引用本文： 劉通, 王賀雙, 許凝. PD-1 單克隆抗體對體外誘導擴增的 CIK細胞抗肺癌效應的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2021, 28(8): 990-997. doi: 10.7507/1007-4848.202006043 復制
肺癌是我國目前最常見的惡性腫瘤，是男性最常發病的惡性腫瘤，發病率為 57.26/10 萬，死亡率位居我國惡性腫瘤死亡率的首位[1]。人們常規上將肺癌主要分為兩種類型，一種為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），約占肺癌總數的 85%，主要包括三種組織學亞型：腺癌、鱗狀細胞癌（鱗癌）和大細胞癌。其中約 16% 的 NSCLC 患者表現為早期疾病，如病變局限于胸部和原發腫瘤<5 cm，但大多數 NSCLC 患者是在晚期確診的，此時常規治療方法都沒有明顯效果[2]。肺癌的另外一種主要類型為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），約占肺癌總數的 13%～15%，是支氣管上皮發生的未分化、伴有神經內分泌分化的一種與預后不良相關的侵襲性惡性腫瘤[3]。作為一種高侵襲性的神經內分泌腫瘤，SCLC 具有高生長分數、較短的倍增時間和廣泛轉移的早期發展等特點，導致 SCLC 患者的預后極差[4]。
目前現有的腫瘤免疫療法分為三大方向：免疫檢查點抑制劑、細胞免疫治療和腫瘤疫苗[5]。其中過繼細胞免疫治療是一種針對多種癌癥切實可行且有效的治療方法[6-7]。活化的免疫細胞可以在靜脈注射后幾分鐘內到達病變部位，并選擇性地進入惡性腫瘤組織，在治療后 24 h 內，大量的免疫活性細胞可以在病變部位積聚并殺傷腫瘤[8]。CIK 細胞是通過體外誘導活化的淋巴細胞，作為一種具有自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）樣的天然細胞毒性潛能的 T 淋巴細胞，CIK 細胞可通過供體外周血單個核細胞誘導分化而來，并且具有對正常細胞無毒性、抗瘤譜廣（對多重耐藥的癌細胞同樣敏感）、增殖速度快、無 T 淋巴細胞殺傷時的組織相容性復合體（MHC）限制性等特點，因此被廣泛應用于過繼細胞免疫治療。有研究[9]表明，CIK 細胞免疫治療和 PD-1 單克隆抗體聯合治療可延遲腫瘤的生長，也有研究[10]表明 PD-1 單克隆抗體與 CIK 細胞免疫治療聯合應用可顯著增強細胞毒性和抗腫瘤反應。目前肺癌的治療趨向于多種治療方法聯合應用，尤以免疫治療的進展最為顯著。因此本文通過體外細胞水平實驗將新興的 PD-1 單克隆抗體與 CIK 細胞治療聯合起來分析其抗肺癌效應及影響因素，意在為以后的臨床應用提供實驗依據和理論支持。
1 材料與方法
1.1 材料來源
CIK 細胞由大連市中心醫院腫瘤內科 2019 年 1～5 月確診的中晚期肺癌患者外周血培養而來。受試者需符合全部下列標準：（1）經過病理組織學或細胞學確診的ⅡB～ⅢA 期（美國癌癥聯合委員會第 8 版）肺腺癌或肺鱗癌；（2）年齡 18～70 歲；（3）有患者本人或法定代理人簽署知情同意書；（4）綜合身體狀況較好，Karnofsky 功能狀態（KPS）評分≥60 分；預期生存時間≥12 個月；（5）均無已知的其它惡性腫瘤病史；（6）篩選時的血常規結果：白細胞計數≥0.3×1010/L，血小板計數≥10×1010/L，血紅蛋白≥90 g/L。符合下列任一標準的受試者即被排除：（1）妊娠或哺乳期女性、準備在研究期間妊娠或哺乳的女性；（2）人類免疫缺陷病毒抗體檢測陽性或梅毒陽性；（3）多器官功能衰竭或有器官移植史者；（4）4 周內使用過大量糖皮質激素或其它免疫抑制劑者；（5）嚴重膿毒血癥、敗血癥，或患有不可控制的感染性疾病者；（6）依從性差，由于身體或個人原因無法進行采血，或無法配合治療的患者；（7）既往 6 個月內曾接受過免疫檢查點抑制劑治療、過繼細胞免疫治療、靶向藥物或其它類型免疫治療；（8）篩選前 30 d 內曾接受其它任何試驗藥物治療或參加過另一項干預性臨床試驗；（9）入組后出現嚴重過敏反應需使用激素處理的受試者；（10）既往有已知或可疑的活動性自身免疫性疾病；（11）其他研究者認為不適合入組的情況。共有 20 例肺癌（16 例腺癌、4 例鱗癌）患者符合上述受試者標準，其中男 8 例、女 12 例，平均年齡 42～65（56.45±5.89）歲。肺癌 A549 細胞取自大連市中心醫院中心實驗室細胞庫，裸鼠（BALB/c-nu）取自大連醫科大學動物實驗中心（遼寧長生生物技術股份有限公司），余實驗所需器械試劑均來源于大連市中心醫院中心實驗室。
1.2 研究方法
1.2.1 肺癌 A549 細胞復蘇傳代
從細胞庫中取出裝有肺癌 A549 細胞凍存管一枚，置入 38℃～40℃ 水浴中 60 s 復蘇，期間快速晃動，直到冷凍管內部結冰完全融化。以 75% 酒精消毒凍存管管壁，在超凈工作臺打開凍存管，以一次性實驗室用塑料吸管（5 mL）盡量完整吸取凍存管內細胞后移至離心管中，補加 10 mL PBS（Hyclone，美國），離心管置入離心機（Eppendorf，德國）中低速（1 500 r/min）離心 5 min，棄去離心管中廢液，補加 DMEM 培養基（Hyclone，美國）和 10% 胎牛血清（Gibco，美國）的聯合培養基 10 mL 后移入培養瓶，放置于 5% CO2、37℃ 培養箱中培養。當顯微鏡下觀察培養瓶中貼壁細胞 80% 貼壁生長后，以 75% 酒精消毒培養瓶體，在超凈工作臺打開培養瓶，棄掉瓶中培養液，以塑料吸管吸取 0.25% 胰蛋白酶 3 mL 后輕輕拍打瓶底，顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，當細胞呈單個狀態后加入 7 mL 培養基終止消化過程，將培養瓶中液體倒入離心管后離心機離心 5 min（轉速2 000 r/min），棄上清液后加入 10 mL 培養基，分兩瓶裝后補加培養基，放入培養箱中培養，及時換液傳代，取呈對數生長期的細胞用于實驗。
