引用本文： 劉旭, 鄧紅玉, 周平. 分泌型蛋白質 GREM1 在體-肺分流性肺動脈高壓中的作用. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2021, 28(4): 479-487. doi: 10.7507/1007-4848.202007070 復制
先天性心臟病相關肺動脈高壓（congenital heart diseases associated pulmonary artery hypertension，CHD/PAH）是因先天性心臟血管發育畸形引起體肺循環間存在異常分流通路，導致肺循環持續的容量和壓力超負荷、肺阻力血管重構及管腔狹窄，并逐漸導致右心衰竭和死亡[1]。近 20 年來，PAH 領域的重大突破是證實骨形態發生蛋白 2 型受體（BMPR2）的雜合突變導致 BMP 信號通路受抑制，并導致 PAH 的形成[2-3]。但作為特殊類型的 PAH，CHD/PAH 的 BMPR2 致病突變率極低，而 CHD/PAH 患者肺組織 BMP 信號通路的下調卻普遍存在[4]。近期 CHD/PAH 大鼠模型也證實了體-肺性肺組織 BMP 通路的下調[5]，理論上這種非 BMPR2 基因突變依賴性的 BMP 通路的下調同樣導致了體-肺分流性 PAH 的形成，但是其下調機制不明確。
研究[6]發現肺小動脈內皮細胞（PAECs）的過度增殖和凋亡抵抗是肺血管重構的關鍵步驟。先前的研究[7]已證實低氧可刺激 PAECs 分泌 BMP 拮抗因子 GREM1，而 GREM1 通過缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在低氧性 PAH 中發揮重要作用。而體-肺分流性 PAH 的肺循環是高氧狀態，不存在 HIF-1α 的高表達，這和低氧性 PAH 完全相反。研究發現 GREM1 可拮抗 BMP2，進而抑制 BMP 信號通路的活性，因此本研究推測體-肺分流狀態下，肺循環剪切力的增加使肺組織 GREM1 的分泌增加，抑制 BMP 信號通路，進而誘使肺血管重構。
1 材料與方法
1.1 實驗器材及試劑
生理記錄儀（PowerLab 16/30，AD Instruments），小動物呼吸機（Inspria ASVP，Harvard Apparatus），右心導管（北京協和醫學院基礎所缺氧病理生理學實驗室），小動物心臟超聲儀（MS250，VEVO 2100），AMV 逆轉錄試劑盒及 PCR 引物（TaKaRa 生物工程有限公司），Brdu 細胞增殖 Elisa 試劑盒（Abcam 公司），重組 BMP2 蛋白，重組人 GREM1 蛋白及抗 GREM1 抗體（R&D 公司），抗 HIF-1α 抗體（Santa Cruz 公司），抗 BMPR1A 抗體、抗 BMPR2 抗體及抗分化抑制因子-1（Id-1）抗體（Abcam 公司），P-Smad1/5/8（Cell Signaling Technology 公司），Smad1/5/8（Santa Cruz 公司），GREM1 酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒（Elisa kit，Aviva Systems Biology 公司），抗 GAPDH 抗體（Abmart 公司），辣根過氧化物酶標記的抗鼠二抗（Santa Cruz 公司），Power SYBR green PCR mastermix（ABI 公司），TRIzol（Invitrogen 公司），鼠肺動脈內皮細胞（pulmonary arterial endothelial cells，PAECs，ScienCell 公司），10% 水合氯醛（北京亮東科技有限公司），10% 中性福爾馬林（北京益利精細化學品有限公司）。
1.2 實驗動物及分組
Sprague Dawley（SD）大鼠 30 只，7～9 周齡，體重 150～250 g，由中南大學動物實驗中心提供。大鼠隨機分為假手術組（sham operation group，SOG，n=10），分流手術組（shunt group，SG，n=10）和分流矯治組（shunt correction group，SCG，n=10）。
1.3 體-肺分流模型的制備及評估
1.3.1 模型制備
SG 組采取“右肺動脈結扎+左頸總動脈-左頸外靜脈分流”的術式構建，然后喂養 12 周；SCG 組采取“右肺動脈結扎+左頸總動脈-左頸外靜脈分流”的術式構建，12 周后再次手術結扎頸部分流，然后繼續喂養 4 周；SOG 組的手術流程和 SG 組相同，但不結扎右肺動脈，也不建立左頸部分流，術后喂養 12 周。術后給予阿司匹林抗凝及氫氯噻嗪預防肺水腫，術后置于 21℃ 恒溫室內飼養（濕度 50%～70%），持續喂養至 12 周[8]。
1.3.2 心臟超聲及右心導管評估及取材
術后 12 周，先以心臟超聲行右心室形態學改變的測量，具體方法如下：10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g 體重）麻醉大鼠，仰臥位固定，備皮，涂抹耦合劑，四肢粘貼心電圖電極片（監測心臟收縮和舒張時相），經胸骨旁長軸切面測量右心室舒張期內徑（右室游離壁至室間隔的最大距離）及游離壁厚；后采取右心系統測壓[8]，即經右頸外靜脈置入右心導管，以壓力波形和波幅判斷其在右心系統中的位置，同時記錄壓力值，包括右心室收縮壓（RVSP）、肺動脈收縮壓（PASP）及平均肺動脈壓（mPAP）等[9]。
測壓后，經下腔靜脈取血 0.3 mL，4℃ 靜置 30 min，3 000 轉/分離心 15 min；取上清分裝后保存于?80℃ 冰箱，以備后續 Elisa 檢測 GREM1 濃度。然后剪下心、肺組織，迅速將左肺上部凍存于?80℃ 液氮，后續采用 Elisa 法檢測大鼠血漿 GREM1 濃度，Elisa 試劑盒的測定范圍為 125～8 000 pg/mL，具體操作依照說明書進行。后將左肺下部常溫固定于 10% 中性福爾馬林 24 h，后流水常溫沖洗 12 h，常規梯度脫水制成組織蠟塊。最后修剪右心室（RV）和左心室（LV）+室間隔（S）標本，稱取濕重，計算右心室肥厚指數（RV/LV+S）。
1.3.3 肺血管重構分析及 GREM1 肺組織定位分析
