引用本文： 畢繼旺, 劉冰, 馬媛媛, 楊躍. 組蛋白去乙酰化酶 9 表達水平與肺鱗癌不良預后相關性研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2020, 27(6): 649-656. doi: 10.7507/1007-4848.202001069 復制
在全球范圍內，肺癌是目前發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1-2]。最新數據顯示，我國 2015 年肺癌新發病例 78.7 萬例，死亡病例 63.1 萬例，位居惡性腫瘤之首[3]。根據組織學類型，肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，后者占全部肺癌的 85% 左右。肺鱗狀細胞癌（鱗癌）是非小細胞肺癌的主要類型之一，約占全部肺癌患者的 25%[4]。早期肺鱗癌以手術治療為主，輔以放化療；對于晚期肺鱗癌，則以放化療為主。靶向藥物的出現極大改善了肺腺癌的預后，但由于基因突變譜不同于肺腺癌，肺鱗癌患者中表皮生長因子受體（EGFR）基因突變和中間變性淋巴瘤微酶（ALK）基因融合等并不常見，這導致肺鱗癌缺乏有效的治療靶點[5]。近年來，針對免疫檢查點程序性死亡受體 1（PD-1）/PD-L1等的單克隆抗體的應用顯著改善了部分晚期肺鱗癌的預后，但總體有效率僅約為 20%[6-7]。因此，尋找影響肺鱗癌預后的分子，并據此開發新的治療靶點對于提高肺鱗癌治療效果十分重要。
為尋找肺鱗癌新的有效治療靶點，本實驗室前期通過對 11 對 LUSC 原發腫瘤及對應患者來源的異種移植模型（patients derived xenografts，PDXs）進行全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）和全外顯子組測序（whole exosome sequencing，WES）[8]，并結合 TCGA（The Cancer Genome Atlas）數據庫和 COSMIC（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer）數據庫等，篩選出 56 個攜帶高頻單堿基變異（single nucleotide variations，SNVs）或拷貝數變異（copy number variations，CNVs）的基因，并進一步采用靶向測序在 80 例肺鱗癌標本內檢測其突變情況，結果顯示組蛋白去乙酰化酶 9（HDAC9）基因在肺鱗癌內呈高頻擴增。
表觀遺傳異常改變是腫瘤的一大特征[9]，而乙酰化修飾是一種重要的表觀遺傳調控方式。組蛋白乙酰化酶（HATs）和HDACs 共同調節組蛋白的乙酰化修飾，其中 HDACs 通過與其它分子形成復合物催化移除組蛋白 N 末端賴氨酸殘基上的乙酰基團，促使組蛋白與 DNA 結合，從而發揮轉錄抑制作用。文獻[10]報道 HDACs 可抑制抑癌基因的表達或調節促癌信號通路中關鍵分子的表達而促進腫瘤發生。HDAC9 是Ⅱ型 HDAC 分子，與多種惡性腫瘤的增殖轉移相關[11-14]，但 HDAC9 與肺鱗癌的關系尚未明確。本研究旨在通過檢測 HDAC9 在肺鱗癌組織中的表達水平，分析其與肺鱗癌臨床病理特征及預后的相關性，并探究其對肺鱗癌細胞增殖的影響，為將來進一步開發治療靶點打下基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料與組織標本
收集 2010 年 7 月至 2014 年 4 月期間于北京大學腫瘤醫院胸外二科進行手術切除的 129 例肺鱗癌患者組織標本及其臨床資料。入選標準：（1）術前未接受任何治療；（2）術后經過組織病理診斷屬于肺鱗癌；（3）不合并身體其它部位的惡性腫瘤且無其它惡性腫瘤史。排除標準：除單純肺鱗癌以外的其它類型，如腺鱗癌等各種混合癌均不納入。本組患者男 118 例、女 11 例，中位年齡 61（37～79）歲；腫瘤分化程度為高中分化 58 例，低分化 71 例；腫瘤大小<3 cm 37 例，≥3 cm 92 例；淋巴結陽性 34 例，淋巴結陰性 95 例；胸膜侵犯 22 例。59 例患者行術后輔助治療（化療 54 例，放療 3 例，同步放化療 2 例）。按照國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）于 2009 年頒布的《肺癌 TNM 分期標準（第 7 版）》對患者進行分期[15]。
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學染色