1.2.2 CIK 細胞的制備
取肺癌患者外周血，通過密度梯度離心法從全血中分離獲得人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），體外添加干擾素-γ（interferon-gamma，IFN-γ，1000 U/mL，Peprotech，美國），抗 CD3 單克隆抗體（50 ng/mL，eBioscience，美國）和白細胞介素 2（interleukin-2，IL-2，1 000 U/mL，Boehringer Mannheim，德國）等細胞因子誘導。每 5 d 加入新鮮完整培養基，持續 14～21 d。顯微鏡下觀察 CIK 細胞生長情況。
1.2.3 流式細胞儀檢測 CIK 細胞表型
培養箱中取出培養 2 周的 CIK 細胞，用 PBS 沖洗 2 次后，分別加入下列單克隆抗體：CD3-FITC、CD56-PC7、CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-FITC（均購于 Beckman，美國）、CD279-APC（抗 PD-1，購于 Biolegend，美國）。室溫下避光孵育 30 min 后 PBS 離心洗滌后加入 PBS 重懸，流式細胞儀（Becton Dickinson，美國）檢測細胞表型。
1.2.4 采用 CCK-8 法檢測 CIK 細胞對肺癌細胞 A549 殺傷活性
于培養箱中取呈對數生長期的肺癌細胞 A549，消化后調整其密度呈 5×104/mL。實驗設肺癌細胞 A549 作為靶細胞，設培養 2 周的 CIK 細胞作為效應細胞，所有組 CIK 細胞均取自同一患者。準備 96 孔板，實驗設置 CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組（每 1×106 個 CIK 細胞加入 6 μg PD-1 單克隆抗體孵育 2 h，PD-1 單克隆抗體購于 Abcam，英國）、單獨 CIK 細胞不含 PD-1 單克隆抗體組和單獨 PD-1 單克隆抗體組，另設單獨肺癌 A549 細胞和 CIK 細胞組作為對照，每組變量設置 3 個復孔。分別按不同效靶比（5∶1，10∶1，20∶1，40∶1）把效應細胞和肺癌 A549 細胞接種于 96 孔板。單獨 CIK 細胞（不含 PD-1 單克隆抗體）組殺傷效應實驗：以先前設定的效靶比（5∶1，10∶1，20∶1，40∶1），將單獨的 CIK 細胞（不含 PD-1 單克隆抗體）作用于靶細胞。CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組殺傷效應實驗：與上述實驗方法相同，將 CIK 細胞與 PD-1 單克隆抗體聯合培養后按照特定的效靶比（5∶1，10∶1，20∶1，40∶1）作用于靶細胞，單獨單克隆抗體組殺傷實驗設計同上。3 組放入培養箱培養 24 h 后，?20℃ 取 CCK-8 試劑（同仁化學生物公司，日本）復溫，每孔加入 10 μL 后，放入 37℃，5% CO2 培養箱孵育 4 h，酶標儀（Bio-rad 680，美國）450 nm 檢測光密度（optical density，OD）。殺傷分數為：1?
×100%。
1.2.5 流式細胞儀檢測各組 CIK 細胞穿孔素及顆粒酶表達水平
實驗設置 PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞培養組與單獨 CIK 細胞組，在相同環境下檢測兩組 CIK 細胞的穿孔素和顆粒酶表達水平。以 PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞培養組為例，取體外誘導擴增 14 d 的 CIK 細胞與 PD-1 單克隆抗體共培養（方法同上文），誘導后的 CIK 細胞用 PBS 洗滌后調整細胞數量為 1×106 個，加入 20 μL 的 PerCP-Cy5.5-CD3 和 5 μL 的 FITC-CD56 抗體（eBioscience，美國），室溫下避光孵育 15 min，再次 PBS 洗滌，加入 100 μL 破膜劑 A，室溫避光孵育 15 min，PBS 洗滌后加入 100 μL 的破膜劑 B（Caltag，美國），在管中加入 5 μL PE-Granzyme B 和 20 μL PE-perforin 抗體（PeproTech，美國）共同孵育 15 min，PBS 洗滌后進行流式細胞儀檢測分析。單獨 CIK 細胞組的穿孔素和顆粒酶檢測方法同上。
1.2.6 ELISA 法檢測各組 CIK 細胞因子分泌水平
取肺癌 A549 株作為靶細胞，設定 CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組和單獨 CIK 細胞組，測定在效靶比 40∶1 時兩組 CIK 細胞的細胞因子 IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）分泌水平，各組 CIK 細胞均取自同一患者。取呈對數生長期的肺癌 A549 細胞，調整細胞密度為 1×105/mL。取 48 孔板種植 100 μL 的肺癌 A549 細胞。PD-1 單克隆抗體加 CIK 細胞組：將 CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體培養后（方法同前文）加入到靶細胞中。單獨 CIK 細胞組：取相同數量的 CIK 細胞，單獨作用于靶細胞中。另設對照組，不含 PD-1 單克隆抗體及 CIK 細胞。共培養 48 h 后收集上清液，ELISA 法（試劑購于 eBioscience，美國）測定細胞因子 IL-2、IFN-γ、TNF-α。
1.3 統計學分析
統計學分析采用 GraphPad Prism 5.0 軟件和 SPSS（Statistical Product and Service Solutions）21.0 軟件，計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用 t 檢驗。P≤0.05 為差異有統計學意義。