每個肺組織蠟塊切 4 張 5 μm 厚的切片，2 張做蘇木精-伊紅（HE）染色，采用 Heath 和 Edwards[10]提出的肺血管病變等級進行肺血管重構病變分析；另 2 張用于免疫熒光染色，觀察肺組織 GREM1 的定位，具體操作如下：取 4 μm 厚肺組織切片貼片，37℃ 烤箱內烤干；二甲苯脫蠟 20 min；95%～85% 無水乙醇梯度脫水 15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌（5 min×3 次）；3% H2O2 室溫浸潤 10 min，PBS 洗滌（5 min×3 次）；100℃ 的 0.01 mol/L 的枸緣酸鈉緩沖液中修復抗原；0.3% Triton X-100 孵育 20 min；山羊血清封閉 20 min，滴加一抗（GREM1，1∶ 200），4℃ 孵育 12 h，37℃ 復溫 1 h，PBS 洗滌（5 min×3 次）；滴加辣根過氧化物酶標記二抗（1∶400），37℃ 孵育 1 h；PBS 洗滌（5 min×3 次），DAB 顯色液顯色 10 min，鏡下觀察顯色情況，PBS 沖洗停止顯色；蘇木精復染 2 min；1% 鹽酸乙醇分化 20 s；PBS 沖洗；無水乙醇梯度脫水；二甲苯透明；封片，鏡檢拍片。
1.4 體外細胞實驗
復蘇液氮中凍存的 PAECs，以完全內皮細胞培養液在恒溫細胞培養箱中培養（37℃，5% CO2），將第 3 代 PAECs 以 2×105 的密度接種于細胞培養瓶（25 cm2），待細胞融合至 80%～90% 時進行功能學研究。將細胞分為 3 組：對照組、刺激組（BMP2 0、5、25、125 ng/mL）和拮抗組［BMP2（25 ng/mL）+GREM1（0、10、100、1 000、2 000 ng/mL）］。
1.4.1 PAECs 的增殖測定
PAECs 的增殖情況采取 5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）摻入法進行評估。將 PAECs 以每孔 1×103 個細胞的密度接種在 96 孔板中，并在 100 μL 完全細胞培養基中過夜，然后在基礎細胞培養基［0.2% 胎牛血清（FBS）］中饑餓培養 48 h，之后用含不同濃度 BMP2（0、1、5、25 和 125 ng/mL）和（或）不同濃度 GREM1（0、10、100、1 000、2 000 ng/mL）的完全血清培養基刺激 PAECs 24 h，在孵育結束前 6 h 向每個孔中加入 10 μL BrdU，然后將 PAECs 用固定溶液固定，并加入抗 Brdu 抗體，使用酶標儀（Mode 680，Bio-Rad 公司）測量 450 nm 處的吸光度進行定量。
1.4.2 PAECs 的凋亡測定
PAECs 的凋亡情況用膜聯蛋白-V-藻紅蛋白（Annexin-V-PE）和 7-氨基放線菌素（7AAD）測定法檢測（BD Pharmingen 公司）。即用細胞消化液（Thermo Fisher 公司）將 PAECs 消化分離，用冷 PBS 洗滌 2 次，然后以 1×106 個細胞/mL 的濃度重懸于 1 倍結合緩沖液中，之后，將 PAECs 用 Annexin-V-PE 和 7AAD 染色，然后在 1 h 內行流式細胞術分析（FACS Canto Ⅱ，BD Biosciences 公司）。
1.4.3 GREM1 對 BMP2 的拮抗作用
PAECs 在含 0.2% FBS 的基本培養基中靜止 48 h，不同濃度 GREM1（0、10、100、1 000 和 2 000 ng/mL）與最佳濃度的 BMP2/4（25 ng/mL）一起預孵育半小時，然后添加到培養基中。如上所述進行 BrdU 摻入測定和流式細胞術分析。
1.5 實時熒光定量 PCR（real time-PCR，RT-PCR）
按試劑說明，用 TRIzol 法提取大鼠肺組織及 PAECs 的總 RNA，取 1 μg 純化的 RNA 逆轉錄為 cDAN，采用 RT-PCR 方法測定大鼠肺組織及 PAECs 中 GREM1 mRNA 水平的變化。各引物序列如下：GREM1 正向引物：5′-CCAGCAGCTGAAGGGAAAAAGAAA-3′，反向引物：5′-TGGCCGTAACAGAAGCGATTGA-3′；BMP2 正向引物：5′-TCAAGCCAAACACAAACAGC-3′，反向引物：5′-TGAGCTAAGCTCAGTGGG-3′；BMPR1A 正向引物：5′-TGGATTACCTTTATTGGTTCAGCG-3′，反向引物：5′-CAGCCACTTTTTCACCACGC-3′；BMPR2 正向引物：5′-CCGGGCAGGATAAATCAGGA-3′，反向引物：5′-ATTCTGGGAAGCAGCCGTAG-3′；Id-1 正向引物：5′-GAACCGCAAAGTGAGCAAGG-3′，反向引物：5′-GAACCGCAAAGTGAGCAAGG-3′；HIF-1α 正向引物：5′-TGCTCATCAGTTGCCACTTC-3′，反向引物：5′-CCATCCAGGGCTTTCAGATA-3′；GAPDH：正向引物：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，反向引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。
1.6 Western-blotting 實驗
制備大鼠肺組織或 PAECs 總蛋白樣品，BCA 法測定蛋白樣品濃度，取 50 μg 蛋白標本，100℃ 下進行蛋白變性 5 min，4%～2% Nu-PAGE 預制膠上電泳分離蛋白質，然后以半干轉方式轉移至硝酸纖維素膜，常溫下 5% 脫脂牛奶封閉 1 h，滴加一抗（抗 GREM1 1∶ 400，BMPR1A 1∶ 1 000，BMPR2 1∶ 2 000，P-Smad1/5/8 1∶ 1 000，Smad1/5/8 1∶ 500，HIF-1α 1∶ 1 000，GAPDH 1∶ 5 000），4℃ 孵育 12 h；洗膜緩沖液漂洗后加入二抗（1∶ 1 000），室溫下反應 1 h，洗膜緩沖液再次洗滌后顯色成像。
1.7 血漿及培養上清中 GREM1 濃度的測定