129 例肺鱗癌組織標本均由北京大學腫瘤醫院病理科常規固定、石蠟包埋、切片。5 μm 厚的石蠟病理切片，65 ℃ 烤片 60 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，經檸檬酸鈉抗原修復液（pH 6.0）（中杉金橋 ZLI-9064）進行高壓熱修復 5 min，3% H2O2 室溫孵育 10 min 滅活內源性過氧化物酶，山羊血清（中杉金橋 ZLI-9022）室溫濕盒內封閉 60 min，HDAC9 一抗（Abcam 兔抗人重組單克隆抗體 ab109446 1∶1 000）4℃ 濕盒內過夜孵育，辣根過氧化物酶標記的二抗（中杉金橋 PV-6000）室溫濕盒內孵育 45 min，DAB 顯色液（中杉金橋 ZLI-9018）顯色，蘇木素復染 5 min。
1.2.2 免疫組織化學結果判讀
每張切片隨機選取 10 個高倍（400×）視野，每個視野計數 100 個細胞，根據細胞染色強度和陽性細胞比例評判實驗結果。所有染色結果均由兩位病理醫生分別在沒有事先了解患者信息的情況下給出分數，然后在討論后達成共識。對 HDAC9 的著色強度和陽性細胞百分比進行評分。根據著色強度分級為 0（無染色）、1（輕度染色）、2（中度染色）、3（強染色）。根據著色腫瘤細胞的百分比，評分如下：0（<25%）、1（25%～49%）、2（50%～74%）、3（≥75%）。將兩得分相乘得到最終評分，高表達（≥6）或低表達（<6）。
1.2.3 細胞培養
MEM 培養基、胎牛血清、Sodium Pyruvate、MEM NEAA、胰酶均采購自美國 GIBCO 公司。肺鱗癌細胞系 EBC-1 采用 MEM 培養基（含 10% 胎牛血清，10% Sodium Pyruvate，10% MEM NEAA，1% 青鏈霉素雙抗）于 37℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養。當細胞進入對數生長期（細胞密度 80% 左右）時，用胰酶消化貼壁細胞，離心后用新鮮培養基重懸，進行后續傳代或鋪板轉染實驗。
1.2.4 CRISPR/dCas9 轉錄激活系統及質粒構建
CRISPR/dCas9 轉錄激活系統［lentiSAM v2（Puro）& lentiMPH v2（Neo）］由 Adam Karpf 實驗室通過非營利性組織 Addgene 平臺贈與（Addgene plasmid # 92062；
1.2.5 細胞轉染
Lipo3000 轉染試劑盒購自 Invitrogen 公司。轉染前 1 d，將細胞鋪于 6 孔板中，鋪板密度為 50% 左右。鋪板后第 2 d，按照 Lipo3000 轉染試劑盒說明書進行細胞轉染。細胞轉染 24 h 后，收集細胞進行后續細胞實驗；細胞轉染 48 h 后，利用實時熒光定量 PCR（real-time fluorogentic quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和蛋白質免疫印跡（Western Blotting，WB）實驗對轉染效率進行驗證。
1.2.6 實時熒光定量 PCR
收集轉染 48 h 后的細胞，按照 Trizol（Invitrogen）法提取細胞總 RNA，并按 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒（#AE301-02，Transgene Biotech）說明書用 Random Primer 對 2 μg 總 RNA 進行反轉錄合成 cDNA。按照 GoTaq qPCR Master Mix 試劑盒（#A6001，Promega）說明書進行 PCR 反應，PCR 反應條件為 95℃ 預變性 5 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，共 45 個循環；融解曲線反應條件為 95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s。以 β-ACTIN 為內參。用 2-ΔΔCt 法計算相對表達量。β-ACTIN、HDAC9 的引物序列如下：β-ACTIN 引物序列 F: TTAGTTGCGTTACACCCTTT，R: ACCTTCACCGTTCCAGTTT；HDAC9 引物序列 F: TGATGACATTGGCTGATGG，R: CTGCTTAGAATTTTTAAGAGAACTT。實驗至少重復 3 次。
1.2.7 蛋白質免疫印跡實驗
收集轉染 48 h 后的細胞，加入 RIPA（strong）蛋白裂解液（含 Cocktail 蛋白酶抑制劑）裂解細胞，提取細胞總蛋白，利用 BCA 法測定蛋白濃度。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，將等量 30 μg 變性后樣品經 8% 的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，而后將膠內蛋白電轉至硝酸纖維素膜上。5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h，一抗［HDAC9（Abcam ab109446）1∶10 000，GAPDH（CST #97166）1∶10 000］4℃ 孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜后相應二抗（1∶10 000）室溫孵育 1 h，TBST 洗膜后進行化學發光顯色。實驗至少重復 3 次。