1.4 倫理審查
本研究經大連市中心醫院倫理委員會批準并監督，審批編號：2019-004-27，所有實驗都按照世界醫學協會的道德規范進行。所有入組患者均已簽署知情同意書，本研究符合臨床試驗管理規范指導原則、藥物臨床試驗質量管理規范和《赫爾辛基宣言》的倫理準則。
2 結果
2.1 流式細胞儀檢測 CIK 細胞表型
本研究選擇 20 例確診中晚期肺癌患者進行 CIK 細胞的制備，在體外誘導擴增 2 周后通過流式細胞儀檢測其表型，結果顯示其中 CD3+CD56+細胞所占比例為 31.58%±7.63%，CD3+細胞所占比例為 89.86%±3.23%，CD3+CD8+細胞所占比例為 52.24%±5.26%，CD3+CD4+細胞所占比例為 34.99%±5.56%。數據顯示 20 例肺癌患者體外誘導產生的 CIK 細胞中所含 CD3+CD56+細胞亞群比例接近。
2.2 CCK8 法檢測各組在不同效靶比條件下對肺癌細胞的殺傷效應
在 CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組和單獨 CIK 細胞組的肺癌細胞殺傷實驗中，二者殺傷效應均呈現對效應細胞濃度的依賴性且趨勢相同；見圖 1。在不同效靶比的條件下，CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組與單獨 CIK 細胞組對肺癌 A549 細胞的殺傷效應差異具有統計學意義：E∶T 為 5∶1（28.5%±1.9% vs. 20.3%±1.8%，P<0.05）、10∶1（40.6%±2.4% vs. 31.7%±2.1%，P<0.05）、20∶1（57.4%±3.5% vs. 44.7%±3.8%，P<0.05）、40∶1（74.1%±8.3% vs. 60.8%±5.3%，P<0.05）。在不同效靶比條件下，兩組 CIK 細胞對肺癌 A549 細胞的殺傷效應均明顯優于 PD-1 單克隆抗體組（P<0.01）。不同來源的 CIK 細胞殺傷實驗結果相近。
圖1
CCK-8 法檢測各組間不同的效靶比時對肺癌 A549 細胞殺傷效應
2.3 流式細胞儀檢測各組 CIK 細胞穿孔素及顆粒酶表達水平
與單獨的 CIK 細胞組相比，CIK 細胞與 PD-1 單克隆抗體聯合培養后，細胞穿孔素釋放水平差異有統計學意義（P<0.05），細胞顆粒酶釋放水平差異同樣具有統計學意義（P<0.05），提示 PD-1 單克隆抗體對于 CIK 細胞穿孔素及顆粒酶的表達陽性率具有促進作用；見圖 2。
圖2
流式細胞儀檢測各組間穿孔素及顆粒酶的表達水平
*：
2.4 ELISA 法檢測各組 CIK 細胞因子分泌水平
在 A549 肺癌細胞條件下，CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體對比 CIK 細胞單獨應用結果提示 CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組 IL-2 釋放多于 CIK 細胞組，差異具有統計學意義（P<0.05）；見圖 3。CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組 TNF-α 釋放多于 CIK 細胞組，差異具有統計學意義（P<0.05）；見圖 4。CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組 IFN-γ 釋放多于 CIK 細胞組，差異具有統計學意義（P<0.05）；見圖 5。以上結果證實了 PD-1 單克隆抗體對于 CIK 細胞因子分泌水平有著明顯的促進作用。
圖3
各組間 IL-2 的釋放水平
*：
圖4
各組間 TNF-α 的釋放水平
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圖5
各組間 IFN-γ 的釋放水平
*：
3 討論
癌癥作為威脅人類健康的頭號疾病，現已成為中國乃至全世界各地的主要公共衛生問題，預計在未來幾十年里仍有較高的發病率和死亡率[11]。肺癌是最常見的癌癥之一，也是全球范圍內癌癥相關性死亡的最常見原因[12]。肺癌標準的治療方案包括手術、化療和放療。然而，由于腫瘤類型不同、部分患者體質不允許或多發腫瘤情況的存在，很大一部分肺癌患者往往不能通過傳統方式治療。在可以選擇這些治療手段的患者中，總的 5 年生存率為 16.6%，這可能是由于患者確診時就已經存在轉移性疾病或微小的殘留病灶[13]。
先天性免疫和適應性免疫是抑制腫瘤生長和幫助人體清除腫瘤細胞的重要因素[14]。當二者出現功能障礙時，往往可能導致腫瘤的發生。惡性腫瘤患者無法有效治愈的原因之一可能就是由于機體免疫功能低下，無法啟動有效的免疫應答[15-16]。過繼細胞免疫治療的研究進展為晚期肺癌患者的治療提供了廣闊的治療前景，通過在體外擴增自體腫瘤特異性效應細胞，然后再回輸到宿主體內，促進免疫應答的能力，提高人體的抗腫瘤細胞免疫反應[17]。CIK 細胞首次于 1991 年被發現[18]，它具有 T 細胞和 NK 細胞的共同特征及非 MHC 限制性的抗腫瘤能力。具有這種雙重 T/NK 表型的細胞毒性細胞很少見，約占人體循環血液的 1%～5%。CIK 細胞除了直接殺傷腫瘤細胞外，還可通過分泌多種細胞因子調節免疫功能。大量研究[19]表明，在腫瘤細胞的刺激下，CIK 細胞分泌 TNF-α、IFN-γ 和 IL-2 水平顯著上調，這些細胞因子進一步增強了系統的抗腫瘤活性，誘導免疫應答。
