAP 磷酸化及下游靶基因表達的影響
收取辛伐他汀（2.5 mmol/L）與溶劑對照處理 24 h 的 HUVEC 細胞，Western-blot 檢測 Hippo 通路主要下游效應因子 YAP。結果顯示辛伐他汀組較對照組的 YAP 蛋白總量不變，磷酸化 YAP 蛋白水平升高。RT-qPCR 檢測 Hippo 通路經典下游靶基因 ccn1、ccn2、fstl1、 ankrd1，結果顯示 ccn1 表達量在辛伐他汀處理組中顯著下調（P<0.001），其余靶基因差異無統計學意義；見圖 5。
圖5
辛伐他汀對 HUVEC 的 YAP 磷酸化及其下游靶基因的影響
a：Western-blot 結果顯示辛伐他汀局部處理組較對照組的 YAP 蛋白總量不變，磷酸化 YAP 蛋白水平升高；b：RT-qPCR 結果顯示辛伐他汀處理后 YAP 的靶基因
2.6 辛伐他汀對細胞增殖的影響
對辛伐他汀高濃度組（5 mmol/L）、低濃度組（2.5 mmol/L）和溶劑對照組各組細胞處理后各時間點細胞增殖情況進行檢測，結果顯示處理后第 3 h，高濃度組細胞數量減少，低濃度組和溶劑對照組細胞數量無明顯差異；第 11 h，高濃度組細胞增殖受到明顯抑制（P<0.001），低濃度組細胞增殖速度較溶劑對照組明顯放緩（P<0.05）；第 24 h，鏡下觀察高濃度組細胞幾乎全部死亡，低濃度組細胞增殖速度仍明顯低于溶劑對照組（P<0.05）；見圖 6。
圖6
辛伐他汀對細胞增殖的影響
各組分別接受了高濃度辛伐他汀、低濃度辛伐他汀、乙醇溶劑處理后各時間點的細胞數量變化情況，結果顯示高濃度辛伐他汀有細胞毒性，低濃度辛伐他汀能抑制細胞的增殖；*
3 討論
冠狀動脈旁路移植術是治療冠心病的有效手段，術后橋血管狹窄仍對遠期療效產生影響。盡管全動脈化搭橋已被證實有效[4]，但目前大多數心臟中心還是采用胸廓內動脈+大隱靜脈作為橋血管進行搭橋的手術策略，因此這些患者仍面臨中遠期橋血管再狹窄的問題。通常，將作為橋血管材料的大隱靜脈在冠狀動脈旁路移植術后所發生的一系列病理變化并最終導致橋血管狹窄甚至閉塞的情況稱為靜脈移植物病（vein graft disease，VGD）[5]。主要表現為如下 3 個連續的過程：術后第 1 個月里血栓形成，這一過程可能與對靜脈血管操作不當或動脈血流高剪切力導致的內皮損傷進而促進血小板黏附聚集有關；術后 1 年內內膜增生，Zhang 等[6]的研究顯示在靜脈移植物新生內膜中約有 60% 的細胞來源于骨髓和循環中的母細胞；術后多年逐漸進展的類似動脈粥樣硬化的過程是靜脈移植物再狹窄的主要原因[7]。針對上述病理過程進行干預，可能會對預防 VGD 的發生發展起到積極作用。
一方面，本研究選用了臨床常用降脂藥物辛伐他汀作為干預藥物。在臨床實踐中人們發現，心血管疾病患者應用他汀類藥物的實際獲益高于單純降脂治療的預期獲益。例如，他汀類藥物對于改善心肌病變[8]、改善心力衰竭預后[9]有積極作用。這一系列非降脂相關的效應被稱作他汀多效性（statin pleiotrophy）[10]。血管生物學方面的研究[11-12]顯示，他汀藥物具有改善內皮細胞功能、抑制平滑肌細胞增殖的作用。截至目前，多項臨床研究報道口服高劑量他汀藥物能進一步降低不良心血管事件發生率，但也增加了藥物安全性相關不良事件發生的潛在風險。然而，在血管內局部應用他汀類藥物預防橋血管再狹窄的研究還未見報道。與全身用藥相比，血管內局部給藥具有不受藥物濃度限制、作用直接、無需經機體代謝等優勢。理論上這種方法能在安全濃度范圍內最大程度地提高他汀藥物的作用效率、避免對肝腎等器官的不良影響。