根據說明書，通過 GREM1 Elisa 試劑盒（Aviva Systems Biology 公司）檢測血漿及細胞上清中 GREM1 的濃度。所有標準品和樣品均一式兩份進行分析。使用酶標儀（Mode 680，Bio Rad 公司）在 450 nm 處測量吸光度。將結果分別與通過滴定標準品構建的標準曲線進行比較。
1.8 統計學分析
采用統計學軟件 SPSS 17.0 進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
1.9 倫理審查
本研究經中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院/湖南省腫瘤醫院動物倫理委員會審批，批準號：2020-002。
2 結果
2.1 體-肺分流性 PAH 大鼠模型成功制備
與 SOG 組相比，SCG 組術后 12 周的 RVSP、PASP、mPAP、右室肥厚指數（RVHI）、右室游離壁厚度（RVWT）及右室內徑（RVID）由基線狀態的（24.45±5.23）mm Hg、（22.64±3.47）mm Hg、（15.26±2.87）mm Hg、27.27%±4.83%、（0.59±0.04）mm 及（2.42±0.18）mm 分別升高至（62.13±4.75）mm Hg、（59.06±5.28）mm Hg、（35.13±3.25）mm Hg、55.34%±5.16%、（1.26±0.25）mm 及（3.51±0.59）mm（P<0.05，圖 1a～f）。肺組織形態學分析顯示，與 SOG 組相比，肺小動脈中膜明顯增厚，內膜細胞性增生，管腔明顯狹窄（圖 1g～i）。另外，肌化的肺小動脈中膜增厚顯著。而消除頸部體-肺分流后，上述肺血流動力學指標、右室肥厚程度及肺血管重構程度顯著減輕，說明在 SD 大鼠上體-肺分流術后 12 周能成功再現 CHD/PAH 典型的病理生理學狀態。
圖1
體-肺分流術后肺血流動力學指標、右室肥厚及肺血管重構程度
a～f：體-肺分流術后及分流矯治術后肺血流動力學指標及右室肥厚指標的變化趨勢（
2.2 體-肺分流抑制肺組織 BMP 信號通路
和 SOG 組相比，SG 組肺組織的 BMP2、BMPR1A、BMPR2 和 Id-1 的 mRNA 水平分別較基礎水平顯著下降（P<0.05，圖 2a～d）；而 BMP2、BMPR1A、BMPR2 和 Id-1 蛋白水平分別下降至基礎水平的 35.34%±5.62%、40.54%±8.37%、36.48%±6.93% 和 29.56%±7.35%，另外，Smad1/5/8 磷酸化程度亦顯著降低，即 P-Smad1/5/8 蛋白表達下降（P<0.05，圖 2f、h～k）。而消除體-肺分流后 4 周，上述 BMP 信號通路相關蛋白的改變顯著減弱（P<0.05），說明體-肺分流能顯著抑制大鼠肺組織 BMP 信號通路的激活，而消除體-肺分流可顯著恢復肺組織 BMP 信號通路至接近正常水平。另外，三組間肺組織 HIF-α 的 mRNA 水平及蛋白水平差異無統計學意義，說明體-肺分流對肺組織 HIF-α 的表達水平影響較小（圖 2e、l），排除了體-肺分流狀態下 HIF-α-GREM2 作用軸發揮作用的可能性。
圖2
BMP 信號通路相關蛋白及 HIF-1α 變化
a～e：體-肺分流狀態下肺組織 BMP2、BMPR1A、BMPR2、Id-1 及 HIF-1α mRNA 水平的變化；g：體-肺分流狀態下肺組織 BMP2、BMPR1A、BMPR2、Id-1 及 HIF-1α 的 Western-blotting 代表圖；f、h～k：體-肺分流狀態下肺組織 BMP2、BMPR1A、BMPR2、P-Smad1/5/8、Id-1 及 HIF-1α 蛋白水平代表圖及定量分析；SOG：假手術組（
2.3 體-肺分流促進 GREM1 的表達
和 SOG 組相比，SG 組及 SCG 組肺組織 GREM1 的 mRNA 水平分別是基礎水平的（6.8±0.35）倍和（2.82±0.47）倍（P<0.01，圖 3a），而蛋白水平分別是基礎水平的（2.36±0.28）倍和（1.69±0.32）倍（P<0.01，圖 3b～c）。另外，SOG 組、SG 組及 SCG 組的 GREM1 血漿濃度分別為（65.89±8.56）ng/mL、（105.13±12.15）ng/mL 和（75.36±10.45）ng/mL，且血漿 GREM1 濃度水平和 RVSP、PASP、mPAP 及 RV/LV+S 呈明顯正相關關系（圖 3d～h）。免疫組織化學染色顯示，正常肺組織中，GREM1 在肺小動脈壁僅微量表達（圖 3i），而 SG 組肺組織中 GREM1 在肺小動脈壁強表達（圖 3j），特別是接近閉塞或堵塞的肺小血管的新生內膜內表達更強（圖 3k～l），提示體-肺分流可刺激促進肺血管壁細胞合成分泌 GREM1。
圖3
肺組織 GREM1 的變化、定位及血漿 GREM1 與 PAH 程度的相關性
a：肺組織 GREM1 mRNA 水平變化；b～c：肺組織 GREM1 蛋白水平的變化；d：血漿 GREM1 濃度的變化；e～h：血漿 GREM1 濃度和 RVSP、PASP、mPAP 及 RV/LV+S 正相關；i～l：GREM1 在正常肺組織無表達，在肌化的肺血管內膜層及閉塞血管的新生內膜層強表達；SOG：假手術組（
2.4 GREM1-BMP 通路促進 PAECs 增殖而抑制其凋亡
體外細胞實驗顯示，重組蛋白 BMP2 濃度依賴性地抑制 PAECs 的增殖，BMP2（1、5、25、125 ng/mL）分別將 PAECs 的增殖能力抑制至基線水平的 98.34%±10.52%、92.18%±9.86%、73.46%±11.56% 和 80.07%±8.38%（圖 4a），而 GREM1（0、10、100、1 000 和 2 000 ng/mL）+BMP2（25 ng/mL）能使 PAECs 的增殖能力分別恢復至基線水平的 71.72%±9.17%、73.12%±6.24%、85.85%±7.54%、92.59%±10.35% 和 93.62%±6.36%（圖 4b）。另外，BMP2（25 ng/mL）處理后，體外培養的 PAECs 的凋亡比率由基線水平的 14.32%±4.15% 上升至 27.39%±4.76%，而 GREM1（1 μg/mL）處理后可將 BMP2（25 ng/mL）誘導的 PAECs 的凋亡率基本恢復至正常水平（圖 4e～f），說明 GREM1 通過拮抗 BMP 信號通路促進 PAECs 的增殖而抑制其凋亡。