根據免疫監視理論，在癌癥早期宿主可以通過激活先天性和適應性免疫機制來控制腫瘤的生長，但當一些腫瘤細胞的表觀遺傳發生了變化后，我們的免疫系統就無法識別腫瘤細胞表面表達的異常蛋白，進一步使得腫瘤細胞逃避人體的免疫系統[20]。在免疫系統識別腫瘤的過程中，T 細胞受體首先識別 MHC 所遞呈的腫瘤特異性抗原作為激活 T 細胞的第一信號。然而單靠抗原刺激無法充分激活 T 細胞，免疫細胞還需要共刺激信號才能被充分激活。機體為了避免自身免疫反應，防止免疫系統被過度激活，一些檢查點分子被放置在各個關鍵節點，用來檢查和平衡免疫反應。例如 PD-1 就是這樣一種免疫檢查點分子，在活化的 T 細胞中表達。一旦 PD-1 與腫瘤細胞表面表達的 PD-L1 結合，T 細胞對腫瘤的識別能力就會受到抑制，從而導致免疫細胞死亡或失去免疫殺傷的能力。免疫檢查點抑制劑可以阻斷這種途徑，重新恢復機體免疫功能，因此免疫治療的原理并不是直接使用藥物殺死腫瘤細胞，而是重新激活免疫系統識別和破壞腫瘤細胞的能力[21]。目前免疫檢查點抑制劑已經成為癌癥領域最有前途的方法之一。在已發現的多種免疫檢查點中，PD-1/PD-L1 被證明是導致慢性病毒感染和腫瘤患者 T 細胞免疫功能下降的原因之一[22]。PD-1 是 T 細胞表面表達的免疫檢查點之一，通過與其配體 PD-L1 或 PD-L2 的結合可誘導負性控制信號，從而抑制 T 細胞增殖、細胞因子產生，以及細胞毒性活性。基于阻斷這些免疫檢查點可以恢復免疫功能的原理，人們已經開發了針對 NSCLC 的各種抗 PD-1 抗體[23]。
如今肺癌聯合治療策略有效地克服了腫瘤的耐藥性，研究免疫檢查點抑制劑（抗 PD-L1/PD-1 療法）與其它免疫療法組合的臨床試驗正在進行中，據近期數據統計全球目前共有 356 項關于肺癌聯合免疫治療研究[24]。本研究鑒于 CIK 細胞屬于 NK 樣 T 細胞，因此推斷通過阻斷 PD-1 信號可增強 CIK 細胞的抗腫瘤效應。一系列研究證明了抑制性受體表達在 CIK 細胞上，阻斷這些受體能夠顯著增強 CIK 介導的抗腫瘤細胞毒性反應。這些發現進一步證明了 PD-1/PD-L1 通路抑制劑聯合 CIK 細胞介導的抗腫瘤效應成為了新的晚期惡性腫瘤的治療策略[10]。本研究通過體外誘導肺癌患者外周血單個核細胞獲得 CIK 細胞群，其中 CD3+CD56+細胞亞群占總數的 31.58%±7.63%，這與 Ding 等[25]的實驗結果相近。在 PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞培養和單獨 CIK 細胞對肺癌細胞 A549 的殺傷實驗中，得出不論是否與 PD-1 抗體共培養，CIK 細胞對肺癌細胞 A549 的殺傷都隨著效靶比的增大而增大，證明了 CIK 細胞對肺癌細胞 A549 的殺傷效應存在著濃度依賴。與 PD-1 單克隆抗體聯合培養的 CIK 細胞組與單獨 CIK 細胞組相比，二者聯合培養后在不同效靶比時均可增強 CIK 細胞對 A549 肺癌細胞的殺傷效應，差異具有統計學意義。通過檢測各組 CIK 細胞穿孔素及顆粒酶表達水平和各組 CIK 細胞因子分泌水平，我們得出 PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞培養后在穿孔素及顆粒酶表達水平、細胞因子分泌水平都比單獨 CIK 細胞組要高，且差異具有統計學意義。免疫系統識別癌細胞表面表達特異性抗原后激活免疫效應細胞（主要是 T 淋巴細胞和 NK 細胞），NK 細胞和巨噬細胞產生 IL-2、IL-12 和 IFN-γ 殺死腫瘤細胞[26]，其中 IL-2 等細胞因子還對維持細胞毒性 T 淋巴細胞的活性起重要作用[27]。CD8+細胞毒性 T 細胞通過產生 IFN-γ、TNF-α 和顆粒酶等殺傷腫瘤細胞[28]。NSCLC 免疫應答的初步研究證實 IL-2 和 TNF-α 等細胞因子對促進 NK 細胞活性和激活巨噬細胞這兩個過程進而激活先天免疫至關重要[27]。通過實驗結果我們得知，PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞培養較單獨 CIK 細胞提高了分泌細胞因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）水平，這可能是 PD-1 單克隆抗體提高了 CIK 細胞抗腫瘤效應的原因。有研究[29]表明 PD-1 與 PD-L1 結合后阻斷了 IL-2 的合成和分泌，而前文我們得知 IL-2 對 T 細胞的活化和維持細胞毒性起重要作用，因此抗 PD-1 治療后理應提高 IL-2 的分泌水平，與本文結果相符。也有研究[9]通過 CIK 細胞 IFN-γ 因子釋放實驗進一步驗證了阻斷 PD-L1/PD-1 結合后提高 CIK 細胞 IFN-γ 分泌水平，進一步增強了殺傷腫瘤的能力。因此也有報道[30]認為 IFN-γ 表達可以作為預測抗 PD-L1/PD-1 治療效果的生物標志物。通過對 PD-1 單克隆抗體與 CIK 細胞聯合培養后的檢測，我們發現聯合培養后的 CIK 細胞分泌多種細胞因子和抗腫瘤物質的水平都得到了明顯的提高，因此我們認為，PD-1 單克隆抗體確實能夠增加 CIK 細胞的殺瘤效應。
綜上所述，通過利用 IFN-γ、抗 CD3 抗體、IL-2 細胞因子體外誘導擴增肺癌患者外周血單個核細胞能夠獲得具有抗肺癌效應的 CIK 細胞，大大提高了 CD3+CD56+細胞比例。本文實驗得知 CIK 細胞對肺癌 A549 細胞的殺傷程度隨效靶比的改變而改變。將 PD-1 單克隆抗體與 CIK 細胞聯合培養后，CIK 細胞在同一來源、同一數量的情況下，提高了殺瘤效應，并且證明了 PD-1 單克隆抗體能夠增強 CIK 細胞分泌穿孔素、顆粒酶以及細胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）的能力。本文為 PD-1 單克隆抗體能夠增強 CIK 細胞抗肺癌腫瘤細胞效應這一理論提供了依據并進行了機制研究，但這并不代表能夠與未來肺癌患者體內用藥療效一致，因為臨床藥物實驗的藥物濃度、不良反應以及用藥時間等尚未確定，因此不能預測 PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞在肺癌患者中的療效，同時也缺少相應的檢測來尋找適應人群和預測預后指標。
利益沖突：無。