本研究結果顯示，在單獨給予血管內局部給藥處理后第 1 周、2 周、3 周的靜脈移植物近心端血流速度無明顯變化，相反空白對照組的血流速度逐漸升高，差異具有統計學意義，提示前者內膜增生情況沒有造成血流動力學的改變；同時病理學檢查證實單純血管內給藥處理的靜脈移植物增生內膜厚度明顯小于空白對照組（P<0.001）。既往研究表明辛伐他汀在改善血管重構方面的表現除與降脂作用相關外還涉及 eNOS 系統調節[13]，Akt/PKB[14]信號通路調控等多種分子機制。研究[15]顯示該藥還可能通過調節 Hippo 信號通路下游的 YAP/TAZ 復合物發揮抑制新生內膜形成的作用。
Hippo 信號通路最早發現于果蠅細胞中[16]，它通過細胞接觸性抑制參與調節細胞增殖凋亡過程，以維持組織形態和內環境穩態[17]。近年來，研究[18]發現該通路在動脈粥樣硬化、血管重塑等心血管疾病進程中也發揮著重要作用。YAP/TAZ 復合物作為 Hippo 通路調控細胞存活、增殖和凋亡的主要下游效應因子在激活后通過定位于核內并與 TEAD 結合，從而誘導靶基因（ccn1、ccn2、ankrd 等）轉錄發揮其作用。ccn1 基因表達的 CCN1 蛋白，也稱 CYR61 蛋白，具有促進內皮細胞、平滑肌細胞增殖和遷移的作用，參與血管損傷修復過程[19]。在本研究中，我們對動物實驗獲得的移植物血管中 YAP 下游靶基因的表達情況進行了分析，結果顯示：辛伐他汀局部處理組的 ccn1 基因表達水平較空白對照組下調，差異具有統計學意義（P<0.05）；體外實驗結果也顯示辛伐他汀處理后細胞的 YAP 蛋白總量不變、磷酸化 YAP 的蛋白量增加、下游靶基因 ccn1 表達下調（P<0.001）。這些結果表明辛伐他汀通過增加 YAP 磷酸化、抑制 YAP 入核、降低下游靶基因 ccn1、ccn2 的表達從而發揮抑制新生內膜形成的作用也是他汀類藥物調節血管重構的機制之一。此外，細胞增殖抑制實驗結果顯示：高濃度辛伐他汀局部應用能夠造成細胞死亡，存在細胞毒性；低濃度辛伐他汀局部應用能明顯減緩細胞增殖，具有抑制細胞增殖作用。這一結果說明局部應用辛伐他汀抑制內膜增生的效應存在劑量依賴性，提示該方法臨床應用前需進行工作濃度的安全性評價，以確定高效安全的預處理液濃度。
另一方面，大隱靜脈橋血管近遠端吻合完畢開通的即刻，橋血管內皮細胞便暴露在動脈高血流量、高剪切力的環境中，血管內的流體狀態發生了巨大變化[20]。為了避免移植物血管內流體狀態突然改變造成的損傷，本研究利用滾壓泵產生的搏動性流體，調節血管內壓力從生理狀態下靜脈壓開始緩慢提高到動脈系統壓力，從而達到預適應的目的。研究結果顯示：在單獨給予機械處理后第 1 周、2 周、3 周的靜脈移植物近心端血流速度和空白對照組的血流速度都有升高，但升高程度顯著低于后者（P<0.01）；同時病理切片證實，經這種干預方式處理的靜脈移植物內膜存在增厚，但仍低于空白對照組的新生內膜厚度，差異具有統計學意義（P<0.05）。這說明機械預處理方式能夠起到延緩新生內膜形成的作用。隨后，本研究將機械預處理管路的預充液更換為辛伐他汀溶液對靜脈移植物進行預處理，研究結果顯示：經該方式處理的靜脈移植物在術后第 3 周時有新生內膜形成，但厚度顯著小于空白對照組（P<0.001）。此前有研究顯示，在暴露于高速湍流的血管內皮細胞中，YAP/TAZ 復合物被激活，轉移進入細胞核內，隨后伴有促進內皮細胞增殖活躍和凋亡抑制的相關靶基因的上調。反之，在內皮細胞中抑制 YAP/TAZ 能夠抑制 JNK 信號傳導，下調炎性基因表達，減少單核細胞粘附及滲透[18]；在平滑肌細胞中敲除 YAP/TAZ 復合物能夠緩解損傷介導的平滑肌細胞表型轉化為增殖型，進而減輕小鼠新生內膜的形成。