肺癌是全世界發病率及病死率最高的惡性腫瘤。近年來，針對程序性死亡受體 1（programmed cell death 1，PD-1）及其配體（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）的免疫檢查點抑制劑治療顯著改善了非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的預后。然而在非選擇人群中免疫治療的客觀應答率僅約 20%，因此選擇出免疫治療潛在的獲益人群非常重要。通過免疫組織化學檢測腫瘤組織中 PD-L1 的表達可以在一定程度上預測免疫治療的療效，但是其仍有一定的局限性。最新臨床研究表明循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）上 PD-L1 的表達（PD-L1 expression in circulating tumor cells，CTC-PD-L1）是一種潛在的獨立生物標志物，其可為 NSCLC 的免疫治療提供重要信息。本文將對 CTC-PD-L1 檢測技術及其在 NSCLC 患者免疫治療效果中的預測價值及最新臨床研究進展進行綜述。
引用本文： 王亞東, 楊笑盈, 賈梓淇, 邴鐘興, 楊華夏, 楊延蓮, 胡志遠, 李單青, 梁乃新. 循環腫瘤細胞 PD-L1 表達在非小細胞肺癌免疫治療中的應用. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2021, 28(1): 110-115. doi: 10.7507/1007-4848.202003026 復制
肺癌為目前全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，肺癌的分類中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占 85%，晚期 NSCLC 患者的 5 年生存率不足 5%[1-2]。近年來，免疫檢查點抑制劑的出現顯著改善了晚期 NSCLC 患者的生存狀況，尤其是程序性死亡受體 1（programmed cell death 1，PD-1）及其配體（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）的抑制劑改變了晚期 NSCLC 患者的治療方案[3]。免疫治療顯示出持久的臨床反應，顯著提高了局部晚期和轉移性 NSCLC 的無進展生存期（progression-free survival，PFS）及總生存期（overall survival，OS）[4-7]。
盡管免疫治療顯著改善了晚期 NSCLC 患者的預后，但是只有約 20% 的 NSCLC 患者會對免疫檢查點抑制劑產生反應[8]。考慮到免疫治療中可能的不良反應以及經濟負擔，尋找可以準確預測免疫治療反應的生物標志物具有重大的臨床意義，這也是現階段 NSCLC 免疫治療中面臨的最大難題。通過免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）檢測腫瘤組織中 PD-L1 的表達可以在一定程度上預測腫瘤對免疫治療的反應，但其并非完美的預測標志物。目前有關 PD-L1 IHC 的爭議主要體現在以下 4 個方面：（1）臨床研究中發現，約 10% PD-L1 表達陰性的 NSCLC 患者仍能從免疫治療中獲益，組織中 PD-L1 表達與免疫治療的療效關系并不確定[9]。（2）腫瘤具有空間異質性，腫瘤內部、原發灶與轉移灶之間 PD-L1 的表達可能相當異質，因此單個位點的組織活檢不能很好地代表患者整體的腫瘤狀況[10-11]。（3）在疾病進程中不同時間節點腫瘤組織 PD-L1 表達并非固定不變，而是在動態變化中，具有時間異質性[12]。（4）PD-L1 IHC 目前缺乏規范化的檢測標準與檢測流程，不同的免疫治療藥物配套不同的 PD-L1 檢測方法。而不同檢測方法中采用的抗體及對 PD-L1 陽性的定義不同，從而給臨床應用帶來困難[13]。雖然進行多位點或者連續活檢可以部分解決上述問題，但是由于活檢的侵入性及可能造成腫瘤轉移等潛在風險，通常認為并不可行。因此臨床中迫切需要新的檢測方法能夠準確預測免疫治療療效，且能夠長期動態監測 PD-L1 的表達變化以更好地揭示腫瘤的生物學特征及監測治療反應。