作者貢獻：劉通負責論文初稿撰寫與數據收集；王賀雙負責數據整理和分析；許凝負責論文總體設計。
肺癌是我國目前最常見的惡性腫瘤，是男性最常發病的惡性腫瘤，發病率為 57.26/10 萬，死亡率位居我國惡性腫瘤死亡率的首位[1]。人們常規上將肺癌主要分為兩種類型，一種為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），約占肺癌總數的 85%，主要包括三種組織學亞型：腺癌、鱗狀細胞癌（鱗癌）和大細胞癌。其中約 16% 的 NSCLC 患者表現為早期疾病，如病變局限于胸部和原發腫瘤<5 cm，但大多數 NSCLC 患者是在晚期確診的，此時常規治療方法都沒有明顯效果[2]。肺癌的另外一種主要類型為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），約占肺癌總數的 13%～15%，是支氣管上皮發生的未分化、伴有神經內分泌分化的一種與預后不良相關的侵襲性惡性腫瘤[3]。作為一種高侵襲性的神經內分泌腫瘤，SCLC 具有高生長分數、較短的倍增時間和廣泛轉移的早期發展等特點，導致 SCLC 患者的預后極差[4]。
目前現有的腫瘤免疫療法分為三大方向：免疫檢查點抑制劑、細胞免疫治療和腫瘤疫苗[5]。其中過繼細胞免疫治療是一種針對多種癌癥切實可行且有效的治療方法[6-7]。活化的免疫細胞可以在靜脈注射后幾分鐘內到達病變部位，并選擇性地進入惡性腫瘤組織，在治療后 24 h 內，大量的免疫活性細胞可以在病變部位積聚并殺傷腫瘤[8]。CIK 細胞是通過體外誘導活化的淋巴細胞，作為一種具有自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）樣的天然細胞毒性潛能的 T 淋巴細胞，CIK 細胞可通過供體外周血單個核細胞誘導分化而來，并且具有對正常細胞無毒性、抗瘤譜廣（對多重耐藥的癌細胞同樣敏感）、增殖速度快、無 T 淋巴細胞殺傷時的組織相容性復合體（MHC）限制性等特點，因此被廣泛應用于過繼細胞免疫治療。有研究[9]表明，CIK 細胞免疫治療和 PD-1 單克隆抗體聯合治療可延遲腫瘤的生長，也有研究[10]表明 PD-1 單克隆抗體與 CIK 細胞免疫治療聯合應用可顯著增強細胞毒性和抗腫瘤反應。目前肺癌的治療趨向于多種治療方法聯合應用，尤以免疫治療的進展最為顯著。因此本文通過體外細胞水平實驗將新興的 PD-1 單克隆抗體與 CIK 細胞治療聯合起來分析其抗肺癌效應及影響因素，意在為以后的臨床應用提供實驗依據和理論支持。
1 材料與方法
1.1 材料來源
CIK 細胞由大連市中心醫院腫瘤內科 2019 年 1～5 月確診的中晚期肺癌患者外周血培養而來。受試者需符合全部下列標準：（1）經過病理組織學或細胞學確診的ⅡB～ⅢA 期（美國癌癥聯合委員會第 8 版）肺腺癌或肺鱗癌；（2）年齡 18～70 歲；（3）有患者本人或法定代理人簽署知情同意書；（4）綜合身體狀況較好，Karnofsky 功能狀態（KPS）評分≥60 分；預期生存時間≥12 個月；（5）均無已知的其它惡性腫瘤病史；（6）篩選時的血常規結果：白細胞計數≥0.3×1010/L，血小板計數≥10×1010/L，血紅蛋白≥90 g/L。符合下列任一標準的受試者即被排除：（1）妊娠或哺乳期女性、準備在研究期間妊娠或哺乳的女性；（2）人類免疫缺陷病毒抗體檢測陽性或梅毒陽性；（3）多器官功能衰竭或有器官移植史者；（4）4 周內使用過大量糖皮質激素或其它免疫抑制劑者；（5）嚴重膿毒血癥、敗血癥，或患有不可控制的感染性疾病者；（6）依從性差，由于身體或個人原因無法進行采血，或無法配合治療的患者；（7）既往 6 個月內曾接受過免疫檢查點抑制劑治療、過繼細胞免疫治療、靶向藥物或其它類型免疫治療；（8）篩選前 30 d 內曾接受其它任何試驗藥物治療或參加過另一項干預性臨床試驗；（9）入組后出現嚴重過敏反應需使用激素處理的受試者；（10）既往有已知或可疑的活動性自身免疫性疾病；（11）其他研究者認為不適合入組的情況。共有 20 例肺癌（16 例腺癌、4 例鱗癌）患者符合上述受試者標準，其中男 8 例、女 12 例，平均年齡 42～65（56.45±5.89）歲。肺癌 A549 細胞取自大連市中心醫院中心實驗室細胞庫，裸鼠（BALB/c-nu）取自大連醫科大學動物實驗中心（遼寧長生生物技術股份有限公司），余實驗所需器械試劑均來源于大連市中心醫院中心實驗室。
1.2 研究方法
1.2.1 肺癌 A549 細胞復蘇傳代
從細胞庫中取出裝有肺癌 A549 細胞凍存管一枚，置入 38℃～40℃ 水浴中 60 s 復蘇，期間快速晃動，直到冷凍管內部結冰完全融化。以 75% 酒精消毒凍存管管壁，在超凈工作臺打開凍存管，以一次性實驗室用塑料吸管（5 mL）盡量完整吸取凍存管內細胞后移至離心管中，補加 10 mL PBS（Hyclone，美國），離心管置入離心機（Eppendorf，德國）中低速（1 500 r/min）離心 5 min，棄去離心管中廢液，補加 DMEM 培養基（Hyclone，美國）和 10% 胎牛血清（Gibco，美國）的聯合培養基 10 mL 后移入培養瓶，放置于 5% CO2、37℃ 培養箱中培養。當顯微鏡下觀察培養瓶中貼壁細胞 80% 貼壁生長后，以 75% 酒精消毒培養瓶體，在超凈工作臺打開培養瓶，棄掉瓶中培養液，以塑料吸管吸取 0.25% 胰蛋白酶 3 mL 后輕輕拍打瓶底，顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，當細胞呈單個狀態后加入 7 mL 培養基終止消化過程，將培養瓶中液體倒入離心管后離心機離心 5 min（轉速2 000 r/min），棄上清液后加入 10 mL 培養基，分兩瓶裝后補加培養基，放入培養箱中培養，及時換液傳代，取呈對數生長期的細胞用于實驗。
1.2.2 CIK 細胞的制備