同樣地，通過 RNAi 技術或維替泊芬抑制 YAP/TAZ 復合物功能可顯著降低血管平滑肌細胞的增殖[21-22]。我們的研究結果顯示，聯合處理組的靜脈移植物中 YAP 下游靶基因 ccn2 的表達下調。 ccn2 基因表達的 CCN2 蛋白，也稱結締組織生長因子，該蛋白可引起多種細胞反應，包括減少細胞粘附，增強細胞遷移和增殖。由此可見，采用辛伐他汀與機械預處理相結合的方式能夠使在靜脈移植物提前適應動脈血流環境的同時抑制 YAP/TAZ 效應因子入核，降低下游靶基因 ccn2 的表達，從而發揮減輕血流狀態改變對靜脈移植物新生內膜增殖的促進作用。
綜上所述，本研究得出如下結論：血管內局部應用辛伐他汀和機械預處理方法單用或聯用均能抑制靜脈移植物內膜增生；高濃度的辛伐他汀有細胞毒性，低濃度的辛伐他汀有抑制細胞增殖的作用；辛伐他汀通過抑制 YAP 入核、降低細胞增殖相關靶基因 ccn1 的轉錄發揮抑制新生內膜形成的作用。本研究為解決冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋血管再狹窄提供了新的解決方案。
利益沖突：無。
作者貢獻：趙晨宇負責課題設計，動物實驗，論文撰寫；潘予韋負責分子生物學實驗，數據分析整理；賈六軍負責實驗動物模型建立；段亞冰、丁力負責數據分析整理；張巖、孫寒松負責論文審閱與修改。
冠狀動脈旁路移植術是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）的重要治療手段，對于改善患者生活質量起到積極作用[1]。但術后發生靜脈移植物狹窄，進而引起多種不良心血管事件發生，仍是心外科醫師所面臨的棘手問題。據統計，冠狀動脈旁路移植術后大隱靜脈橋的 10 年通暢率為 60%，遠低于乳內動脈橋[2-3]。在臨床工作中，在大隱靜脈獲取后到用于進行吻合這段時間里，游離下來的大隱靜脈通常被保存在含肝素的生理鹽水中待用。在這個時間窗內，一方面可以嘗試將這段血管暴露于含有某種特殊藥物的溶液中，到目前為止有學者嘗試用維拉帕米+硝酸甘油、罌粟堿等藥物對移植物進行處理，也有人嘗試在完成吻合的靜脈移植物周圍局部應用他汀藥物，均取得了一定成果，但尚未見在血管內局部應用他汀藥物對靜脈移植物內膜影響的研究報道；另一方面可以對靜脈移植物進行機械預處理使其提前適應動脈系統的高壓高流量環境，避免其在接入動脈系統后所發生的血流動力學和生物力學的突然改變造成血管結構破壞。
因此，本研究使用辛伐他汀作為預處理藥物在血管內局部應用，使用體外循環機滾壓泵產生的搏動性血流作為機械預處理方法，在兔頸外靜脈獲取后到用于進行移植吻合前的這一時間窗內，對其進行預處理以期達到預防靜脈橋血管狹窄的目的；與此同時，我們還檢測了經辛伐他汀處理后移植物血管組織和體外培養細胞的 YAP 及其下游靶基因的表達情況，對其抑制新生內膜形成的機制進行初步探究。最終為解決冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋血管再狹窄提供新的解決方案。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
選用新西蘭兔 12 只（由阜外醫院動物實驗中心動物合格供應商提供），雌雄不限。設空白對照組、辛伐他汀局部處理組、機械預處理組、藥物機械聯合預處理組（聯合處理組）。利用隨機數字表隨機選擇實驗動物入組，每組 3 只。提前進入設施飼養隔離檢疫，適應環境減少應激；術前檢查，確保動物健康，術前如有異常行為學特征及異常癥狀和體征則排除出實驗。
1.2 預處理方案