1.2.8 CCK8 細胞增殖實驗
CCK8 細胞增殖與毒性檢測試劑盒購自日本 Dojindo 公司。收集轉染 24 h 后的細胞，每孔 5 000 個細胞均勻接種于 96 孔板中，體積 100 μL，每組設置 3 個復孔，5 個觀察時間點，分別于 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h 加入 CCK8 試劑后 37℃ 培養箱孵育 2 h，后于酶標儀上測定 450 nm 的光密度值。0 h 孔在接種細胞后直接加入 10 μL CCK8 試劑孵育 2 h 后測光密度值，其它孔在加入 CCK8 試劑孵育前更換新鮮培養基 100 μL，再加入 10 μL CCK8 試劑孵育 2 h 后測光密度值。根據各時間點與 0 h 平均光密度值的差值繪制增殖曲線。實驗至少重復 3 次。
1.2.9 克隆形成實驗
收集轉染 24 h 后的細胞，每孔 1 000 個細胞均勻接種于 6 孔板，培養基 2 mL，每組設置 3 個復孔，37℃ 培養箱內培養 9 d。棄去培養基，磷酸鹽緩沖液洗 1 次，4% 多聚甲醛室溫固定 10 min，0.1% 結晶紫水溶液室溫染色 10 min，去離子水洗去多余染液，室溫干燥后拍照。
1.3 統計學分析
采用 IBM SPSS 24.0（Chicago，USA）軟件進行統計學分析。分類資料采用 χ2 檢驗，采用 Kaplan-Meier 法進行生存分析并采用 log-rank 檢驗方法進行顯著性檢驗，檢驗水準 α=0.05。采用單因素和多因素 Cox 比例風險回歸模型分析影響患者總生存期（overall survival，OS）的獨立預測因子，多因素 Cox 比例風險回歸模型納入的變量為單因素 Cox 分析中 P<0.100 的變量。
1.4 倫理審查
本研究獲得北京大學腫瘤醫院醫學倫理委員會批準（批準號：2018KT43）。所有患者術前均簽署知情同意書。
2 結果
2.1 HDAC9 蛋白在肺鱗癌組織中的表達及其與臨床病理特征的相關性
HDAC9 蛋白于細胞核中表達，陽性染色細胞排列呈巢狀，周圍被結締組織分割（圖 1）。在全部染色 129 例肺鱗癌患者中，39 例（30.2%）呈低表達，90 例（69.8%）呈高表達。采用 χ2 檢驗分析 129 例肺鱗癌組織中 HDAC9 表達水平與患者的臨床病理特征之間的相關性，發現 HDAC9 表達水平與腫瘤分化程度（P=0.035）、腫瘤大小（P=0.041）、淋巴結轉移情況（P=0.013）相關，而與年齡、性別、吸煙史、脈管癌栓、輔助治療情況無明確相關性（表 1）。
圖1
HDAC9 免疫組化染色結果示意圖（×100 倍）
a：無染色；b：輕度染色；c：中度染色；d：強染色
表1
HDAC9 在 129 例肺鱗癌患者中的表達情況及其與其他臨床病理特征的關聯［例/例（%）］
2.2 HDAC9 表達水平與肺鱗癌患者總生存的 Kaplan-Meier 生存分析
在線基因表達分析工具 GEPIA[16]（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）（
圖2
HDAC9 表達水平與肺鱗癌患者總生存期的 Kaplan-Meier 生存分析曲線
a：HDAC9 在轉錄水平的 Kaplan-Meier 生存分析曲線；b：HDAC9 在蛋白水平的 Kaplan-Meier 生存分析曲線
2.3 肺鱗癌患者預后的單因素和多因素分析
采用 Cox 比例風險回歸模型分析肺鱗癌預后的影響因素，單因素分析發現脈管癌栓（P=0.006）、腫瘤分化程度（P=0.005）、腫瘤大小（P=0.027）、淋巴結轉移情況（P=0.036）及 HDAC9 表達水平（P=0.032）是影響患者預后的因素；多因素分析顯示，腫瘤分化程度（P=0.003）、腫瘤大小（P=0.003）、淋巴結轉移情況（P=0.002）及 HDAC9 表達水平（P=0.023）是患者預后的獨立預測因子（表 2）。
表2
肺鱗癌患者總生存單因素和多因素 Cox 比例風險回歸模型分析
2.4 轉錄激活 HDAC9 促進肺鱗癌細胞系 EBC-1 增殖