圖4
GREM1通過拮抗 BMP2促進PAECs增殖而抑制其凋亡
a：BMP2 抑制 PAECs 增殖（
2.5 GREM1 拮抗 BMP2 誘導的 PAECs 內 BMP 信號通路的激活
BMP2（25 ng/mL）能明顯激活 PAECs 內 Smad1/5/8 的磷酸化并上調 Id-1 的表達水平，而 GREM1 可濃度依賴性地拮抗 BMP2（25 ng/mL）對 PAECs 內 Smad1/5/8 的磷酸化水平及 Id-1 表達水平的激活作用；在濃度水平達到 1 000 ng/mL 時，GREM1 可使 PAECs 內 Smad1/5/8 的磷酸化水平及 Id-1 的表達水平幾乎恢復至基線水平（圖 4c～d）。
3 討論
CHD/PAH 是因先天性心臟血管發育異常，出生后體循環和肺循環間殘留異常交通途徑，致使體-肺分流持續存在，導致肺循環系統血流量增多、壓力升高及肺血管病理性重構、狹窄甚至閉塞，致死率高[1]。PAH 的種類繁多，作為特殊類型的 PAH，CHD/PAH 占了我國 PAH 患者總數的 40% 以上[11]。隨著世界肺高壓大會對 CHD/PAH 臨床分型的提出及 PAH 亞組間人群分布的逐步改變[1, 12]，靶向治療目前已經成為 CHD/PAH 臨床治療和基礎研究領域的熱點。
近年來隨著 PAH 研究領域大量潛在靶點的發現，許多靶向藥相繼研發并應用于臨床，如內皮素受體拮抗劑、前列環素和 5 型磷酸二酯酶抑制劑[13-15]。目前靶向藥可部分改善 CHD/PAH 患者的臨床癥狀和肺血流動力學指標，多數中晚期 CHD/PAH 患者對現有靶向藥并不敏感，即使聯合用藥仍不能降低 CHD/PAH 患者的總體死亡率[16]，且最終心肺聯合移植的患者，其 5 年病死率仍高達 50%[17]。這種局面的出現主要因 CHD/PAH 的發病機制復雜，眾多信號通路牽涉其中，而目前臨床應用的靶向藥均分別作用于單一信號通路，難以阻逆 CHD/PAH 的核心環節——肺血管病理性重構的發生，說明 CHD/PAH 基礎科研至今仍未明確 CHD/PAH 的關鍵發病機制。
在 PAH 系統研究的早期，Heath 等[18]依據 CHD/PAH 患者的肺標本提出了 PAH 肺血管重構的病理分型，奠定了 PAH 病理研究的基礎，但作為特殊類型的 PAH，其關鍵發病機制至今沒有明確。要研究 CHD/PAH 的確切發病機制，CHD/PAH 患者的肺組織標本當然是首選的研究素材。Provencher 等[19]總結了用人肺組織進行 PAH 機制研究和靶點篩選的諸多優點，但臨床工作中 CHD/PAH 患者的肺組織標本獲取十分困難，因此在實驗動物上模擬體-肺分流狀態是很有必要的。Meng 等[8]報道了一種可靠的大鼠體-肺分流模型，本研究依據此造模方法構建體-肺分流性 PAH 大鼠模型，根據體-肺分流術后 12 周的右心系統血流動力學指標、右室指標（內徑、厚度及肥厚程度）及肺血管重構病變的程度判斷，本研究成功復制了此動物模型，再現了 CHD/PAH 特殊的病理生理學過程，為后續 GREM1 的研究奠定了動物模型基礎。
先前的研究[2-3]發現 BMPR2 基因的雜合突變導致了 50%～70% 家族性 PAH 的發生，且其親屬攜帶 BMPR2 突變的比率也很高，從而導致遺傳性 PAH 命名的出現。而機制方面的研究[6, 20-23]發現 BMPR2 的突變導致肺組織 BMP 信號下調，肺動脈內皮細胞重新進入增殖過度而凋亡不足的狀態，最終導致 PAH 的形成，但 CHD/PAH 患者 BMPR2 的致病突變率很低，僅約 0～6%，但同樣普遍存在肺組織 BMP 信號的下調，具體機制不明[4, 24-25]。本研究發現體-肺分流術后 12 周，肺組織 BMP 信號通路上游組份 BMP2、BMPR1A、BMPR2 的表達水平顯著下降，而 BMP 下游信號通路 Smad1/5/8 的磷酸化水平顯著降低，BMP 信號通路下游靶基因 Id-1 的表達水平也顯著下降，這說明體-肺分流可顯著受抑制肺組織 BMP 信號通路的活性，這和先前的報道一致，但體-肺分流誘導的肺組織非 BMPR2 突變性的 BMP 信號通路下調機制尚未闡明[5]。
研究[26]發現，低氧時 PAECs 內高表達的 HIF-1α 可誘使肺組織 GREM1 的合成分泌增加，即形成“低氧-HIF-1α-GREM1”的調節作用軸，但體-肺分流狀態下肺循環持續接收經體肺循環間異常通道分流來的動脈血，肺循環處于高氧狀態。以往的研究[27]已證實常氧及高氧時細胞內表達的 HIF-1α 很快即被氧依賴的泛素蛋白酶降解途徑降解，所以基本檢測不到；而低氧時，HIF-1α 的降解減弱，因此在組織細胞中高表達。本研究結果顯示，體-肺分流術后 12 周，體-肺分流性肺組織中 GREM1 的 mRNA 及蛋白水平均顯著升高，且作為分泌性蛋白質，體-肺分流性大鼠血漿中 GREM1 的濃度亦顯著升高，但 HIF-1α 的 mRNA 及蛋白水平均無明顯改變，這說明體-肺分流誘使肺組織 GREM1 的合成和分泌增加，但對 HIF-1α 的表達無影響，這提示體-肺分流情況下“高氧-HIF-1α-GREM1”的調節作用軸是不存在的。而先前的研究[7, 26]證實 GREM1 具有拮抗 BMP 的生物學作用，我們的體外實驗顯示 BMP2 可濃度依賴性地抑制 PAECs 的增殖、促進其凋亡并激活 PAECs 內 Smad1/5/8 的磷酸化及 Id-1 的活性，而 GREM1 可拮抗 BMP2 對 PAECs 的增殖抑制和凋亡促進作用，表現為顯著的促 PAECs 增殖而抑制其凋亡的作用，這和先前報道的其它 BMP 拮抗因子有相似之處[5]，說明體-肺分流肺組織表達增加的 GREM1 是通過 BMP 信號通路促進 PAECs 增殖而抑制凋亡，HIF-1α 在這個過程中的作用有限。
總之，本研究證實了體-肺分流刺激肺組織合成和分泌 GREM1 增加，而 GREM1 通過拮抗 BMP 信號通路導致肺組織 BMP 信號通路受抑制，PAECs 重新進入增殖周期，最終肺血管重構和 PAH 形成（圖 5），這為 CHD-PAH 肺組織中非 BMPR2 突變性的 BMP 信號通路的普遍下調機制提供了一種合理的解釋。
圖5