空白對照組：直接吻合至同側頸動脈；辛伐他汀局部處理組：靜脈兩端結扎，一側插入 22F 套管針，抽出血管內血液，注入辛伐他汀溶液（濃度 10 mg/mL），靜置 15 min；機械預處理組：使用體外循環機小滾壓泵 1 個、輸液器 2 個、三通閥 2 個、壓力換能器 1 個、22F 套管針 2 個組成的機械預處理裝置。使用生理鹽水 50 mL 預充管路，排除氣泡。靜脈兩端結扎后插入 22F 套管針，將靜脈接入管路，轉機，每 5 min 提高 10 mm Hg 循環壓力至 100 mm Hg，維持 10 min 后取下；聯合處理組：將上述管路的預充液更換為辛伐他汀溶液（濃度 10 mg/mL），余處理方法同前。
1.3 兔頸靜脈旁路移植模型建立
術前稱重，禁食水，并記錄其健康狀態。實驗動物建立耳緣靜脈通路行誘導麻醉，判斷麻醉起效時機，氣管插管接呼吸機輔助通氣，異氟烷維持麻醉。實驗動物固定于手術臺，連接監護儀實時監測動物術中心電圖、血壓、體溫情況。右側頸部備皮，消毒手術部位和鋪巾。選頸動脈搏動強烈處作一 5 cm 縱行手術切口，仔細分離皮下組織，顯露頸外靜脈。給予肝素 400 U/kg 靜脈注射，5 min 后，靜脈兩端以 0 號絲線結扎后按上述預處理方案給予相應處理。繼續鈍性分離深部肌肉組織顯露頸動脈，血管夾阻斷兩端，于中點處斜形剪開，生理鹽水沖洗。將預處理后的靜脈移植物遠端與頸動脈近端以 7-0 Prolene 線行端-端連續縫合，靜脈移植物近端與頸動脈遠端以 7-0 Prolene 線行端-端連續縫合。吻合完成后，開放動脈夾，排氣，打結，打水檢查有無出血。反復確認無活動性出血后縫皮。術后給予鎮痛、抗生素治療以預防感染，常規護理。
1.4 靜脈移植物血管超聲評價
于術后 7 d、14 d 和 21 d 對各組實驗動物術側進行血管超聲檢查。實驗動物晨起禁食水，建立耳緣靜脈通路，注入 1% 丙泊酚注射液 3 mL，待動物麻醉后左側臥位置于檢查臺上行超聲檢查。檢查項目包括：二維超聲觀察靜脈移植物管腔有無異常回聲、靜脈移植物管壁改變情況，多普勒超聲檢測移植物血管內血流速度并記錄數據。
1.5 靜脈移植物病理學檢查
術后 3 周，實驗動物在符合動物實驗倫理條件下進行安樂死并取材。剪開手術切口，剪下靜脈移植物，4% 多聚甲醛溶液固定 24 h。然后 PBS緩沖液充分沖洗樣品，全自動組織脫水機脫水，石蠟包埋，取血管橫切面進行切片，厚度 3.5 μm。蘇木精-伊紅染色（HE 染色）后樹脂封片。顯微鏡下觀察并拍照，Photoshop 12.0 軟件測量新生內膜厚度。
1.6 體外實驗方法
1.6.1 細胞培養
將凍存的人臍血管內皮細胞（HUVEC）復蘇后加入含有 10% 胎牛血清及 1% 青霉素、鏈霉素溶液的 DMEM 培養基中，37℃、5% CO2 培養。每 48 h 更換新鮮培養基，待細胞匯合度至 80%～90% 時使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化，按 1∶3 比例傳代。
1.6.2 細胞增殖抑制實驗
將培養傳至第 4 代的 HUVEC 以 3 000 個細胞/孔接種至 96 孔板。在 37℃、5% CO2 環境中培養 6～8 h，待細胞貼壁后進行實驗。設置高濃度組（辛伐他汀溶液 5 mmol/L）、低濃度組（辛伐他汀溶液 2.5 mmol/L）、溶劑對照組（無水乙醇），分別處理。在處理后的第 3 h、第 11 h 和第 24 h 三個時間點分別檢測細胞增殖情況。每孔加入 10 μL增強型 CCK-8 溶液（Enhanced Cell Counting Kit-8 試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司），在 37℃ 環境中孵育 1 h 后使用酶標儀測量 450 nm 吸光度，記錄數據。