相關研究表明分析循環腫瘤細胞（CTC）上 PD-L1 的表達（PD-L1 expression in circulating tumor cells，CTC-PD-L1）可能為選擇患者進行免疫檢查點抑制劑治療及長期動態監測提供一種可行的非侵入性手段，并有望揭示 NSCLC 在接受免疫治療后如何進化和產生耐藥性等關鍵問題。目前腫瘤轉移的“種子-土壤”學說被普遍接受，作為轉移驅動的前體，CTC保留了原發腫瘤細胞及轉移腫瘤細胞的特性[14]。因此 CTC-PD-L1 的表達檢測能夠更全面地反映原發灶及轉移灶的重要生物學特征，并能夠提供有關藥物敏感性、治療療效預測及預后判斷的重要補充信息[15]。本文總結了目前 NSCLC 免疫治療領域中有關 CTC-PD-L1 表達的相關研究，評估 CTC-PD-L1 表達預測免疫治療療效的潛在作用及其動態變化在評估治療反應中的應用，并探究 CTC-PD-L1 檢測的局限性及應用前景。
1 CTC 及 CTC-PD-L1概述
1869 年 Ashworth 在對 1 例腫瘤死亡患者尸檢時發現其外周血中存在形態及體積與原發腫瘤相似的細胞，首次提出 CTC 這一概念[16]。隨著研究的不斷深入，其概念被逐步擴展為：自發或因診療操作脫離原發灶或者轉移灶進入外周血液循環的腫瘤細胞[14]。CTC 檢測主要包括兩個技術環節，即細胞的分離富集和分析鑒定[17]。CTC 的成功分離鑒定才能進一步檢測 CTC-PD-L1 的表達，從而探究其在 NSCLC 免疫治療臨床實踐中的價值與意義。
2015 年 Mazel 等[18]首次在轉移性乳腺癌患者外周血 CTC 上檢測到 PD-L1 的表達，證實了 CTC 細胞膜上具有 PD-L1 蛋白的表達并且驗證了 CTC-PD-L1 檢測的可行性。隨后 Nicolazzo 等[19]在晚期 NSCLC 患者外周血 CTC 上檢測到 PD-L1 的表達，并發現 CTC-PD-L1 的動態表達與免疫治療療效相關聯。目前檢測 CTC-PD-L1 表達普遍采用的方法是利用熒光標記的 PD-L1 抗體與 CTC 細胞膜上的 PD-L1 蛋白相結合，通過在熒光顯微鏡下檢測熒光強度來判定 CTC-PD-L1 的表達。盡管不同研究中 CTC 分離鑒定技術及 PD-L1 抗體的類型存在差異，但是均提示檢測 CTC-PD-L1 的表達具有極強的可行性[19-24]。
2 CTC 在NSCLC免疫治療中的應用
多項研究表明，NSCLC 患者在接受放化療及靶向治療過程中，CTC 為預后不佳的獨立預測因素[25-27]。但是在免疫治療領域 CTC 能否進行有效的療效預測和預后評估有待進一步探究。
Guibert 等[20]檢測了 96 例化療后疾病進展準備接受 Nivolumab 治療的轉移性 NSCLC 患者外周血中 CTC 含量，分析結果發現基線時 CTC 含量高的患者預后不佳，而 PFS 超過 6 個月的患者基線 CTC 含量顯著降低。對疾病發生進展的 24 例患者再次檢測 CTC 時發現其平均值相較于免疫治療開始前顯著增高（52.5/7.5 mL vs. 30/7.5 mL，P=0.03），因此 CTC 含量的增加預示著免疫治療效果不佳，這在另一項類似研究中也得到證實[28]。Tamminga 等[29]的研究納入了 104 例接受免疫治療的 NSCLC 患者，在免疫治療前及免疫治療過程中兩次抽取外周血，發現未檢測出 CTC 的患者其 PFS 及 OS 均顯著優于檢測出 CTC 的患者。此外，通過對比前后兩次 CTC 的檢測結果發現 CTC 含量下降的患者更能從免疫治療中獲益，Alama 等[30]也觀察到此現象。
綜合以上研究結果，目前 CTC 被認為是 NSCLC 免疫治療效果不佳的獨立預測因素，在免疫治療過程中 CTC 含量的下降預示患者從免疫治療中獲益而 CTC 含量的增加則預示患者的預后不佳。
3 CTC-PD-L1 的表達檢測在 NSCLC 免疫治療中的應用