為進一步探究 HDAC9 分子對肺鱗癌增殖的影響，應用 CRISPR/dCas9 轉錄激活系統激活肺鱗癌細胞系 EBC-1 內 HDAC9 基因的轉錄并觀察細胞增殖表型的改變。首先，在 EBC-1 細胞中分別轉染插入 sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3 的 CRISPR/dCas9 轉錄激活系統以挑選最佳 sgRNA，利用 qPCR 法在 mRNA 水平檢測 HDAC9 基因轉錄激活效率（圖 3a），其中 sgRNA2 使 HDAC9 轉錄水平上調倍數最高。CCK8 細胞增殖曲線顯示 HDAC9 轉錄激活組較陰性對照組生長能力提高，組間差異有統計學意義（圖 3b，F=52.7，P=0.002）。WB 結果顯示轉錄激活 HDAC9 基因后，HDAC9 蛋白表達水平上調（圖 3c）。克隆形成實驗結果顯示，轉錄激活 HDAC9 增強 EBC-1 細胞的集落形成能力（圖 3d）。
圖3
轉錄激活 HDAC9 促進肺鱗癌細胞系 EBC-1 增殖
a：靶向 HDAC9 啟動子區三個 sgRNAs 的轉錄激活效率；b：CCK8 細胞增殖曲線；c：轉錄激活 HDAC9 后蛋白水平改變；d：克隆形成實驗結果圖；NC：非靶向對照組；AC：靶向 HDAC9 轉錄激活組；***與 NC 組比較，
3 討論
雖然同屬非小細胞肺癌，但肺鱗癌與肺腺癌基因突變譜不同。肺腺癌的高頻突變，如 EGFR 突變、ALK 基因融合突變等在肺鱗癌內并不常見。尋找影響肺鱗癌發生發展及患者預后的相關基因對于評估患者預后、指導臨床治療、開發治療靶點都十分重要。據此，本實驗室通過前期測序發現 HDAC9 基因在肺鱗癌中呈高頻擴增，并在本實驗中探究其在肺鱗癌中發揮的作用。
作為表觀遺傳修飾的重要方式，組蛋白翻譯后修飾參與基因轉錄調控、染色體重塑等過程，在腫瘤的發生發展中扮演重要角色[10]。組蛋白乙酰化修飾是一種研究較為成熟的組蛋白翻譯后修飾方式，由 HATs 和 HDACs 共同調節。HDACs 通過催化移除組蛋白 N 末端賴氨酸殘基上的乙酰基團，促使組蛋白與 DNA 結合，從而發揮轉錄抑制作用。基于與酵母菌同源序列的比對，可將 18 種 HDACs 分為 4 型，Ⅰ型為 Rpd3 樣酶，包括 HDAC1、2、3、8；Ⅱ型為 Had-1 樣酶，可細分為兩個亞型Ⅱa（HDAC4、5、6、7、9）和Ⅱb（HDAC6、10）；Ⅲ型為 Sir2 樣酶，包括 7 種 sirtuins，為 NAD 依賴蛋白的去乙酰化酶或 ADP 核糖基化酶；Ⅳ型僅包括 HDAC11[17]。多項研究表明，HDACs 家族分子的基因突變或調節異常參與細胞周期、細胞凋亡、細胞自噬、血管生成、上皮向間質轉化等生物學過程，促進多種實體腫瘤和血液腫瘤的發生發展，且多數情況下，HDACs 的高表達水平與疾病晚期和患者預后差相關[10]。
HDAC9 作為 HDACs 家族Ⅱ型分子的一員，已被報道與多種惡性腫瘤密切相關。Xiong 等[11]發現 HDAC9 在胃癌中高表達，敲低 HDAC9 可抑制胃癌細胞增殖并增加其對順鉑的敏感性。Salgado 等[12]發現三陰性乳腺癌細胞系中 HDAC9 的表達水平顯著高于非三陰性乳腺癌細胞系，且其蛋白表達與 miR-206 表達呈顯著負相關，HDAC9 通過抑制 miR-206 進而增加血管內皮生長因子（VEGF）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白表達，促進三陰性乳腺癌的侵襲轉移和血管生成。Li 等[13]發現 HDAC9 高表達與胰腺導管腺癌預后差相關。盡管也有相關研究探究了 HDAC9 與肺癌預后的相關性，但研究對象集中于全體非小細胞肺癌[14]，而 HDAC9 在肺鱗癌這一亞型中的作用并不清楚。
本研究發現在肺鱗癌組織中，HDAC9 表達水平與腫瘤分化程度（P=0.035）、腫瘤大小（P=0.041）、淋巴結轉移情況（P=0.013）相關。單因素 Cox 比例風險回歸模型分析結果顯示脈管癌栓（P=0.006）、腫瘤分化程度（P=0.005）、腫瘤大小（P=0.027）、淋巴結轉移情況（P=0.036）及 HDAC9 表達水平（P=0.032）與患者的 OS 相關。進一步將上述因素納入多因素 Cox 比例風險回歸模型進行分析，發現 HDAC9 表達水平（P=0.023）、腫瘤分化程度（P=0.003）、腫瘤大小（P=0.003）、淋巴結轉移情況（P=0.002）是影響肺鱗癌患者 OS 的獨立預測因子。Kalpan-Meier 生存分析顯示 HDAC9 高表達組患者的 OS 較低表達組差，差異有統計學意義（P=0.032）。CCK8 細胞增殖實驗及克隆形成實驗結果顯示，激活 HDAC9 基因轉錄可上調 HDAC9 蛋白表達水平并促進腫瘤細胞增殖，提示 HDAC9 在肺鱗癌的發生發展中發揮著促癌作用。
綜上所述，HDAC9 高表達肺鱗癌患者的預后較低表達患者差，是影響肺鱗癌患者 OS 的獨立預測因子，其表達水平與腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移相關。HDAC9 高表達可促進肺鱗癌細胞增殖。提示 HDAC9 可能成為肺鱗癌新的預后生物標志物。但 HDAC9 促進肺鱗癌發生的詳細分子機制尚不明確，并且其作為治療靶點的可能性有待進一步探索。