1.6.3 Western-blot 檢測
辛伐他汀（2.5 mmol/L）和溶劑處理 24 h 后，收集 HUVEC，進行 10% SDS-PAGE 膠電泳，轉膜，5% TBST 配脫脂牛奶封閉 1 h 后裁剪對應大小條帶，加入一抗 Yap（#14074）、p-YAPS127（#13008）、β-actin（AF5001）后置于 4℃ 環境中孵育過夜。次日回收一抗，使用 TBST 充分洗膜后加入對應種屬二抗：HRP 標記山羊抗兔 IgG（A0277）、HRP 標記山羊抗小鼠 IgG（A0286），放入搖床內孵育 1 h，充分洗膜后顯影并拍照記錄。
1.6.4 引物設計
在 NCBI 上檢索人ccn1（cyr61）、ccn2（ctgf）、ccn3（fstl1）基因序列，使用 Integrated DNA Technologies 引物設計網站（https://sg.idtdna.com/pages）設計引物；見表 1。
表1
YAP 下游靶基因引物設計
1.6.5 mRNA 的提取、反轉錄及 RT-qPCR
使用 Trizol 液收取剪碎的移植物血管組織和辛伐他汀（2.5 mmol/L）及乙醇溶劑處理 24 h 的 HUVEC，提取總 mRNA，反轉錄為 cDNA 后進行 RT-qPCR 檢測 YAP 及其下游靶基因表達情況。
1.7 統計學分析
采用 IBM SPSS Statistic 24.0 軟件對數據進行統計學分析。正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用兩獨立樣本 t 檢驗進行組間比較。P≤0.05 為差異有統計學意義。
1.8 倫理審查
本實驗已通過中國醫學科學院阜外醫院實驗動物管理和使用委員會實驗動物福利倫理審批，倫理批號：0102-4-15-ZX（X）-18。
2 結果
2.1 靜脈移植物的大體外觀
在實驗動物實施安樂死術后對手術部位進行解剖，充分顯露頸動脈-靜脈移植物-頸動脈解剖結構，顯示辛伐他汀局部處理組和機械預處理組的靜脈移植物與周圍粘連不重，管徑變化不明顯；聯合處理組、空白對照組的靜脈移植物與周圍組織粘連較明顯，管徑有所增粗；見圖 1。
圖1
靜脈移植物大體觀
辛伐他汀局部處理組（a）、機械預處理組（b）、聯合處理組（c）、空白對照組（d）手術部位靜脈移植物管徑和周圍組織粘連情況；白色箭頭示頸動脈，黑色箭頭示靜脈移植物
2.2 靜脈移植物的超聲影像學改變
實驗動物在術后 1 周、2 周、3 周分別接受術側血管超聲檢查以評估移植部位血流和管壁結構變化。二維超聲顯示，到術后第 3 周末，4 組實驗動物的靜脈移植物管壁均有不同程度的增厚；見圖 2a～d。多普勒超聲結果顯示，血流速度測量標記放置在靜脈移植物內的近端吻合口附近，通過對該位置血流速度變化的監測，間接反映移植物內膜增生情況。組內縱向對比顯示，除辛伐他汀局部處理組外，空白對照組、機械預處理組、聯合處理組的血流速度術后呈逐漸上升趨勢，在術后第 3 周末分別達（0.94±0.05）m/s、（0.75±0.03）m/s、（0.88±0.08）m/s，較第 1 周末分別升高了 118%（P<0.001）、56%（P<0.001）、74%（P<0.01），辛伐他汀局部處理組的血流速度為（0.55±0.10）m/s，較前未見明顯變化（P>0.05）；組間橫向對比顯示，與空白對照組術后第 3 周末的流速相比，辛伐他汀局部處理組和機械預處理組差異均具有統計學意義（P<0.01）；見圖 2e。