既往有研究探索了 CTC-PD-L1 檢測在手術及放化療等傳統治療中的價值與作用，這對于更好地理解 CTC-PD-L1 與免疫治療的相互作用關系具有重要意義。Adams 等[31]的研究結果表明放療可誘導 CTC-PD-L1 的表達增加，但并未發現 CTC-PD-L1 與預后之間的關聯。Wang 等[32]在接受放療或同步放化療的患者中同樣觀察到了 CTC-PD-L1 表達的增加，并且發現基線 CTC-PD-L1 陽性的患者預后不佳。對于接受化療的患者，有研究分別檢測化療前后 CTC-PD-L1 的表達發現其檢出率增加，CTC-PD-L1 被認為是化療預后不佳的獨立預測因素[33-35]。此外，由于肺靜脈相較于外周靜脈更靠近原發腫瘤，肺靜脈中 CTC 數量相對集中，因此從肺靜脈中抽血可以提高 CTC-PD-L1 的檢出率[36]。Dong 等[37]于術中抽取 114 例早期 NSCLC 患者的肺靜脈血檢測 CTC-PD-L1 的表達情況，發現 CTC-PD-L1 陽性的患者術后無病生存期（disease-free survival，DFS）更短，術后更早出現復發。
綜合以上研究，目前 CTC-PD-L1 被認為與 NSCLC 預后不佳相關，其通過與免疫系統相互作用形成免疫抑制性的腫瘤微環境，使得腫瘤逃避免疫系統的清除，具有更強的侵襲轉移能力從而導致患者預后不佳[38]。此外，放化療等傳統治療可誘導上調 CTC-PD-L1 的表達，放化療聯合免疫治療可能產生增敏作用，從而使更多患者從免疫治療中獲益。因此進一步探究 CTC-PD-L1 與免疫治療之間的相互作用關系對于免疫治療的臨床實踐具有重要的價值與意義。
目前國內外 NSCLC 免疫治療領域有關 CTC-PD-L1 的研究多聚焦于晚期患者，共同探究 CTC-PD-L1 的表達能否成為預示患者從免疫治療中獲益的有效生物標志物。此外，相較于傳統手術或者穿刺獲得腫瘤標本后行免疫組織化學檢測 PD-L1 表達，血液檢測相對無創，在疾病治療期間可以反復進行。因此通過抽取外周血檢測 CTC-PD-L1 表達可以作為液體活檢進行縱向對比分析，這對監測免疫治療反應及揭示腫瘤細胞如何對治療策略產生抗性具有重要作用。由于目前關于 CTC 分離富集、分析檢測及 CTC-PD-L1 的表達檢測流程尚未形成統一共識，因此需要對各個研究結果進行謹慎的分析與比較，國內外相關研究信息匯總見表1。
表1
CTC-PD-L1 的表達檢測在 NSCLC 免疫治療中的應用相關研究匯總
3.1 CTC-PD-L1 對于 NSCLC 免疫治療的療效預測
共計 4 項研究評估了免疫治療開始前外周血 CTC-PD-L1 表達水平對于免疫治療療效的預測作用。其中最大規模的臨床研究共納入 96 例患者，結果顯示治療前 CTC-PD-L1 水平與 PFS 及 OS 的差異均無統計學意義。該研究同時發現免疫治療開始前 PD-L1 表達陽性的 CTC 占總體 CTC 比值>1% 的患者中對免疫治療無應答的患者相較于 CTC-PD-L1 表達陰性的患者中無應答者（68% vs. 40%，P=0.04）占比更高[20]。另外 3 項研究[21-23]均表明治療前 CTC-PD-L1 水平與預后不相關。
由于以上均為小樣本臨床研究，因此應謹慎對待目前的結論，后續需要開展更大規模的臨床研究進行探究。最近，一項旨在評估在寡轉移 NSCLC 中 Durvalumab 和 Tremelimumab 雙重免疫治療聯合立體定向放療安全性的ⅠB 期臨床研究（NCT03275597）將 CTC-PD-L1 作為預測治療效果的探索性標志物，目前該研究正在招募患者。隨著更多相關研究的開展，CTC-PD-L1 的表達作為預測免疫治療療效的標記物的價值將被進一步明確，從而有望協助篩選出免疫治療潛在的獲益人群。
3.2 CTC-PD-L1 的動態變化在評估治療反應中的作用
由于腫瘤組織的難以獲取以及在免疫治療進程中 PD-L1 的動態變化，基于 IHC 學的腫瘤組織 PD-L1 表達檢測無法用于動態評估免疫治療進程中腫瘤的生物學特征。而基于液體活檢的 CTC-PD-L1 檢測可以彌補傳統檢測方法的不足，能夠提供更多有關腫瘤耐藥及療效評估的重要信息。
Janning 等[24]納入 11 例接受免疫治療的 NSCLC 患者，分別于治療前、治療開始 3～5 周期后及疾病發生進展時檢測外周血 CTC-PD-L1 的表達狀況，結果顯示所有對免疫治療產生應答的患者，其 PD-L1 陽性的 CTC 數目降低或者維持不變，而所有發生疾病進展的患者 PD-L1 陽性的 CTC 數目均上升且所有 CTC 上均能檢測到 PD-L1 的表達。因此 PD-L1 陽性的 CTC 數目的動態上升能夠成為預測 NSCLC 患者對于免疫治療產生抵抗的有效標志物。Nicolazzo 等[19]觀察到了類似的結果，其發現免疫治療 6 個月后所有外周血中能檢測到 CTC-PD-L1 表達的患者均發生了疾病進展，而未檢測到 CTC-PD-L1 表達的患者均對免疫治療產生應答。以上研究結果共同提示在免疫治療過程中，CTC-PD-L1 表達的動態變化能夠成為評估治療反應的有效標記物。