實驗結論圖
利益沖突：無。
作者貢獻：劉旭負責數據整理、分析，作圖及論文初稿撰寫等；鄧紅玉負責技術指導、論文審閱與修改等；周平負責課題構思，論文設計、審閱與修改等。
先天性心臟病相關肺動脈高壓（congenital heart diseases associated pulmonary artery hypertension，CHD/PAH）是因先天性心臟血管發育畸形引起體肺循環間存在異常分流通路，導致肺循環持續的容量和壓力超負荷、肺阻力血管重構及管腔狹窄，并逐漸導致右心衰竭和死亡[1]。近 20 年來，PAH 領域的重大突破是證實骨形態發生蛋白 2 型受體（BMPR2）的雜合突變導致 BMP 信號通路受抑制，并導致 PAH 的形成[2-3]。但作為特殊類型的 PAH，CHD/PAH 的 BMPR2 致病突變率極低，而 CHD/PAH 患者肺組織 BMP 信號通路的下調卻普遍存在[4]。近期 CHD/PAH 大鼠模型也證實了體-肺性肺組織 BMP 通路的下調[5]，理論上這種非 BMPR2 基因突變依賴性的 BMP 通路的下調同樣導致了體-肺分流性 PAH 的形成，但是其下調機制不明確。
研究[6]發現肺小動脈內皮細胞（PAECs）的過度增殖和凋亡抵抗是肺血管重構的關鍵步驟。先前的研究[7]已證實低氧可刺激 PAECs 分泌 BMP 拮抗因子 GREM1，而 GREM1 通過缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在低氧性 PAH 中發揮重要作用。而體-肺分流性 PAH 的肺循環是高氧狀態，不存在 HIF-1α 的高表達，這和低氧性 PAH 完全相反。研究發現 GREM1 可拮抗 BMP2，進而抑制 BMP 信號通路的活性，因此本研究推測體-肺分流狀態下，肺循環剪切力的增加使肺組織 GREM1 的分泌增加，抑制 BMP 信號通路，進而誘使肺血管重構。
1 材料與方法
1.1 實驗器材及試劑
生理記錄儀（PowerLab 16/30，AD Instruments），小動物呼吸機（Inspria ASVP，Harvard Apparatus），右心導管（北京協和醫學院基礎所缺氧病理生理學實驗室），小動物心臟超聲儀（MS250，VEVO 2100），AMV 逆轉錄試劑盒及 PCR 引物（TaKaRa 生物工程有限公司），Brdu 細胞增殖 Elisa 試劑盒（Abcam 公司），重組 BMP2 蛋白，重組人 GREM1 蛋白及抗 GREM1 抗體（R&D 公司），抗 HIF-1α 抗體（Santa Cruz 公司），抗 BMPR1A 抗體、抗 BMPR2 抗體及抗分化抑制因子-1（Id-1）抗體（Abcam 公司），P-Smad1/5/8（Cell Signaling Technology 公司），Smad1/5/8（Santa Cruz 公司），GREM1 酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒（Elisa kit，Aviva Systems Biology 公司），抗 GAPDH 抗體（Abmart 公司），辣根過氧化物酶標記的抗鼠二抗（Santa Cruz 公司），Power SYBR green PCR mastermix（ABI 公司），TRIzol（Invitrogen 公司），鼠肺動脈內皮細胞（pulmonary arterial endothelial cells，PAECs，ScienCell 公司），10% 水合氯醛（北京亮東科技有限公司），10% 中性福爾馬林（北京益利精細化學品有限公司）。
1.2 實驗動物及分組
Sprague Dawley（SD）大鼠 30 只，7～9 周齡，體重 150～250 g，由中南大學動物實驗中心提供。大鼠隨機分為假手術組（sham operation group，SOG，n=10），分流手術組（shunt group，SG，n=10）和分流矯治組（shunt correction group，SCG，n=10）。
1.3 體-肺分流模型的制備及評估
1.3.1 模型制備
SG 組采取“右肺動脈結扎+左頸總動脈-左頸外靜脈分流”的術式構建，然后喂養 12 周；SCG 組采取“右肺動脈結扎+左頸總動脈-左頸外靜脈分流”的術式構建，12 周后再次手術結扎頸部分流，然后繼續喂養 4 周；SOG 組的手術流程和 SG 組相同，但不結扎右肺動脈，也不建立左頸部分流，術后喂養 12 周。術后給予阿司匹林抗凝及氫氯噻嗪預防肺水腫，術后置于 21℃ 恒溫室內飼養（濕度 50%～70%），持續喂養至 12 周[8]。
1.3.2 心臟超聲及右心導管評估及取材
術后 12 周，先以心臟超聲行右心室形態學改變的測量，具體方法如下：10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g 體重）麻醉大鼠，仰臥位固定，備皮，涂抹耦合劑，四肢粘貼心電圖電極片（監測心臟收縮和舒張時相），經胸骨旁長軸切面測量右心室舒張期內徑（右室游離壁至室間隔的最大距離）及游離壁厚；后采取右心系統測壓[8]，即經右頸外靜脈置入右心導管，以壓力波形和波幅判斷其在右心系統中的位置，同時記錄壓力值，包括右心室收縮壓（RVSP）、肺動脈收縮壓（PASP）及平均肺動脈壓（mPAP）等[9]。
測壓后，經下腔靜脈取血 0.3 mL，4℃ 靜置 30 min，3 000 轉/分離心 15 min；取上清分裝后保存于?80℃ 冰箱，以備后續 Elisa 檢測 GREM1 濃度。然后剪下心、肺組織，迅速將左肺上部凍存于?80℃ 液氮，后續采用 Elisa 法檢測大鼠血漿 GREM1 濃度，Elisa 試劑盒的測定范圍為 125～8 000 pg/mL，具體操作依照說明書進行。后將左肺下部常溫固定于 10% 中性福爾馬林 24 h，后流水常溫沖洗 12 h，常規梯度脫水制成組織蠟塊。最后修剪右心室（RV）和左心室（LV）+室間隔（S）標本，稱取濕重，計算右心室肥厚指數（RV/LV+S）。
1.3.3 肺血管重構分析及 GREM1 肺組織定位分析