利益沖突：無。
作者貢獻：畢繼旺為實驗和文章主要完成人；劉冰修改文章；馬媛媛修改文章，實驗方法指導；楊躍提供實驗指導。
在全球范圍內，肺癌是目前發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1-2]。最新數據顯示，我國 2015 年肺癌新發病例 78.7 萬例，死亡病例 63.1 萬例，位居惡性腫瘤之首[3]。根據組織學類型，肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，后者占全部肺癌的 85% 左右。肺鱗狀細胞癌（鱗癌）是非小細胞肺癌的主要類型之一，約占全部肺癌患者的 25%[4]。早期肺鱗癌以手術治療為主，輔以放化療；對于晚期肺鱗癌，則以放化療為主。靶向藥物的出現極大改善了肺腺癌的預后，但由于基因突變譜不同于肺腺癌，肺鱗癌患者中表皮生長因子受體（EGFR）基因突變和中間變性淋巴瘤微酶（ALK）基因融合等并不常見，這導致肺鱗癌缺乏有效的治療靶點[5]。近年來，針對免疫檢查點程序性死亡受體 1（PD-1）/PD-L1等的單克隆抗體的應用顯著改善了部分晚期肺鱗癌的預后，但總體有效率僅約為 20%[6-7]。因此，尋找影響肺鱗癌預后的分子，并據此開發新的治療靶點對于提高肺鱗癌治療效果十分重要。
為尋找肺鱗癌新的有效治療靶點，本實驗室前期通過對 11 對 LUSC 原發腫瘤及對應患者來源的異種移植模型（patients derived xenografts，PDXs）進行全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）和全外顯子組測序（whole exosome sequencing，WES）[8]，并結合 TCGA（The Cancer Genome Atlas）數據庫和 COSMIC（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer）數據庫等，篩選出 56 個攜帶高頻單堿基變異（single nucleotide variations，SNVs）或拷貝數變異（copy number variations，CNVs）的基因，并進一步采用靶向測序在 80 例肺鱗癌標本內檢測其突變情況，結果顯示組蛋白去乙酰化酶 9（HDAC9）基因在肺鱗癌內呈高頻擴增。
表觀遺傳異常改變是腫瘤的一大特征[9]，而乙酰化修飾是一種重要的表觀遺傳調控方式。組蛋白乙酰化酶（HATs）和HDACs 共同調節組蛋白的乙酰化修飾，其中 HDACs 通過與其它分子形成復合物催化移除組蛋白 N 末端賴氨酸殘基上的乙酰基團，促使組蛋白與 DNA 結合，從而發揮轉錄抑制作用。文獻[10]報道 HDACs 可抑制抑癌基因的表達或調節促癌信號通路中關鍵分子的表達而促進腫瘤發生。HDAC9 是Ⅱ型 HDAC 分子，與多種惡性腫瘤的增殖轉移相關[11-14]，但 HDAC9 與肺鱗癌的關系尚未明確。本研究旨在通過檢測 HDAC9 在肺鱗癌組織中的表達水平，分析其與肺鱗癌臨床病理特征及預后的相關性，并探究其對肺鱗癌細胞增殖的影響，為將來進一步開發治療靶點打下基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料與組織標本
收集 2010 年 7 月至 2014 年 4 月期間于北京大學腫瘤醫院胸外二科進行手術切除的 129 例肺鱗癌患者組織標本及其臨床資料。入選標準：（1）術前未接受任何治療；（2）術后經過組織病理診斷屬于肺鱗癌；（3）不合并身體其它部位的惡性腫瘤且無其它惡性腫瘤史。排除標準：除單純肺鱗癌以外的其它類型，如腺鱗癌等各種混合癌均不納入。本組患者男 118 例、女 11 例，中位年齡 61（37～79）歲；腫瘤分化程度為高中分化 58 例，低分化 71 例；腫瘤大小<3 cm 37 例，≥3 cm 92 例；淋巴結陽性 34 例，淋巴結陰性 95 例；胸膜侵犯 22 例。59 例患者行術后輔助治療（化療 54 例，放療 3 例，同步放化療 2 例）。按照國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）于 2009 年頒布的《肺癌 TNM 分期標準（第 7 版）》對患者進行分期[15]。
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學染色
129 例肺鱗癌組織標本均由北京大學腫瘤醫院病理科常規固定、石蠟包埋、切片。5 μm 厚的石蠟病理切片，65 ℃ 烤片 60 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，經檸檬酸鈉抗原修復液（pH 6.0）（中杉金橋 ZLI-9064）進行高壓熱修復 5 min，3% H2O2 室溫孵育 10 min 滅活內源性過氧化物酶，山羊血清（中杉金橋 ZLI-9022）室溫濕盒內封閉 60 min，HDAC9 一抗（Abcam 兔抗人重組單克隆抗體 ab109446 1∶1 000）4℃ 濕盒內過夜孵育，辣根過氧化物酶標記的二抗（中杉金橋 PV-6000）室溫濕盒內孵育 45 min，DAB 顯色液（中杉金橋 ZLI-9018）顯色，蘇木素復染 5 min。