在 Checkmate017 試驗中，Nivolumab 組與 Docetaxel 組的生存曲線約在 6 個月時才開始出現分離，這在一定程度上能夠反映出免疫治療與傳統放化療作用機制的不同[9]。傳統放化療直接殺傷腫瘤細胞，而免疫治療需要進行一段時間后完成免疫系統的再度激活以清除腫瘤細胞。因此對免疫治療產生應答的患者 CTC-PD-L1 表達將會發生動態下降甚至消失，而 CTC-PD-L1 的表達持續上升預示著免疫治療的療效不佳。相關研究表明免疫治療過程中部分 CTC 上存在 PD-L1 及上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標志物的共表達，從而使得腫瘤細胞逃避免疫系統的清除，導致患者對于免疫治療的反應不佳[39-40]。
目前在 NSCLC 免疫治療過程中仍主要通過傳統的影像學檢查來評估及監測治療療效。由于目前影像學檢查無法將免疫細胞與腫瘤細胞區分開，因此無法判斷影像學上病灶的擴大是由于免疫治療起效后大量的免疫細胞浸潤所造成的“假進展”還是由于患者對于免疫治療無應答開始出現疾病進展，因此對于病情判斷存在滯后效應，不利于臨床決策的及時進行[41]。通過動態監測 CTC-PD-L1 的表達能夠幫助評估免疫治療反應。如果患者的影像學檢查提示病灶擴大，而其余各項檢查指標未見明顯異常，那么患者影像學的表現可能是免疫治療造成的“假進展”。而如果患者 CTC-PD-L1 表達顯著增加，雖然影像學檢查尚未提示疾病進展，臨床醫生此時需要謹慎評估患者治療反應狀況，及時判斷是否需要盡快更換治療方案。隨著免疫治療在 NSCLC 領域的廣泛開展，CTC-PD-L1 的表達檢測在評估免疫治療療效中必將發揮越來越重要的作用。
4 CTC-PD-L1 目前研究的局限性
盡管 CTC-PD-L1 的臨床研究取得了可喜的進展，但是目前仍處于研究的初級階段，有許多問題尚待解決，主要包括目前技術的局限性和臨床應用的局限性。只有通過不斷完善現有理論與技術，開展更多臨床研究，才能將 CTC-PD-L1 表達檢測與 NSCLC 免疫治療緊密結合起來，在療效評估、個體化治療、預后監測等方面發揮重要作用。
4.1 CTC-PD-L1 檢測技術的局限性
雖然新近開發出許多基于不同原理的 CTC 分離檢測技術，但是 CTC 檢出率仍偏低，檢出數目少，從而限制了其臨床應用價值。最近一項研究[42]將 EGFR/HER3 作為新的 CTC 檢測標志物與傳統 CellSearch 技術相結合，進一步提高了 CTC 的檢出效率。此外，即使目前 PD-L1 IHC 采用的 PD-L1 抗體均為 4 種食品藥品監督管理局（FDA）已批準的抗體，其不同抗體的檢測結果之間仍存在顯著差異。有研究[43-44]評估比較了不同檢測試劑盒、檢測平臺測定肺癌組織樣本 PD-L1 表達的準確性和可靠性差異，結果顯示：28-8、22C3 和 SP263 試劑盒的檢測結果一致性較好，而 SP142 檢測的 PD-L1 水平偏低。目前檢測 CTC-PD-L1 表達的抗體選擇尚無統一標準，因此我們應謹慎比較應用不同 PD-L1 抗體得到的檢測結果，盡快完成 CTC-PD-L1 檢測技術及流程的標準化。有研究[45]采用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase Chain reaction，RT-PCR）技術檢測 CTC 中 PD-L1 mRNA 的表達，并由此計算出 PD-L1 的陽性率，在一定程度上可減少不同抗體導致檢測結果的差異。
4.2 CTC-PD-L1 臨床應用的局限性
隨著免疫治療在 NSCLC 領域的廣泛開展，越來越多的患者有機會從免疫治療中獲益。值得注意的是，許多患者是在接受化療、放療、靶向等治療疾病發生進展后開始采用免疫治療，因此在評估 CTC-PD-L1 表達時需要充分考慮既往治療對于檢測結果的影響[31-32]。此外 CTC-PD-L1 檢測目前經濟成本較高，從獲取樣本到分析結果耗時較長，也在一定程度上阻礙了其臨床應用。目前 CTC-PD-L1 檢測及其應用尚未經過大規模多中心的臨床試驗驗證，因此 CTC-PD-L1 檢測尚不能完全代替腫瘤組織中 PD-L1 的表達檢測。