圖2
靜脈移植物超聲影像改變
二維超聲下辛伐他汀局部處理組（a）、機械預處理組（b）、聯合處理組（c）、空白對照組（d）的靜脈移植物管壁管腔情況；白色箭頭示增厚的管壁，管腔內未見明顯血栓回聲；f：術后各組靜脈移植物內血流速度變化；除辛伐他汀局部處理組外，其它 3 組術后第 3 周末靜脈移植物內流速均較術后第 1 周明顯升高；與空白對照組相比，辛伐他汀局部處理組和機械預處理組靜脈移植物內流速增加不明顯；**
2.3 靜脈移植物的病理學改變
各組實驗動物在術后第 3 周處死取材，所有靜脈移植物經脫水、包埋、切片、染色等標準石蠟切片制作程序處理后置于顯微鏡下觀察，測量新生內膜厚度。結果顯示：辛伐他汀局部處理組、機械預處理組、聯合處理組、空白對照組的新生內膜厚度分別為：（45.56±4.11）μm、（201.28±16.71）μm、（143.57±7.82）μm、（249.45±13.33）μm。與空白對照組相比，局部應用辛伐他汀處理的靜脈移植物內膜增生厚度降低了 81.7%，應用機械預處理方法的靜脈移植物內膜增生厚度降低了 19.3%，應用機械預處理聯合局部應用辛伐他汀方法降低了 42.4%。各組的新生內膜厚度與空白對照組差異均有統計學意義（P<0.05）；見圖 3。
圖3
不同組別靜脈移植物 HE 切片染色（×10）
辛伐他汀局部處理組（a）、機械預處理組（b）、聯合處理組（c）、空白對照組（d）在術后 3 周末的靜脈移植物新生內膜情況；Bar=100 μm
2.4 各預處理方法對靜脈移植物相關靶基因的影響
將獲得的靜脈移植物置于預先加入 RNA 提取試劑 Trizol 的 Eppendorf 管中，剪碎并勻漿處理，用三氯甲烷-異丙醇法提取 mRNA。反轉錄獲得 cDNA 后，行 RT-qPCR 檢測 Hippo 通路經典下游靶基因 ccn1、ccn2、fstl2、ankrd1 表達量。結果顯示：與空白對照組相比，辛伐他汀局部處理組的 ccn1 表達量明顯降低（P<0.05），聯合處理組的 ccn2 表達量明顯降低（P<0.05），其余差異無統計學意義；見圖 4。
圖4
各預處理方法對靜脈移植物相關靶基因的影響
RT-qPCR 結果顯示辛伐他汀局部處理組的靶基因
2.5 辛伐他汀對 YAP 磷酸化及下游靶基因表達的影響
收取辛伐他汀（2.5 mmol/L）與溶劑對照處理 24 h 的 HUVEC 細胞，Western-blot 檢測 Hippo 通路主要下游效應因子 YAP。結果顯示辛伐他汀組較對照組的 YAP 蛋白總量不變，磷酸化 YAP 蛋白水平升高。RT-qPCR 檢測 Hippo 通路經典下游靶基因 ccn1、ccn2、fstl1、 ankrd1，結果顯示 ccn1 表達量在辛伐他汀處理組中顯著下調（P<0.001），其余靶基因差異無統計學意義；見圖 5。
圖5
辛伐他汀對 HUVEC 的 YAP 磷酸化及其下游靶基因的影響
a：Western-blot 結果顯示辛伐他汀局部處理組較對照組的 YAP 蛋白總量不變，磷酸化 YAP 蛋白水平升高；b：RT-qPCR 結果顯示辛伐他汀處理后 YAP 的靶基因
2.6 辛伐他汀對細胞增殖的影響
對辛伐他汀高濃度組（5 mmol/L）、低濃度組（2.5 mmol/L）和溶劑對照組各組細胞處理后各時間點細胞增殖情況進行檢測，結果顯示處理后第 3 h，高濃度組細胞數量減少，低濃度組和溶劑對照組細胞數量無明顯差異；第 11 h，高濃度組細胞增殖受到明顯抑制（P<0.001），低濃度組細胞增殖速度較溶劑對照組明顯放緩（P<0.05）；第 24 h，鏡下觀察高濃度組細胞幾乎全部死亡，低濃度組細胞增殖速度仍明顯低于溶劑對照組（P<0.05）；見圖 6。