取肺癌患者外周血，通過密度梯度離心法從全血中分離獲得人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），體外添加干擾素-γ（interferon-gamma，IFN-γ，1000 U/mL，Peprotech，美國），抗 CD3 單克隆抗體（50 ng/mL，eBioscience，美國）和白細胞介素 2（interleukin-2，IL-2，1 000 U/mL，Boehringer Mannheim，德國）等細胞因子誘導。每 5 d 加入新鮮完整培養基，持續 14～21 d。顯微鏡下觀察 CIK 細胞生長情況。
1.2.3 流式細胞儀檢測 CIK 細胞表型
培養箱中取出培養 2 周的 CIK 細胞，用 PBS 沖洗 2 次后，分別加入下列單克隆抗體：CD3-FITC、CD56-PC7、CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-FITC（均購于 Beckman，美國）、CD279-APC（抗 PD-1，購于 Biolegend，美國）。室溫下避光孵育 30 min 后 PBS 離心洗滌后加入 PBS 重懸，流式細胞儀（Becton Dickinson，美國）檢測細胞表型。
1.2.4 采用 CCK-8 法檢測 CIK 細胞對肺癌細胞 A549 殺傷活性
于培養箱中取呈對數生長期的肺癌細胞 A549，消化后調整其密度呈 5×104/mL。實驗設肺癌細胞 A549 作為靶細胞，設培養 2 周的 CIK 細胞作為效應細胞，所有組 CIK 細胞均取自同一患者。準備 96 孔板，實驗設置 CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組（每 1×106 個 CIK 細胞加入 6 μg PD-1 單克隆抗體孵育 2 h，PD-1 單克隆抗體購于 Abcam，英國）、單獨 CIK 細胞不含 PD-1 單克隆抗體組和單獨 PD-1 單克隆抗體組，另設單獨肺癌 A549 細胞和 CIK 細胞組作為對照，每組變量設置 3 個復孔。分別按不同效靶比（5∶1，10∶1，20∶1，40∶1）把效應細胞和肺癌 A549 細胞接種于 96 孔板。單獨 CIK 細胞（不含 PD-1 單克隆抗體）組殺傷效應實驗：以先前設定的效靶比（5∶1，10∶1，20∶1，40∶1），將單獨的 CIK 細胞（不含 PD-1 單克隆抗體）作用于靶細胞。CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組殺傷效應實驗：與上述實驗方法相同，將 CIK 細胞與 PD-1 單克隆抗體聯合培養后按照特定的效靶比（5∶1，10∶1，20∶1，40∶1）作用于靶細胞，單獨單克隆抗體組殺傷實驗設計同上。3 組放入培養箱培養 24 h 后，?20℃ 取 CCK-8 試劑（同仁化學生物公司，日本）復溫，每孔加入 10 μL 后，放入 37℃，5% CO2 培養箱孵育 4 h，酶標儀（Bio-rad 680，美國）450 nm 檢測光密度（optical density，OD）。殺傷分數為：1?×100%。
1.2.5 流式細胞儀檢測各組 CIK 細胞穿孔素及顆粒酶表達水平
實驗設置 PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞培養組與單獨 CIK 細胞組，在相同環境下檢測兩組 CIK 細胞的穿孔素和顆粒酶表達水平。以 PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞培養組為例，取體外誘導擴增 14 d 的 CIK 細胞與 PD-1 單克隆抗體共培養（方法同上文），誘導后的 CIK 細胞用 PBS 洗滌后調整細胞數量為 1×106 個，加入 20 μL 的 PerCP-Cy5.5-CD3 和 5 μL 的 FITC-CD56 抗體（eBioscience，美國），室溫下避光孵育 15 min，再次 PBS 洗滌，加入 100 μL 破膜劑 A，室溫避光孵育 15 min，PBS 洗滌后加入 100 μL 的破膜劑 B（Caltag，美國），在管中加入 5 μL PE-Granzyme B 和 20 μL PE-perforin 抗體（PeproTech，美國）共同孵育 15 min，PBS 洗滌后進行流式細胞儀檢測分析。單獨 CIK 細胞組的穿孔素和顆粒酶檢測方法同上。
1.2.6 ELISA 法檢測各組 CIK 細胞因子分泌水平
取肺癌 A549 株作為靶細胞，設定 CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組和單獨 CIK 細胞組，測定在效靶比 40∶1 時兩組 CIK 細胞的細胞因子 IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）分泌水平，各組 CIK 細胞均取自同一患者。取呈對數生長期的肺癌 A549 細胞，調整細胞密度為 1×105/mL。取 48 孔板種植 100 μL 的肺癌 A549 細胞。PD-1 單克隆抗體加 CIK 細胞組：將 CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體培養后（方法同前文）加入到靶細胞中。單獨 CIK 細胞組：取相同數量的 CIK 細胞，單獨作用于靶細胞中。另設對照組，不含 PD-1 單克隆抗體及 CIK 細胞。共培養 48 h 后收集上清液，ELISA 法（試劑購于 eBioscience，美國）測定細胞因子 IL-2、IFN-γ、TNF-α。
1.3 統計學分析
統計學分析采用 GraphPad Prism 5.0 軟件和 SPSS（Statistical Product and Service Solutions）21.0 軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用 t 檢驗。P≤0.05 為差異有統計學意義。
1.4 倫理審查