5 總結與展望
CTC-PD-L1 表達檢測在預測 NSCLC 免疫治療療效尤其是在免疫治療過程中動態監測疾病變化及評估治療反應具有廣闊的應用前景。CTC-PD-L1 檢測技術的發展能夠幫助我們更全面地理解 NSCLC 的免疫治療。目前 CTC-PD-L1 的相關研究仍處于初級階段，諸多問題還需要更深入的研究及大規模的臨床試驗來回答。但是作為一種簡便可行的液體活檢技術，其在即將到來的 NSCLC 免疫治療時代將發揮更加重要的作用。
利益沖突：無。
作者貢獻：王亞東、楊笑盈、賈梓淇和邴鐘興負責或參與本文的論文設計與初稿撰寫；楊華夏、楊延蓮、胡志遠、李單青和梁乃新對文章的相關內容進行審閱和修改。
肺癌為目前全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，肺癌的分類中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占 85%，晚期 NSCLC 患者的 5 年生存率不足 5%[1-2]。近年來，免疫檢查點抑制劑的出現顯著改善了晚期 NSCLC 患者的生存狀況，尤其是程序性死亡受體 1（programmed cell death 1，PD-1）及其配體（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）的抑制劑改變了晚期 NSCLC 患者的治療方案[3]。免疫治療顯示出持久的臨床反應，顯著提高了局部晚期和轉移性 NSCLC 的無進展生存期（progression-free survival，PFS）及總生存期（overall survival，OS）[4-7]。
盡管免疫治療顯著改善了晚期 NSCLC 患者的預后，但是只有約 20% 的 NSCLC 患者會對免疫檢查點抑制劑產生反應[8]。考慮到免疫治療中可能的不良反應以及經濟負擔，尋找可以準確預測免疫治療反應的生物標志物具有重大的臨床意義，這也是現階段 NSCLC 免疫治療中面臨的最大難題。通過免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）檢測腫瘤組織中 PD-L1 的表達可以在一定程度上預測腫瘤對免疫治療的反應，但其并非完美的預測標志物。目前有關 PD-L1 IHC 的爭議主要體現在以下 4 個方面：（1）臨床研究中發現，約 10% PD-L1 表達陰性的 NSCLC 患者仍能從免疫治療中獲益，組織中 PD-L1 表達與免疫治療的療效關系并不確定[9]。（2）腫瘤具有空間異質性，腫瘤內部、原發灶與轉移灶之間 PD-L1 的表達可能相當異質，因此單個位點的組織活檢不能很好地代表患者整體的腫瘤狀況[10-11]。（3）在疾病進程中不同時間節點腫瘤組織 PD-L1 表達并非固定不變，而是在動態變化中，具有時間異質性[12]。（4）PD-L1 IHC 目前缺乏規范化的檢測標準與檢測流程，不同的免疫治療藥物配套不同的 PD-L1 檢測方法。而不同檢測方法中采用的抗體及對 PD-L1 陽性的定義不同，從而給臨床應用帶來困難[13]。雖然進行多位點或者連續活檢可以部分解決上述問題，但是由于活檢的侵入性及可能造成腫瘤轉移等潛在風險，通常認為并不可行。因此臨床中迫切需要新的檢測方法能夠準確預測免疫治療療效，且能夠長期動態監測 PD-L1 的表達變化以更好地揭示腫瘤的生物學特征及監測治療反應。
相關研究表明分析循環腫瘤細胞（CTC）上 PD-L1 的表達（PD-L1 expression in circulating tumor cells，CTC-PD-L1）可能為選擇患者進行免疫檢查點抑制劑治療及長期動態監測提供一種可行的非侵入性手段，并有望揭示 NSCLC 在接受免疫治療后如何進化和產生耐藥性等關鍵問題。目前腫瘤轉移的“種子-土壤”學說被普遍接受，作為轉移驅動的前體，CTC保留了原發腫瘤細胞及轉移腫瘤細胞的特性[14]。因此 CTC-PD-L1 的表達檢測能夠更全面地反映原發灶及轉移灶的重要生物學特征，并能夠提供有關藥物敏感性、治療療效預測及預后判斷的重要補充信息[15]。本文總結了目前 NSCLC 免疫治療領域中有關 CTC-PD-L1 表達的相關研究，評估 CTC-PD-L1 表達預測免疫治療療效的潛在作用及其動態變化在評估治療反應中的應用，并探究 CTC-PD-L1 檢測的局限性及應用前景。