1.2.2 免疫組織化學結果判讀
每張切片隨機選取 10 個高倍（400×）視野，每個視野計數 100 個細胞，根據細胞染色強度和陽性細胞比例評判實驗結果。所有染色結果均由兩位病理醫生分別在沒有事先了解患者信息的情況下給出分數，然后在討論后達成共識。對 HDAC9 的著色強度和陽性細胞百分比進行評分。根據著色強度分級為 0（無染色）、1（輕度染色）、2（中度染色）、3（強染色）。根據著色腫瘤細胞的百分比，評分如下：0（<25%）、1（25%～49%）、2（50%～74%）、3（≥75%）。將兩得分相乘得到最終評分，高表達（≥6）或低表達（<6）。
1.2.3 細胞培養
MEM 培養基、胎牛血清、Sodium Pyruvate、MEM NEAA、胰酶均采購自美國 GIBCO 公司。肺鱗癌細胞系 EBC-1 采用 MEM 培養基（含 10% 胎牛血清，10% Sodium Pyruvate，10% MEM NEAA，1% 青鏈霉素雙抗）于 37℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養。當細胞進入對數生長期（細胞密度 80% 左右）時，用胰酶消化貼壁細胞，離心后用新鮮培養基重懸，進行后續傳代或鋪板轉染實驗。
1.2.4 CRISPR/dCas9 轉錄激活系統及質粒構建
CRISPR/dCas9 轉錄激活系統［lentiSAM v2（Puro）& lentiMPH v2（Neo）］由 Adam Karpf 實驗室通過非營利性組織 Addgene 平臺贈與（Addgene plasmid # 92062；
1.2.5 細胞轉染
Lipo3000 轉染試劑盒購自 Invitrogen 公司。轉染前 1 d，將細胞鋪于 6 孔板中，鋪板密度為 50% 左右。鋪板后第 2 d，按照 Lipo3000 轉染試劑盒說明書進行細胞轉染。細胞轉染 24 h 后，收集細胞進行后續細胞實驗；細胞轉染 48 h 后，利用實時熒光定量 PCR（real-time fluorogentic quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和蛋白質免疫印跡（Western Blotting，WB）實驗對轉染效率進行驗證。
1.2.6 實時熒光定量 PCR
收集轉染 48 h 后的細胞，按照 Trizol（Invitrogen）法提取細胞總 RNA，并按 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒（#AE301-02，Transgene Biotech）說明書用 Random Primer 對 2 μg 總 RNA 進行反轉錄合成 cDNA。按照 GoTaq qPCR Master Mix 試劑盒（#A6001，Promega）說明書進行 PCR 反應，PCR 反應條件為 95℃ 預變性 5 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，共 45 個循環；融解曲線反應條件為 95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s。以 β-ACTIN 為內參。用 2-ΔΔCt 法計算相對表達量。β-ACTIN、HDAC9 的引物序列如下：β-ACTIN 引物序列 F: TTAGTTGCGTTACACCCTTT，R: ACCTTCACCGTTCCAGTTT；HDAC9 引物序列 F: TGATGACATTGGCTGATGG，R: CTGCTTAGAATTTTTAAGAGAACTT。實驗至少重復 3 次。
1.2.7 蛋白質免疫印跡實驗
收集轉染 48 h 后的細胞，加入 RIPA（strong）蛋白裂解液（含 Cocktail 蛋白酶抑制劑）裂解細胞，提取細胞總蛋白，利用 BCA 法測定蛋白濃度。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，將等量 30 μg 變性后樣品經 8% 的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，而后將膠內蛋白電轉至硝酸纖維素膜上。5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h，一抗［HDAC9（Abcam ab109446）1∶10 000，GAPDH（CST #97166）1∶10 000］4℃ 孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜后相應二抗（1∶10 000）室溫孵育 1 h，TBST 洗膜后進行化學發光顯色。實驗至少重復 3 次。