每個肺組織蠟塊切 4 張 5 μm 厚的切片，2 張做蘇木精-伊紅（HE）染色，采用 Heath 和 Edwards[10]提出的肺血管病變等級進行肺血管重構病變分析；另 2 張用于免疫熒光染色，觀察肺組織 GREM1 的定位，具體操作如下：取 4 μm 厚肺組織切片貼片，37℃ 烤箱內烤干；二甲苯脫蠟 20 min；95%～85% 無水乙醇梯度脫水 15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌（5 min×3 次）；3% H2O2 室溫浸潤 10 min，PBS 洗滌（5 min×3 次）；100℃ 的 0.01 mol/L 的枸緣酸鈉緩沖液中修復抗原；0.3% Triton X-100 孵育 20 min；山羊血清封閉 20 min，滴加一抗（GREM1，1∶ 200），4℃ 孵育 12 h，37℃ 復溫 1 h，PBS 洗滌（5 min×3 次）；滴加辣根過氧化物酶標記二抗（1∶400），37℃ 孵育 1 h；PBS 洗滌（5 min×3 次），DAB 顯色液顯色 10 min，鏡下觀察顯色情況，PBS 沖洗停止顯色；蘇木精復染 2 min；1% 鹽酸乙醇分化 20 s；PBS 沖洗；無水乙醇梯度脫水；二甲苯透明；封片，鏡檢拍片。
1.4 體外細胞實驗
復蘇液氮中凍存的 PAECs，以完全內皮細胞培養液在恒溫細胞培養箱中培養（37℃，5% CO2），將第 3 代 PAECs 以 2×105 的密度接種于細胞培養瓶（25 cm2），待細胞融合至 80%～90% 時進行功能學研究。將細胞分為 3 組：對照組、刺激組（BMP2 0、5、25、125 ng/mL）和拮抗組［BMP2（25 ng/mL）+GREM1（0、10、100、1 000、2 000 ng/mL）］。
1.4.1 PAECs 的增殖測定
PAECs 的增殖情況采取 5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）摻入法進行評估。將 PAECs 以每孔 1×103 個細胞的密度接種在 96 孔板中，并在 100 μL 完全細胞培養基中過夜，然后在基礎細胞培養基［0.2% 胎牛血清（FBS）］中饑餓培養 48 h，之后用含不同濃度 BMP2（0、1、5、25 和 125 ng/mL）和（或）不同濃度 GREM1（0、10、100、1 000、2 000 ng/mL）的完全血清培養基刺激 PAECs 24 h，在孵育結束前 6 h 向每個孔中加入 10 μL BrdU，然后將 PAECs 用固定溶液固定，并加入抗 Brdu 抗體，使用酶標儀（Mode 680，Bio-Rad 公司）測量 450 nm 處的吸光度進行定量。
1.4.2 PAECs 的凋亡測定
PAECs 的凋亡情況用膜聯蛋白-V-藻紅蛋白（Annexin-V-PE）和 7-氨基放線菌素（7AAD）測定法檢測（BD Pharmingen 公司）。即用細胞消化液（Thermo Fisher 公司）將 PAECs 消化分離，用冷 PBS 洗滌 2 次，然后以 1×106 個細胞/mL 的濃度重懸于 1 倍結合緩沖液中，之后，將 PAECs 用 Annexin-V-PE 和 7AAD 染色，然后在 1 h 內行流式細胞術分析（FACS Canto Ⅱ，BD Biosciences 公司）。
1.4.3 GREM1 對 BMP2 的拮抗作用
PAECs 在含 0.2% FBS 的基本培養基中靜止 48 h，不同濃度 GREM1（0、10、100、1 000 和 2 000 ng/mL）與最佳濃度的 BMP2/4（25 ng/mL）一起預孵育半小時，然后添加到培養基中。如上所述進行 BrdU 摻入測定和流式細胞術分析。
1.5 實時熒光定量 PCR（real time-PCR，RT-PCR）
按試劑說明，用 TRIzol 法提取大鼠肺組織及 PAECs 的總 RNA，取 1 μg 純化的 RNA 逆轉錄為 cDAN，采用 RT-PCR 方法測定大鼠肺組織及 PAECs 中 GREM1 mRNA 水平的變化。各引物序列如下：GREM1 正向引物：5′-CCAGCAGCTGAAGGGAAAAAGAAA-3′，反向引物：5′-TGGCCGTAACAGAAGCGATTGA-3′；BMP2 正向引物：5′-TCAAGCCAAACACAAACAGC-3′，反向引物：5′-TGAGCTAAGCTCAGTGGG-3′；BMPR1A 正向引物：5′-TGGATTACCTTTATTGGTTCAGCG-3′，反向引物：5′-CAGCCACTTTTTCACCACGC-3′；BMPR2 正向引物：5′-CCGGGCAGGATAAATCAGGA-3′，反向引物：5′-ATTCTGGGAAGCAGCCGTAG-3′；Id-1 正向引物：5′-GAACCGCAAAGTGAGCAAGG-3′，反向引物：5′-GAACCGCAAAGTGAGCAAGG-3′；HIF-1α 正向引物：5′-TGCTCATCAGTTGCCACTTC-3′，反向引物：5′-CCATCCAGGGCTTTCAGATA-3′；GAPDH：正向引物：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，反向引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。
1.6 Western-blotting 實驗
制備大鼠肺組織或 PAECs 總蛋白樣品，BCA 法測定蛋白樣品濃度，取 50 μg 蛋白標本，100℃ 下進行蛋白變性 5 min，4%～2% Nu-PAGE 預制膠上電泳分離蛋白質，然后以半干轉方式轉移至硝酸纖維素膜，常溫下 5% 脫脂牛奶封閉 1 h，滴加一抗（抗 GREM1 1∶ 400，BMPR1A 1∶ 1 000，BMPR2 1∶ 2 000，P-Smad1/5/8 1∶ 1 000，Smad1/5/8 1∶ 500，HIF-1α 1∶ 1 000，GAPDH 1∶ 5 000），4℃ 孵育 12 h；洗膜緩沖液漂洗后加入二抗（1∶ 1 000），室溫下反應 1 h，洗膜緩沖液再次洗滌后顯色成像。
1.7 血漿及培養上清中 GREM1 濃度的測定
根據說明書，通過 GREM1 Elisa 試劑盒（Aviva Systems Biology 公司）檢測血漿及細胞上清中 GREM1 的濃度。所有標準品和樣品均一式兩份進行分析。使用酶標儀（Mode 680，Bio Rad 公司）在 450 nm 處測量吸光度。將結果分別與通過滴定標準品構建的標準曲線進行比較。