1 CTC 及 CTC-PD-L1概述
1869 年 Ashworth 在對 1 例腫瘤死亡患者尸檢時發現其外周血中存在形態及體積與原發腫瘤相似的細胞，首次提出 CTC 這一概念[16]。隨著研究的不斷深入，其概念被逐步擴展為：自發或因診療操作脫離原發灶或者轉移灶進入外周血液循環的腫瘤細胞[14]。CTC 檢測主要包括兩個技術環節，即細胞的分離富集和分析鑒定[17]。CTC 的成功分離鑒定才能進一步檢測 CTC-PD-L1 的表達，從而探究其在 NSCLC 免疫治療臨床實踐中的價值與意義。
2015 年 Mazel 等[18]首次在轉移性乳腺癌患者外周血 CTC 上檢測到 PD-L1 的表達，證實了 CTC 細胞膜上具有 PD-L1 蛋白的表達并且驗證了 CTC-PD-L1 檢測的可行性。隨后 Nicolazzo 等[19]在晚期 NSCLC 患者外周血 CTC 上檢測到 PD-L1 的表達，并發現 CTC-PD-L1 的動態表達與免疫治療療效相關聯。目前檢測 CTC-PD-L1 表達普遍采用的方法是利用熒光標記的 PD-L1 抗體與 CTC 細胞膜上的 PD-L1 蛋白相結合，通過在熒光顯微鏡下檢測熒光強度來判定 CTC-PD-L1 的表達。盡管不同研究中 CTC 分離鑒定技術及 PD-L1 抗體的類型存在差異，但是均提示檢測 CTC-PD-L1 的表達具有極強的可行性[19-24]。
2 CTC 在NSCLC免疫治療中的應用
多項研究表明，NSCLC 患者在接受放化療及靶向治療過程中，CTC 為預后不佳的獨立預測因素[25-27]。但是在免疫治療領域 CTC 能否進行有效的療效預測和預后評估有待進一步探究。
Guibert 等[20]檢測了 96 例化療后疾病進展準備接受 Nivolumab 治療的轉移性 NSCLC 患者外周血中 CTC 含量，分析結果發現基線時 CTC 含量高的患者預后不佳，而 PFS 超過 6 個月的患者基線 CTC 含量顯著降低。對疾病發生進展的 24 例患者再次檢測 CTC 時發現其平均值相較于免疫治療開始前顯著增高（52.5/7.5 mL vs. 30/7.5 mL，P=0.03），因此 CTC 含量的增加預示著免疫治療效果不佳，這在另一項類似研究中也得到證實[28]。Tamminga 等[29]的研究納入了 104 例接受免疫治療的 NSCLC 患者，在免疫治療前及免疫治療過程中兩次抽取外周血，發現未檢測出 CTC 的患者其 PFS 及 OS 均顯著優于檢測出 CTC 的患者。此外，通過對比前后兩次 CTC 的檢測結果發現 CTC 含量下降的患者更能從免疫治療中獲益，Alama 等[30]也觀察到此現象。
綜合以上研究結果，目前 CTC 被認為是 NSCLC 免疫治療效果不佳的獨立預測因素，在免疫治療過程中 CTC 含量的下降預示患者從免疫治療中獲益而 CTC 含量的增加則預示患者的預后不佳。
3 CTC-PD-L1 的表達檢測在 NSCLC 免疫治療中的應用
既往有研究探索了 CTC-PD-L1 檢測在手術及放化療等傳統治療中的價值與作用，這對于更好地理解 CTC-PD-L1 與免疫治療的相互作用關系具有重要意義。Adams 等[31]的研究結果表明放療可誘導 CTC-PD-L1 的表達增加，但并未發現 CTC-PD-L1 與預后之間的關聯。Wang 等[32]在接受放療或同步放化療的患者中同樣觀察到了 CTC-PD-L1 表達的增加，并且發現基線 CTC-PD-L1 陽性的患者預后不佳。對于接受化療的患者，有研究分別檢測化療前后 CTC-PD-L1 的表達發現其檢出率增加，CTC-PD-L1 被認為是化療預后不佳的獨立預測因素[33-35]。此外，由于肺靜脈相較于外周靜脈更靠近原發腫瘤，肺靜脈中 CTC 數量相對集中，因此從肺靜脈中抽血可以提高 CTC-PD-L1 的檢出率[36]。Dong 等[37]于術中抽取 114 例早期 NSCLC 患者的肺靜脈血檢測 CTC-PD-L1 的表達情況，發現 CTC-PD-L1 陽性的患者術后無病生存期（disease-free survival，DFS）更短，術后更早出現復發。