本研究經大連市中心醫院倫理委員會批準并監督，審批編號：2019-004-27，所有實驗都按照世界醫學協會的道德規范進行。所有入組患者均已簽署知情同意書，本研究符合臨床試驗管理規范指導原則、藥物臨床試驗質量管理規范和《赫爾辛基宣言》的倫理準則。
2 結果
2.1 流式細胞儀檢測 CIK 細胞表型
本研究選擇 20 例確診中晚期肺癌患者進行 CIK 細胞的制備，在體外誘導擴增 2 周后通過流式細胞儀檢測其表型，結果顯示其中 CD3+CD56+細胞所占比例為 31.58%±7.63%，CD3+細胞所占比例為 89.86%±3.23%，CD3+CD8+細胞所占比例為 52.24%±5.26%，CD3+CD4+細胞所占比例為 34.99%±5.56%。數據顯示 20 例肺癌患者體外誘導產生的 CIK 細胞中所含 CD3+CD56+細胞亞群比例接近。
2.2 CCK8 法檢測各組在不同效靶比條件下對肺癌細胞的殺傷效應
在 CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組和單獨 CIK 細胞組的肺癌細胞殺傷實驗中，二者殺傷效應均呈現對效應細胞濃度的依賴性且趨勢相同；見圖 1。在不同效靶比的條件下，CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組與單獨 CIK 細胞組對肺癌 A549 細胞的殺傷效應差異具有統計學意義：E∶T 為 5∶1（28.5%±1.9% vs. 20.3%±1.8%，P<0.05）、10∶1（40.6%±2.4% vs. 31.7%±2.1%，P<0.05）、20∶1（57.4%±3.5% vs. 44.7%±3.8%，P<0.05）、40∶1（74.1%±8.3% vs. 60.8%±5.3%，P<0.05）。在不同效靶比條件下，兩組 CIK 細胞對肺癌 A549 細胞的殺傷效應均明顯優于 PD-1 單克隆抗體組（P<0.01）。不同來源的 CIK 細胞殺傷實驗結果相近。
圖1
CCK-8 法檢測各組間不同的效靶比時對肺癌 A549 細胞殺傷效應
2.3 流式細胞儀檢測各組 CIK 細胞穿孔素及顆粒酶表達水平
與單獨的 CIK 細胞組相比，CIK 細胞與 PD-1 單克隆抗體聯合培養后，細胞穿孔素釋放水平差異有統計學意義（P<0.05），細胞顆粒酶釋放水平差異同樣具有統計學意義（P<0.05），提示 PD-1 單克隆抗體對于 CIK 細胞穿孔素及顆粒酶的表達陽性率具有促進作用；見圖 2。
圖2
流式細胞儀檢測各組間穿孔素及顆粒酶的表達水平
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2.4 ELISA 法檢測各組 CIK 細胞因子分泌水平
在 A549 肺癌細胞條件下，CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體對比 CIK 細胞單獨應用結果提示 CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組 IL-2 釋放多于 CIK 細胞組，差異具有統計學意義（P<0.05）；見圖 3。CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組 TNF-α 釋放多于 CIK 細胞組，差異具有統計學意義（P<0.05）；見圖 4。CIK 細胞聯合 PD-1 單克隆抗體組 IFN-γ 釋放多于 CIK 細胞組，差異具有統計學意義（P<0.05）；見圖 5。以上結果證實了 PD-1 單克隆抗體對于 CIK 細胞因子分泌水平有著明顯的促進作用。
圖3
各組間 IL-2 的釋放水平
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圖4
各組間 TNF-α 的釋放水平
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圖5
各組間 IFN-γ 的釋放水平
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3 討論
癌癥作為威脅人類健康的頭號疾病，現已成為中國乃至全世界各地的主要公共衛生問題，預計在未來幾十年里仍有較高的發病率和死亡率[11]。肺癌是最常見的癌癥之一，也是全球范圍內癌癥相關性死亡的最常見原因[12]。肺癌標準的治療方案包括手術、化療和放療。然而，由于腫瘤類型不同、部分患者體質不允許或多發腫瘤情況的存在，很大一部分肺癌患者往往不能通過傳統方式治療。在可以選擇這些治療手段的患者中，總的 5 年生存率為 16.6%，這可能是由于患者確診時就已經存在轉移性疾病或微小的殘留病灶[13]。
先天性免疫和適應性免疫是抑制腫瘤生長和幫助人體清除腫瘤細胞的重要因素[14]。當二者出現功能障礙時，往往可能導致腫瘤的發生。惡性腫瘤患者無法有效治愈的原因之一可能就是由于機體免疫功能低下，無法啟動有效的免疫應答[15-16]。過繼細胞免疫治療的研究進展為晚期肺癌患者的治療提供了廣闊的治療前景，通過在體外擴增自體腫瘤特異性效應細胞，然后再回輸到宿主體內，促進免疫應答的能力，提高人體的抗腫瘤細胞免疫反應[17]。CIK 細胞首次于 1991 年被發現[18]，它具有 T 細胞和 NK 細胞的共同特征及非 MHC 限制性的抗腫瘤能力。具有這種雙重 T/NK 表型的細胞毒性細胞很少見，約占人體循環血液的 1%～5%。CIK 細胞除了直接殺傷腫瘤細胞外，還可通過分泌多種細胞因子調節免疫功能。大量研究[19]表明，在腫瘤細胞的刺激下，CIK 細胞分泌 TNF-α、IFN-γ 和 IL-2 水平顯著上調，這些細胞因子進一步增強了系統的抗腫瘤活性，誘導免疫應答。