圖6
辛伐他汀對細胞增殖的影響
各組分別接受了高濃度辛伐他汀、低濃度辛伐他汀、乙醇溶劑處理后各時間點的細胞數量變化情況，結果顯示高濃度辛伐他汀有細胞毒性，低濃度辛伐他汀能抑制細胞的增殖；*
3 討論
冠狀動脈旁路移植術是治療冠心病的有效手段，術后橋血管狹窄仍對遠期療效產生影響。盡管全動脈化搭橋已被證實有效[4]，但目前大多數心臟中心還是采用胸廓內動脈+大隱靜脈作為橋血管進行搭橋的手術策略，因此這些患者仍面臨中遠期橋血管再狹窄的問題。通常，將作為橋血管材料的大隱靜脈在冠狀動脈旁路移植術后所發生的一系列病理變化并最終導致橋血管狹窄甚至閉塞的情況稱為靜脈移植物病（vein graft disease，VGD）[5]。主要表現為如下 3 個連續的過程：術后第 1 個月里血栓形成，這一過程可能與對靜脈血管操作不當或動脈血流高剪切力導致的內皮損傷進而促進血小板黏附聚集有關；術后 1 年內內膜增生，Zhang 等[6]的研究顯示在靜脈移植物新生內膜中約有 60% 的細胞來源于骨髓和循環中的母細胞；術后多年逐漸進展的類似動脈粥樣硬化的過程是靜脈移植物再狹窄的主要原因[7]。針對上述病理過程進行干預，可能會對預防 VGD 的發生發展起到積極作用。
一方面，本研究選用了臨床常用降脂藥物辛伐他汀作為干預藥物。在臨床實踐中人們發現，心血管疾病患者應用他汀類藥物的實際獲益高于單純降脂治療的預期獲益。例如，他汀類藥物對于改善心肌病變[8]、改善心力衰竭預后[9]有積極作用。這一系列非降脂相關的效應被稱作他汀多效性（statin pleiotrophy）[10]。血管生物學方面的研究[11-12]顯示，他汀藥物具有改善內皮細胞功能、抑制平滑肌細胞增殖的作用。截至目前，多項臨床研究報道口服高劑量他汀藥物能進一步降低不良心血管事件發生率，但也增加了藥物安全性相關不良事件發生的潛在風險。然而，在血管內局部應用他汀類藥物預防橋血管再狹窄的研究還未見報道。與全身用藥相比，血管內局部給藥具有不受藥物濃度限制、作用直接、無需經機體代謝等優勢。理論上這種方法能在安全濃度范圍內最大程度地提高他汀藥物的作用效率、避免對肝腎等器官的不良影響。本研究結果顯示，在單獨給予血管內局部給藥處理后第 1 周、2 周、3 周的靜脈移植物近心端血流速度無明顯變化，相反空白對照組的血流速度逐漸升高，差異具有統計學意義，提示前者內膜增生情況沒有造成血流動力學的改變；同時病理學檢查證實單純血管內給藥處理的靜脈移植物增生內膜厚度明顯小于空白對照組（P<0.001）。既往研究表明辛伐他汀在改善血管重構方面的表現除與降脂作用相關外還涉及 eNOS 系統調節[13]，Akt/PKB[14]信號通路調控等多種分子機制。研究[15]顯示該藥還可能通過調節 Hippo 信號通路下游的 YAP/TAZ 復合物發揮抑制新生內膜形成的作用。
Hippo 信號通路最早發現于果蠅細胞中[16]，它通過細胞接觸性抑制參與調節細胞增殖凋亡過程，以維持組織形態和內環境穩態[17]。近年來，研究[18]發現該通路在動脈粥樣硬化、血管重塑等心血管疾病進程中也發揮著重要作用。YAP/TAZ 復合物作為 Hippo 通路調控細胞存活、增殖和凋亡的主要下游效應因子在激活后通過定位于核內并與 TEAD 結合，從而誘導靶基因（ccn1、ccn2、ankrd 等）轉錄發揮其作用。ccn1 基因表達的 CCN1 蛋白，也稱 CYR61 蛋白，具有促進內皮細胞、平滑肌細胞增殖和遷移的作用，參與血管損傷修復過程[19]。