1.8 統計學分析
采用統計學軟件 SPSS 17.0 進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
1.9 倫理審查
本研究經中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院/湖南省腫瘤醫院動物倫理委員會審批，批準號：2020-002。
2 結果
2.1 體-肺分流性 PAH 大鼠模型成功制備
與 SOG 組相比，SCG 組術后 12 周的 RVSP、PASP、mPAP、右室肥厚指數（RVHI）、右室游離壁厚度（RVWT）及右室內徑（RVID）由基線狀態的（24.45±5.23）mm Hg、（22.64±3.47）mm Hg、（15.26±2.87）mm Hg、27.27%±4.83%、（0.59±0.04）mm 及（2.42±0.18）mm 分別升高至（62.13±4.75）mm Hg、（59.06±5.28）mm Hg、（35.13±3.25）mm Hg、55.34%±5.16%、（1.26±0.25）mm 及（3.51±0.59）mm（P<0.05，圖 1a～f）。肺組織形態學分析顯示，與 SOG 組相比，肺小動脈中膜明顯增厚，內膜細胞性增生，管腔明顯狹窄（圖 1g～i）。另外，肌化的肺小動脈中膜增厚顯著。而消除頸部體-肺分流后，上述肺血流動力學指標、右室肥厚程度及肺血管重構程度顯著減輕，說明在 SD 大鼠上體-肺分流術后 12 周能成功再現 CHD/PAH 典型的病理生理學狀態。
圖1
體-肺分流術后肺血流動力學指標、右室肥厚及肺血管重構程度
a～f：體-肺分流術后及分流矯治術后肺血流動力學指標及右室肥厚指標的變化趨勢（
2.2 體-肺分流抑制肺組織 BMP 信號通路
和 SOG 組相比，SG 組肺組織的 BMP2、BMPR1A、BMPR2 和 Id-1 的 mRNA 水平分別較基礎水平顯著下降（P<0.05，圖 2a～d）；而 BMP2、BMPR1A、BMPR2 和 Id-1 蛋白水平分別下降至基礎水平的 35.34%±5.62%、40.54%±8.37%、36.48%±6.93% 和 29.56%±7.35%，另外，Smad1/5/8 磷酸化程度亦顯著降低，即 P-Smad1/5/8 蛋白表達下降（P<0.05，圖 2f、h～k）。而消除體-肺分流后 4 周，上述 BMP 信號通路相關蛋白的改變顯著減弱（P<0.05），說明體-肺分流能顯著抑制大鼠肺組織 BMP 信號通路的激活，而消除體-肺分流可顯著恢復肺組織 BMP 信號通路至接近正常水平。另外，三組間肺組織 HIF-α 的 mRNA 水平及蛋白水平差異無統計學意義，說明體-肺分流對肺組織 HIF-α 的表達水平影響較小（圖 2e、l），排除了體-肺分流狀態下 HIF-α-GREM2 作用軸發揮作用的可能性。
圖2
BMP 信號通路相關蛋白及 HIF-1α 變化
a～e：體-肺分流狀態下肺組織 BMP2、BMPR1A、BMPR2、Id-1 及 HIF-1α mRNA 水平的變化；g：體-肺分流狀態下肺組織 BMP2、BMPR1A、BMPR2、Id-1 及 HIF-1α 的 Western-blotting 代表圖；f、h～k：體-肺分流狀態下肺組織 BMP2、BMPR1A、BMPR2、P-Smad1/5/8、Id-1 及 HIF-1α 蛋白水平代表圖及定量分析；SOG：假手術組（
2.3 體-肺分流促進 GREM1 的表達
和 SOG 組相比，SG 組及 SCG 組肺組織 GREM1 的 mRNA 水平分別是基礎水平的（6.8±0.35）倍和（2.82±0.47）倍（P<0.01，圖 3a），而蛋白水平分別是基礎水平的（2.36±0.28）倍和（1.69±0.32）倍（P<0.01，圖 3b～c）。另外，SOG 組、SG 組及 SCG 組的 GREM1 血漿濃度分別為（65.89±8.56）ng/mL、（105.13±12.15）ng/mL 和（75.36±10.45）ng/mL，且血漿 GREM1 濃度水平和 RVSP、PASP、mPAP 及 RV/LV+S 呈明顯正相關關系（圖 3d～h）。免疫組織化學染色顯示，正常肺組織中，GREM1 在肺小動脈壁僅微量表達（圖 3i），而 SG 組肺組織中 GREM1 在肺小動脈壁強表達（圖 3j），特別是接近閉塞或堵塞的肺小血管的新生內膜內表達更強（圖 3k～l），提示體-肺分流可刺激促進肺血管壁細胞合成分泌 GREM1。
圖3
肺組織 GREM1 的變化、定位及血漿 GREM1 與 PAH 程度的相關性
a：肺組織 GREM1 mRNA 水平變化；b～c：肺組織 GREM1 蛋白水平的變化；d：血漿 GREM1 濃度的變化；e～h：血漿 GREM1 濃度和 RVSP、PASP、mPAP 及 RV/LV+S 正相關；i～l：GREM1 在正常肺組織無表達，在肌化的肺血管內膜層及閉塞血管的新生內膜層強表達；SOG：假手術組（
2.4 GREM1-BMP 通路促進 PAECs 增殖而抑制其凋亡
體外細胞實驗顯示，重組蛋白 BMP2 濃度依賴性地抑制 PAECs 的增殖，BMP2（1、5、25、125 ng/mL）分別將 PAECs 的增殖能力抑制至基線水平的 98.34%±10.52%、92.18%±9.86%、73.46%±11.56% 和 80.07%±8.38%（圖 4a），而 GREM1（0、10、100、1 000 和 2 000 ng/mL）+BMP2（25 ng/mL）能使 PAECs 的增殖能力分別恢復至基線水平的 71.72%±9.17%、73.12%±6.24%、85.85%±7.54%、92.59%±10.35% 和 93.62%±6.36%（圖 4b）。另外，BMP2（25 ng/mL）處理后，體外培養的 PAECs 的凋亡比率由基線水平的 14.32%±4.15% 上升至 27.39%±4.76%，而 GREM1（1 μg/mL）處理后可將 BMP2（25 ng/mL）誘導的 PAECs 的凋亡率基本恢復至正常水平（圖 4e～f），說明 GREM1 通過拮抗 BMP 信號通路促進 PAECs 的增殖而抑制其凋亡。
圖4
GREM1通過拮抗 BMP2促進PAECs增殖而抑制其凋亡