1.2.8 CCK8 細胞增殖實驗
CCK8 細胞增殖與毒性檢測試劑盒購自日本 Dojindo 公司。收集轉染 24 h 后的細胞，每孔 5 000 個細胞均勻接種于 96 孔板中，體積 100 μL，每組設置 3 個復孔，5 個觀察時間點，分別于 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h 加入 CCK8 試劑后 37℃ 培養箱孵育 2 h，后于酶標儀上測定 450 nm 的光密度值。0 h 孔在接種細胞后直接加入 10 μL CCK8 試劑孵育 2 h 后測光密度值，其它孔在加入 CCK8 試劑孵育前更換新鮮培養基 100 μL，再加入 10 μL CCK8 試劑孵育 2 h 后測光密度值。根據各時間點與 0 h 平均光密度值的差值繪制增殖曲線。實驗至少重復 3 次。
1.2.9 克隆形成實驗
收集轉染 24 h 后的細胞，每孔 1 000 個細胞均勻接種于 6 孔板，培養基 2 mL，每組設置 3 個復孔，37℃ 培養箱內培養 9 d。棄去培養基，磷酸鹽緩沖液洗 1 次，4% 多聚甲醛室溫固定 10 min，0.1% 結晶紫水溶液室溫染色 10 min，去離子水洗去多余染液，室溫干燥后拍照。
1.3 統計學分析
采用 IBM SPSS 24.0（Chicago，USA）軟件進行統計學分析。分類資料采用 χ2 檢驗，采用 Kaplan-Meier 法進行生存分析并采用 log-rank 檢驗方法進行顯著性檢驗，檢驗水準 α=0.05。采用單因素和多因素 Cox 比例風險回歸模型分析影響患者總生存期（overall survival，OS）的獨立預測因子，多因素 Cox 比例風險回歸模型納入的變量為單因素 Cox 分析中 P<0.100 的變量。
1.4 倫理審查
本研究獲得北京大學腫瘤醫院醫學倫理委員會批準（批準號：2018KT43）。所有患者術前均簽署知情同意書。
2 結果
2.1 HDAC9 蛋白在肺鱗癌組織中的表達及其與臨床病理特征的相關性
HDAC9 蛋白于細胞核中表達，陽性染色細胞排列呈巢狀，周圍被結締組織分割（圖 1）。在全部染色 129 例肺鱗癌患者中，39 例（30.2%）呈低表達，90 例（69.8%）呈高表達。采用 χ2 檢驗分析 129 例肺鱗癌組織中 HDAC9 表達水平與患者的臨床病理特征之間的相關性，發現 HDAC9 表達水平與腫瘤分化程度（P=0.035）、腫瘤大小（P=0.041）、淋巴結轉移情況（P=0.013）相關，而與年齡、性別、吸煙史、脈管癌栓、輔助治療情況無明確相關性（表 1）。
圖1
HDAC9 免疫組化染色結果示意圖（×100 倍）
a：無染色；b：輕度染色；c：中度染色；d：強染色
表1
HDAC9 在 129 例肺鱗癌患者中的表達情況及其與其他臨床病理特征的關聯［例/例（%）］
2.2 HDAC9 表達水平與肺鱗癌患者總生存的 Kaplan-Meier 生存分析
在線基因表達分析工具 GEPIA[16]（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）（
圖2
HDAC9 表達水平與肺鱗癌患者總生存期的 Kaplan-Meier 生存分析曲線
a：HDAC9 在轉錄水平的 Kaplan-Meier 生存分析曲線；b：HDAC9 在蛋白水平的 Kaplan-Meier 生存分析曲線
2.3 肺鱗癌患者預后的單因素和多因素分析
采用 Cox 比例風險回歸模型分析肺鱗癌預后的影響因素，單因素分析發現脈管癌栓（P=0.006）、腫瘤分化程度（P=0.005）、腫瘤大小（P=0.027）、淋巴結轉移情況（P=0.036）及 HDAC9 表達水平（P=0.032）是影響患者預后的因素；多因素分析顯示，腫瘤分化程度（P=0.003）、腫瘤大小（P=0.003）、淋巴結轉移情況（P=0.002）及 HDAC9 表達水平（P=0.023）是患者預后的獨立預測因子（表 2）。
表2
肺鱗癌患者總生存單因素和多因素 Cox 比例風險回歸模型分析
2.4 轉錄激活 HDAC9 促進肺鱗癌細胞系 EBC-1 增殖
為進一步探究 HDAC9 分子對肺鱗癌增殖的影響，應用 CRISPR/dCas9 轉錄激活系統激活肺鱗癌細胞系 EBC-1 內 HDAC9 基因的轉錄并觀察細胞增殖表型的改變。首先，在 EBC-1 細胞中分別轉染插入 sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3 的 CRISPR/dCas9 轉錄激活系統以挑選最佳 sgRNA，利用 qPCR 法在 mRNA 水平檢測 HDAC9 基因轉錄激活效率（圖 3a），其中 sgRNA2 使 HDAC9 轉錄水平上調倍數最高。CCK8 細胞增殖曲線顯示 HDAC9 轉錄激活組較陰性對照組生長能力提高，組間差異有統計學意義（圖 3b，F=52.7，P=0.002）。WB 結果顯示轉錄激活 HDAC9 基因后，HDAC9 蛋白表達水平上調（圖 3c）。克隆形成實驗結果顯示，轉錄激活 HDAC9 增強 EBC-1 細胞的集落形成能力（圖 3d）。