根據免疫監視理論，在癌癥早期宿主可以通過激活先天性和適應性免疫機制來控制腫瘤的生長，但當一些腫瘤細胞的表觀遺傳發生了變化后，我們的免疫系統就無法識別腫瘤細胞表面表達的異常蛋白，進一步使得腫瘤細胞逃避人體的免疫系統[20]。在免疫系統識別腫瘤的過程中，T 細胞受體首先識別 MHC 所遞呈的腫瘤特異性抗原作為激活 T 細胞的第一信號。然而單靠抗原刺激無法充分激活 T 細胞，免疫細胞還需要共刺激信號才能被充分激活。機體為了避免自身免疫反應，防止免疫系統被過度激活，一些檢查點分子被放置在各個關鍵節點，用來檢查和平衡免疫反應。例如 PD-1 就是這樣一種免疫檢查點分子，在活化的 T 細胞中表達。一旦 PD-1 與腫瘤細胞表面表達的 PD-L1 結合，T 細胞對腫瘤的識別能力就會受到抑制，從而導致免疫細胞死亡或失去免疫殺傷的能力。免疫檢查點抑制劑可以阻斷這種途徑，重新恢復機體免疫功能，因此免疫治療的原理并不是直接使用藥物殺死腫瘤細胞，而是重新激活免疫系統識別和破壞腫瘤細胞的能力[21]。目前免疫檢查點抑制劑已經成為癌癥領域最有前途的方法之一。在已發現的多種免疫檢查點中，PD-1/PD-L1 被證明是導致慢性病毒感染和腫瘤患者 T 細胞免疫功能下降的原因之一[22]。PD-1 是 T 細胞表面表達的免疫檢查點之一，通過與其配體 PD-L1 或 PD-L2 的結合可誘導負性控制信號，從而抑制 T 細胞增殖、細胞因子產生，以及細胞毒性活性。基于阻斷這些免疫檢查點可以恢復免疫功能的原理，人們已經開發了針對 NSCLC 的各種抗 PD-1 抗體[23]。
如今肺癌聯合治療策略有效地克服了腫瘤的耐藥性，研究免疫檢查點抑制劑（抗 PD-L1/PD-1 療法）與其它免疫療法組合的臨床試驗正在進行中，據近期數據統計全球目前共有 356 項關于肺癌聯合免疫治療研究[24]。本研究鑒于 CIK 細胞屬于 NK 樣 T 細胞，因此推斷通過阻斷 PD-1 信號可增強 CIK 細胞的抗腫瘤效應。一系列研究證明了抑制性受體表達在 CIK 細胞上，阻斷這些受體能夠顯著增強 CIK 介導的抗腫瘤細胞毒性反應。這些發現進一步證明了 PD-1/PD-L1 通路抑制劑聯合 CIK 細胞介導的抗腫瘤效應成為了新的晚期惡性腫瘤的治療策略[10]。本研究通過體外誘導肺癌患者外周血單個核細胞獲得 CIK 細胞群，其中 CD3+CD56+細胞亞群占總數的 31.58%±7.63%，這與 Ding 等[25]的實驗結果相近。在 PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞培養和單獨 CIK 細胞對肺癌細胞 A549 的殺傷實驗中，得出不論是否與 PD-1 抗體共培養，CIK 細胞對肺癌細胞 A549 的殺傷都隨著效靶比的增大而增大，證明了 CIK 細胞對肺癌細胞 A549 的殺傷效應存在著濃度依賴。與 PD-1 單克隆抗體聯合培養的 CIK 細胞組與單獨 CIK 細胞組相比，二者聯合培養后在不同效靶比時均可增強 CIK 細胞對 A549 肺癌細胞的殺傷效應，差異具有統計學意義。通過檢測各組 CIK 細胞穿孔素及顆粒酶表達水平和各組 CIK 細胞因子分泌水平，我們得出 PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞培養后在穿孔素及顆粒酶表達水平、細胞因子分泌水平都比單獨 CIK 細胞組要高，且差異具有統計學意義。免疫系統識別癌細胞表面表達特異性抗原后激活免疫效應細胞（主要是 T 淋巴細胞和 NK 細胞），NK 細胞和巨噬細胞產生 IL-2、IL-12 和 IFN-γ 殺死腫瘤細胞[26]，其中 IL-2 等細胞因子還對維持細胞毒性 T 淋巴細胞的活性起重要作用[27]。CD8+細胞毒性 T 細胞通過產生 IFN-γ、TNF-α 和顆粒酶等殺傷腫瘤細胞[28]。NSCLC 免疫應答的初步研究證實 IL-2 和 TNF-α 等細胞因子對促進 NK 細胞活性和激活巨噬細胞這兩個過程進而激活先天免疫至關重要[27]。通過實驗結果我們得知，PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞培養較單獨 CIK 細胞提高了分泌細胞因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）水平，這可能是 PD-1 單克隆抗體提高了 CIK 細胞抗腫瘤效應的原因。有研究[29]表明 PD-1 與 PD-L1 結合后阻斷了 IL-2 的合成和分泌，而前文我們得知 IL-2 對 T 細胞的活化和維持細胞毒性起重要作用，因此抗 PD-1 治療后理應提高 IL-2 的分泌水平，與本文結果相符。也有研究[9]通過 CIK 細胞 IFN-γ 因子釋放實驗進一步驗證了阻斷 PD-L1/PD-1 結合后提高 CIK 細胞 IFN-γ 分泌水平，進一步增強了殺傷腫瘤的能力。因此也有報道[30]認為 IFN-γ 表達可以作為預測抗 PD-L1/PD-1 治療效果的生物標志物。通過對 PD-1 單克隆抗體與 CIK 細胞聯合培養后的檢測，我們發現聯合培養后的 CIK 細胞分泌多種細胞因子和抗腫瘤物質的水平都得到了明顯的提高，因此我們認為，PD-1 單克隆抗體確實能夠增加 CIK 細胞的殺瘤效應。
綜上所述，通過利用 IFN-γ、抗 CD3 抗體、IL-2 細胞因子體外誘導擴增肺癌患者外周血單個核細胞能夠獲得具有抗肺癌效應的 CIK 細胞，大大提高了 CD3+CD56+細胞比例。本文實驗得知 CIK 細胞對肺癌 A549 細胞的殺傷程度隨效靶比的改變而改變。將 PD-1 單克隆抗體與 CIK 細胞聯合培養后，CIK 細胞在同一來源、同一數量的情況下，提高了殺瘤效應，并且證明了 PD-1 單克隆抗體能夠增強 CIK 細胞分泌穿孔素、顆粒酶以及細胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF-α）的能力。本文為 PD-1 單克隆抗體能夠增強 CIK 細胞抗肺癌腫瘤細胞效應這一理論提供了依據并進行了機制研究，但這并不代表能夠與未來肺癌患者體內用藥療效一致，因為臨床藥物實驗的藥物濃度、不良反應以及用藥時間等尚未確定，因此不能預測 PD-1 單克隆抗體聯合 CIK 細胞在肺癌患者中的療效，同時也缺少相應的檢測來尋找適應人群和預測預后指標。
利益沖突：無。
作者貢獻：劉通負責論文初稿撰寫與數據收集；王賀雙負責數據整理和分析；許凝負責論文總體設計。