綜合以上研究，目前 CTC-PD-L1 被認為與 NSCLC 預后不佳相關，其通過與免疫系統相互作用形成免疫抑制性的腫瘤微環境，使得腫瘤逃避免疫系統的清除，具有更強的侵襲轉移能力從而導致患者預后不佳[38]。此外，放化療等傳統治療可誘導上調 CTC-PD-L1 的表達，放化療聯合免疫治療可能產生增敏作用，從而使更多患者從免疫治療中獲益。因此進一步探究 CTC-PD-L1 與免疫治療之間的相互作用關系對于免疫治療的臨床實踐具有重要的價值與意義。
目前國內外 NSCLC 免疫治療領域有關 CTC-PD-L1 的研究多聚焦于晚期患者，共同探究 CTC-PD-L1 的表達能否成為預示患者從免疫治療中獲益的有效生物標志物。此外，相較于傳統手術或者穿刺獲得腫瘤標本后行免疫組織化學檢測 PD-L1 表達，血液檢測相對無創，在疾病治療期間可以反復進行。因此通過抽取外周血檢測 CTC-PD-L1 表達可以作為液體活檢進行縱向對比分析，這對監測免疫治療反應及揭示腫瘤細胞如何對治療策略產生抗性具有重要作用。由于目前關于 CTC 分離富集、分析檢測及 CTC-PD-L1 的表達檢測流程尚未形成統一共識，因此需要對各個研究結果進行謹慎的分析與比較，國內外相關研究信息匯總見表1。
表1
CTC-PD-L1 的表達檢測在 NSCLC 免疫治療中的應用相關研究匯總
3.1 CTC-PD-L1 對于 NSCLC 免疫治療的療效預測
共計 4 項研究評估了免疫治療開始前外周血 CTC-PD-L1 表達水平對于免疫治療療效的預測作用。其中最大規模的臨床研究共納入 96 例患者，結果顯示治療前 CTC-PD-L1 水平與 PFS 及 OS 的差異均無統計學意義。該研究同時發現免疫治療開始前 PD-L1 表達陽性的 CTC 占總體 CTC 比值>1% 的患者中對免疫治療無應答的患者相較于 CTC-PD-L1 表達陰性的患者中無應答者（68% vs. 40%，P=0.04）占比更高[20]。另外 3 項研究[21-23]均表明治療前 CTC-PD-L1 水平與預后不相關。
由于以上均為小樣本臨床研究，因此應謹慎對待目前的結論，后續需要開展更大規模的臨床研究進行探究。最近，一項旨在評估在寡轉移 NSCLC 中 Durvalumab 和 Tremelimumab 雙重免疫治療聯合立體定向放療安全性的ⅠB 期臨床研究（NCT03275597）將 CTC-PD-L1 作為預測治療效果的探索性標志物，目前該研究正在招募患者。隨著更多相關研究的開展，CTC-PD-L1 的表達作為預測免疫治療療效的標記物的價值將被進一步明確，從而有望協助篩選出免疫治療潛在的獲益人群。
3.2 CTC-PD-L1 的動態變化在評估治療反應中的作用
由于腫瘤組織的難以獲取以及在免疫治療進程中 PD-L1 的動態變化，基于 IHC 學的腫瘤組織 PD-L1 表達檢測無法用于動態評估免疫治療進程中腫瘤的生物學特征。而基于液體活檢的 CTC-PD-L1 檢測可以彌補傳統檢測方法的不足，能夠提供更多有關腫瘤耐藥及療效評估的重要信息。
Janning 等[24]納入 11 例接受免疫治療的 NSCLC 患者，分別于治療前、治療開始 3～5 周期后及疾病發生進展時檢測外周血 CTC-PD-L1 的表達狀況，結果顯示所有對免疫治療產生應答的患者，其 PD-L1 陽性的 CTC 數目降低或者維持不變，而所有發生疾病進展的患者 PD-L1 陽性的 CTC 數目均上升且所有 CTC 上均能檢測到 PD-L1 的表達。因此 PD-L1 陽性的 CTC 數目的動態上升能夠成為預測 NSCLC 患者對于免疫治療產生抵抗的有效標志物。Nicolazzo 等[19]觀察到了類似的結果，其發現免疫治療 6 個月后所有外周血中能檢測到 CTC-PD-L1 表達的患者均發生了疾病進展，而未檢測到 CTC-PD-L1 表達的患者均對免疫治療產生應答。以上研究結果共同提示在免疫治療過程中，CTC-PD-L1 表達的動態變化能夠成為評估治療反應的有效標記物。
在 Checkmate017 試驗中，Nivolumab 組與 Docetaxel 組的生存曲線約在 6 個月時才開始出現分離，這在一定程度上能夠反映出免疫治療與傳統放化療作用機制的不同[9]。傳統放化療直接殺傷腫瘤細胞，而免疫治療需要進行一段時間后完成免疫系統的再度激活以清除腫瘤細胞。因此對免疫治療產生應答的患者 CTC-PD-L1 表達將會發生動態下降甚至消失，而 CTC-PD-L1 的表達持續上升預示著免疫治療的療效不佳。相關研究表明免疫治療過程中部分 CTC 上存在 PD-L1 及上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標志物的共表達，從而使得腫瘤細胞逃避免疫系統的清除，導致患者對于免疫治療的反應不佳[39-40]。