圖3
轉錄激活 HDAC9 促進肺鱗癌細胞系 EBC-1 增殖
a：靶向 HDAC9 啟動子區三個 sgRNAs 的轉錄激活效率；b：CCK8 細胞增殖曲線；c：轉錄激活 HDAC9 后蛋白水平改變；d：克隆形成實驗結果圖；NC：非靶向對照組；AC：靶向 HDAC9 轉錄激活組；***與 NC 組比較，
3 討論
雖然同屬非小細胞肺癌，但肺鱗癌與肺腺癌基因突變譜不同。肺腺癌的高頻突變，如 EGFR 突變、ALK 基因融合突變等在肺鱗癌內并不常見。尋找影響肺鱗癌發生發展及患者預后的相關基因對于評估患者預后、指導臨床治療、開發治療靶點都十分重要。據此，本實驗室通過前期測序發現 HDAC9 基因在肺鱗癌中呈高頻擴增，并在本實驗中探究其在肺鱗癌中發揮的作用。
作為表觀遺傳修飾的重要方式，組蛋白翻譯后修飾參與基因轉錄調控、染色體重塑等過程，在腫瘤的發生發展中扮演重要角色[10]。組蛋白乙酰化修飾是一種研究較為成熟的組蛋白翻譯后修飾方式，由 HATs 和 HDACs 共同調節。HDACs 通過催化移除組蛋白 N 末端賴氨酸殘基上的乙酰基團，促使組蛋白與 DNA 結合，從而發揮轉錄抑制作用。基于與酵母菌同源序列的比對，可將 18 種 HDACs 分為 4 型，Ⅰ型為 Rpd3 樣酶，包括 HDAC1、2、3、8；Ⅱ型為 Had-1 樣酶，可細分為兩個亞型Ⅱa（HDAC4、5、6、7、9）和Ⅱb（HDAC6、10）；Ⅲ型為 Sir2 樣酶，包括 7 種 sirtuins，為 NAD 依賴蛋白的去乙酰化酶或 ADP 核糖基化酶；Ⅳ型僅包括 HDAC11[17]。多項研究表明，HDACs 家族分子的基因突變或調節異常參與細胞周期、細胞凋亡、細胞自噬、血管生成、上皮向間質轉化等生物學過程，促進多種實體腫瘤和血液腫瘤的發生發展，且多數情況下，HDACs 的高表達水平與疾病晚期和患者預后差相關[10]。
HDAC9 作為 HDACs 家族Ⅱ型分子的一員，已被報道與多種惡性腫瘤密切相關。Xiong 等[11]發現 HDAC9 在胃癌中高表達，敲低 HDAC9 可抑制胃癌細胞增殖并增加其對順鉑的敏感性。Salgado 等[12]發現三陰性乳腺癌細胞系中 HDAC9 的表達水平顯著高于非三陰性乳腺癌細胞系，且其蛋白表達與 miR-206 表達呈顯著負相關，HDAC9 通過抑制 miR-206 進而增加血管內皮生長因子（VEGF）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白表達，促進三陰性乳腺癌的侵襲轉移和血管生成。Li 等[13]發現 HDAC9 高表達與胰腺導管腺癌預后差相關。盡管也有相關研究探究了 HDAC9 與肺癌預后的相關性，但研究對象集中于全體非小細胞肺癌[14]，而 HDAC9 在肺鱗癌這一亞型中的作用并不清楚。
本研究發現在肺鱗癌組織中，HDAC9 表達水平與腫瘤分化程度（P=0.035）、腫瘤大小（P=0.041）、淋巴結轉移情況（P=0.013）相關。單因素 Cox 比例風險回歸模型分析結果顯示脈管癌栓（P=0.006）、腫瘤分化程度（P=0.005）、腫瘤大小（P=0.027）、淋巴結轉移情況（P=0.036）及 HDAC9 表達水平（P=0.032）與患者的 OS 相關。進一步將上述因素納入多因素 Cox 比例風險回歸模型進行分析，發現 HDAC9 表達水平（P=0.023）、腫瘤分化程度（P=0.003）、腫瘤大小（P=0.003）、淋巴結轉移情況（P=0.002）是影響肺鱗癌患者 OS 的獨立預測因子。Kalpan-Meier 生存分析顯示 HDAC9 高表達組患者的 OS 較低表達組差，差異有統計學意義（P=0.032）。CCK8 細胞增殖實驗及克隆形成實驗結果顯示，激活 HDAC9 基因轉錄可上調 HDAC9 蛋白表達水平并促進腫瘤細胞增殖，提示 HDAC9 在肺鱗癌的發生發展中發揮著促癌作用。
綜上所述，HDAC9 高表達肺鱗癌患者的預后較低表達患者差，是影響肺鱗癌患者 OS 的獨立預測因子，其表達水平與腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移相關。HDAC9 高表達可促進肺鱗癌細胞增殖。提示 HDAC9 可能成為肺鱗癌新的預后生物標志物。但 HDAC9 促進肺鱗癌發生的詳細分子機制尚不明確，并且其作為治療靶點的可能性有待進一步探索。
利益沖突：無。
作者貢獻：畢繼旺為實驗和文章主要完成人；劉冰修改文章；馬媛媛修改文章，實驗方法指導；楊躍提供實驗指導。