在本研究中，我們對動物實驗獲得的移植物血管中 YAP 下游靶基因的表達情況進行了分析，結果顯示：辛伐他汀局部處理組的 ccn1 基因表達水平較空白對照組下調，差異具有統計學意義（P<0.05）；體外實驗結果也顯示辛伐他汀處理后細胞的 YAP 蛋白總量不變、磷酸化 YAP 的蛋白量增加、下游靶基因 ccn1 表達下調（P<0.001）。這些結果表明辛伐他汀通過增加 YAP 磷酸化、抑制 YAP 入核、降低下游靶基因 ccn1、ccn2 的表達從而發揮抑制新生內膜形成的作用也是他汀類藥物調節血管重構的機制之一。此外，細胞增殖抑制實驗結果顯示：高濃度辛伐他汀局部應用能夠造成細胞死亡，存在細胞毒性；低濃度辛伐他汀局部應用能明顯減緩細胞增殖，具有抑制細胞增殖作用。這一結果說明局部應用辛伐他汀抑制內膜增生的效應存在劑量依賴性，提示該方法臨床應用前需進行工作濃度的安全性評價，以確定高效安全的預處理液濃度。
另一方面，大隱靜脈橋血管近遠端吻合完畢開通的即刻，橋血管內皮細胞便暴露在動脈高血流量、高剪切力的環境中，血管內的流體狀態發生了巨大變化[20]。為了避免移植物血管內流體狀態突然改變造成的損傷，本研究利用滾壓泵產生的搏動性流體，調節血管內壓力從生理狀態下靜脈壓開始緩慢提高到動脈系統壓力，從而達到預適應的目的。研究結果顯示：在單獨給予機械處理后第 1 周、2 周、3 周的靜脈移植物近心端血流速度和空白對照組的血流速度都有升高，但升高程度顯著低于后者（P<0.01）；同時病理切片證實，經這種干預方式處理的靜脈移植物內膜存在增厚，但仍低于空白對照組的新生內膜厚度，差異具有統計學意義（P<0.05）。這說明機械預處理方式能夠起到延緩新生內膜形成的作用。隨后，本研究將機械預處理管路的預充液更換為辛伐他汀溶液對靜脈移植物進行預處理，研究結果顯示：經該方式處理的靜脈移植物在術后第 3 周時有新生內膜形成，但厚度顯著小于空白對照組（P<0.001）。此前有研究顯示，在暴露于高速湍流的血管內皮細胞中，YAP/TAZ 復合物被激活，轉移進入細胞核內，隨后伴有促進內皮細胞增殖活躍和凋亡抑制的相關靶基因的上調。反之，在內皮細胞中抑制 YAP/TAZ 能夠抑制 JNK 信號傳導，下調炎性基因表達，減少單核細胞粘附及滲透[18]；在平滑肌細胞中敲除 YAP/TAZ 復合物能夠緩解損傷介導的平滑肌細胞表型轉化為增殖型，進而減輕小鼠新生內膜的形成。同樣地，通過 RNAi 技術或維替泊芬抑制 YAP/TAZ 復合物功能可顯著降低血管平滑肌細胞的增殖[21-22]。我們的研究結果顯示，聯合處理組的靜脈移植物中 YAP 下游靶基因 ccn2 的表達下調。 ccn2 基因表達的 CCN2 蛋白，也稱結締組織生長因子，該蛋白可引起多種細胞反應，包括減少細胞粘附，增強細胞遷移和增殖。由此可見，采用辛伐他汀與機械預處理相結合的方式能夠使在靜脈移植物提前適應動脈血流環境的同時抑制 YAP/TAZ 效應因子入核，降低下游靶基因 ccn2 的表達，從而發揮減輕血流狀態改變對靜脈移植物新生內膜增殖的促進作用。
綜上所述，本研究得出如下結論：血管內局部應用辛伐他汀和機械預處理方法單用或聯用均能抑制靜脈移植物內膜增生；高濃度的辛伐他汀有細胞毒性，低濃度的辛伐他汀有抑制細胞增殖的作用；辛伐他汀通過抑制 YAP 入核、降低細胞增殖相關靶基因 ccn1 的轉錄發揮抑制新生內膜形成的作用。本研究為解決冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋血管再狹窄提供了新的解決方案。
利益沖突：無。
作者貢獻：趙晨宇負責課題設計，動物實驗，論文撰寫；潘予韋負責分子生物學實驗，數據分析整理；賈六軍負責實驗動物模型建立；段亞冰、丁力負責數據分析整理；張巖、孫寒松負責論文審閱與修改。