a：BMP2 抑制 PAECs 增殖（
2.5 GREM1 拮抗 BMP2 誘導的 PAECs 內 BMP 信號通路的激活
BMP2（25 ng/mL）能明顯激活 PAECs 內 Smad1/5/8 的磷酸化并上調 Id-1 的表達水平，而 GREM1 可濃度依賴性地拮抗 BMP2（25 ng/mL）對 PAECs 內 Smad1/5/8 的磷酸化水平及 Id-1 表達水平的激活作用；在濃度水平達到 1 000 ng/mL 時，GREM1 可使 PAECs 內 Smad1/5/8 的磷酸化水平及 Id-1 的表達水平幾乎恢復至基線水平（圖 4c～d）。
3 討論
CHD/PAH 是因先天性心臟血管發育異常，出生后體循環和肺循環間殘留異常交通途徑，致使體-肺分流持續存在，導致肺循環系統血流量增多、壓力升高及肺血管病理性重構、狹窄甚至閉塞，致死率高[1]。PAH 的種類繁多，作為特殊類型的 PAH，CHD/PAH 占了我國 PAH 患者總數的 40% 以上[11]。隨著世界肺高壓大會對 CHD/PAH 臨床分型的提出及 PAH 亞組間人群分布的逐步改變[1, 12]，靶向治療目前已經成為 CHD/PAH 臨床治療和基礎研究領域的熱點。
近年來隨著 PAH 研究領域大量潛在靶點的發現，許多靶向藥相繼研發并應用于臨床，如內皮素受體拮抗劑、前列環素和 5 型磷酸二酯酶抑制劑[13-15]。目前靶向藥可部分改善 CHD/PAH 患者的臨床癥狀和肺血流動力學指標，多數中晚期 CHD/PAH 患者對現有靶向藥并不敏感，即使聯合用藥仍不能降低 CHD/PAH 患者的總體死亡率[16]，且最終心肺聯合移植的患者，其 5 年病死率仍高達 50%[17]。這種局面的出現主要因 CHD/PAH 的發病機制復雜，眾多信號通路牽涉其中，而目前臨床應用的靶向藥均分別作用于單一信號通路，難以阻逆 CHD/PAH 的核心環節——肺血管病理性重構的發生，說明 CHD/PAH 基礎科研至今仍未明確 CHD/PAH 的關鍵發病機制。
在 PAH 系統研究的早期，Heath 等[18]依據 CHD/PAH 患者的肺標本提出了 PAH 肺血管重構的病理分型，奠定了 PAH 病理研究的基礎，但作為特殊類型的 PAH，其關鍵發病機制至今沒有明確。要研究 CHD/PAH 的確切發病機制，CHD/PAH 患者的肺組織標本當然是首選的研究素材。Provencher 等[19]總結了用人肺組織進行 PAH 機制研究和靶點篩選的諸多優點，但臨床工作中 CHD/PAH 患者的肺組織標本獲取十分困難，因此在實驗動物上模擬體-肺分流狀態是很有必要的。Meng 等[8]報道了一種可靠的大鼠體-肺分流模型，本研究依據此造模方法構建體-肺分流性 PAH 大鼠模型，根據體-肺分流術后 12 周的右心系統血流動力學指標、右室指標（內徑、厚度及肥厚程度）及肺血管重構病變的程度判斷，本研究成功復制了此動物模型，再現了 CHD/PAH 特殊的病理生理學過程，為后續 GREM1 的研究奠定了動物模型基礎。
先前的研究[2-3]發現 BMPR2 基因的雜合突變導致了 50%～70% 家族性 PAH 的發生，且其親屬攜帶 BMPR2 突變的比率也很高，從而導致遺傳性 PAH 命名的出現。而機制方面的研究[6, 20-23]發現 BMPR2 的突變導致肺組織 BMP 信號下調，肺動脈內皮細胞重新進入增殖過度而凋亡不足的狀態，最終導致 PAH 的形成，但 CHD/PAH 患者 BMPR2 的致病突變率很低，僅約 0～6%，但同樣普遍存在肺組織 BMP 信號的下調，具體機制不明[4, 24-25]。本研究發現體-肺分流術后 12 周，肺組織 BMP 信號通路上游組份 BMP2、BMPR1A、BMPR2 的表達水平顯著下降，而 BMP 下游信號通路 Smad1/5/8 的磷酸化水平顯著降低，BMP 信號通路下游靶基因 Id-1 的表達水平也顯著下降，這說明體-肺分流可顯著受抑制肺組織 BMP 信號通路的活性，這和先前的報道一致，但體-肺分流誘導的肺組織非 BMPR2 突變性的 BMP 信號通路下調機制尚未闡明[5]。
研究[26]發現，低氧時 PAECs 內高表達的 HIF-1α 可誘使肺組織 GREM1 的合成分泌增加，即形成“低氧-HIF-1α-GREM1”的調節作用軸，但體-肺分流狀態下肺循環持續接收經體肺循環間異常通道分流來的動脈血，肺循環處于高氧狀態。以往的研究[27]已證實常氧及高氧時細胞內表達的 HIF-1α 很快即被氧依賴的泛素蛋白酶降解途徑降解，所以基本檢測不到；而低氧時，HIF-1α 的降解減弱，因此在組織細胞中高表達。本研究結果顯示，體-肺分流術后 12 周，體-肺分流性肺組織中 GREM1 的 mRNA 及蛋白水平均顯著升高，且作為分泌性蛋白質，體-肺分流性大鼠血漿中 GREM1 的濃度亦顯著升高，但 HIF-1α 的 mRNA 及蛋白水平均無明顯改變，這說明體-肺分流誘使肺組織 GREM1 的合成和分泌增加，但對 HIF-1α 的表達無影響，這提示體-肺分流情況下“高氧-HIF-1α-GREM1”的調節作用軸是不存在的。而先前的研究[7, 26]證實 GREM1 具有拮抗 BMP 的生物學作用，我們的體外實驗顯示 BMP2 可濃度依賴性地抑制 PAECs 的增殖、促進其凋亡并激活 PAECs 內 Smad1/5/8 的磷酸化及 Id-1 的活性，而 GREM1 可拮抗 BMP2 對 PAECs 的增殖抑制和凋亡促進作用，表現為顯著的促 PAECs 增殖而抑制其凋亡的作用，這和先前報道的其它 BMP 拮抗因子有相似之處[5]，說明體-肺分流肺組織表達增加的 GREM1 是通過 BMP 信號通路促進 PAECs 增殖而抑制凋亡，HIF-1α 在這個過程中的作用有限。
總之，本研究證實了體-肺分流刺激肺組織合成和分泌 GREM1 增加，而 GREM1 通過拮抗 BMP 信號通路導致肺組織 BMP 信號通路受抑制，PAECs 重新進入增殖周期，最終肺血管重構和 PAH 形成（圖 5），這為 CHD-PAH 肺組織中非 BMPR2 突變性的 BMP 信號通路的普遍下調機制提供了一種合理的解釋。
圖5
實驗結論圖
利益沖突：無。
作者貢獻：劉旭負責數據整理、分析，作圖及論文初稿撰寫等；鄧紅玉負責技術指導、論文審閱與修改等；周平負責課題構思，論文設計、審閱與修改等。