目前在 NSCLC 免疫治療過程中仍主要通過傳統的影像學檢查來評估及監測治療療效。由于目前影像學檢查無法將免疫細胞與腫瘤細胞區分開，因此無法判斷影像學上病灶的擴大是由于免疫治療起效后大量的免疫細胞浸潤所造成的“假進展”還是由于患者對于免疫治療無應答開始出現疾病進展，因此對于病情判斷存在滯后效應，不利于臨床決策的及時進行[41]。通過動態監測 CTC-PD-L1 的表達能夠幫助評估免疫治療反應。如果患者的影像學檢查提示病灶擴大，而其余各項檢查指標未見明顯異常，那么患者影像學的表現可能是免疫治療造成的“假進展”。而如果患者 CTC-PD-L1 表達顯著增加，雖然影像學檢查尚未提示疾病進展，臨床醫生此時需要謹慎評估患者治療反應狀況，及時判斷是否需要盡快更換治療方案。隨著免疫治療在 NSCLC 領域的廣泛開展，CTC-PD-L1 的表達檢測在評估免疫治療療效中必將發揮越來越重要的作用。
4 CTC-PD-L1 目前研究的局限性
盡管 CTC-PD-L1 的臨床研究取得了可喜的進展，但是目前仍處于研究的初級階段，有許多問題尚待解決，主要包括目前技術的局限性和臨床應用的局限性。只有通過不斷完善現有理論與技術，開展更多臨床研究，才能將 CTC-PD-L1 表達檢測與 NSCLC 免疫治療緊密結合起來，在療效評估、個體化治療、預后監測等方面發揮重要作用。
4.1 CTC-PD-L1 檢測技術的局限性
雖然新近開發出許多基于不同原理的 CTC 分離檢測技術，但是 CTC 檢出率仍偏低，檢出數目少，從而限制了其臨床應用價值。最近一項研究[42]將 EGFR/HER3 作為新的 CTC 檢測標志物與傳統 CellSearch 技術相結合，進一步提高了 CTC 的檢出效率。此外，即使目前 PD-L1 IHC 采用的 PD-L1 抗體均為 4 種食品藥品監督管理局（FDA）已批準的抗體，其不同抗體的檢測結果之間仍存在顯著差異。有研究[43-44]評估比較了不同檢測試劑盒、檢測平臺測定肺癌組織樣本 PD-L1 表達的準確性和可靠性差異，結果顯示：28-8、22C3 和 SP263 試劑盒的檢測結果一致性較好，而 SP142 檢測的 PD-L1 水平偏低。目前檢測 CTC-PD-L1 表達的抗體選擇尚無統一標準，因此我們應謹慎比較應用不同 PD-L1 抗體得到的檢測結果，盡快完成 CTC-PD-L1 檢測技術及流程的標準化。有研究[45]采用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase Chain reaction，RT-PCR）技術檢測 CTC 中 PD-L1 mRNA 的表達，并由此計算出 PD-L1 的陽性率，在一定程度上可減少不同抗體導致檢測結果的差異。
4.2 CTC-PD-L1 臨床應用的局限性
隨著免疫治療在 NSCLC 領域的廣泛開展，越來越多的患者有機會從免疫治療中獲益。值得注意的是，許多患者是在接受化療、放療、靶向等治療疾病發生進展后開始采用免疫治療，因此在評估 CTC-PD-L1 表達時需要充分考慮既往治療對于檢測結果的影響[31-32]。此外 CTC-PD-L1 檢測目前經濟成本較高，從獲取樣本到分析結果耗時較長，也在一定程度上阻礙了其臨床應用。目前 CTC-PD-L1 檢測及其應用尚未經過大規模多中心的臨床試驗驗證，因此 CTC-PD-L1 檢測尚不能完全代替腫瘤組織中 PD-L1 的表達檢測。
5 總結與展望
CTC-PD-L1 表達檢測在預測 NSCLC 免疫治療療效尤其是在免疫治療過程中動態監測疾病變化及評估治療反應具有廣闊的應用前景。CTC-PD-L1 檢測技術的發展能夠幫助我們更全面地理解 NSCLC 的免疫治療。目前 CTC-PD-L1 的相關研究仍處于初級階段，諸多問題還需要更深入的研究及大規模的臨床試驗來回答。但是作為一種簡便可行的液體活檢技術，其在即將到來的 NSCLC 免疫治療時代將發揮更加重要的作用。
利益沖突：無。
作者貢獻：王亞東、楊笑盈、賈梓淇和邴鐘興負責或參與本文的論文設計與初稿撰寫；楊華夏、楊延蓮、胡志遠、李單青和梁乃新對文章的相關內容進行審閱和修改。
