引用本文： 林鎮業, 王志文, 孟維鑫, 遲超, 展旭, 劉宏宇. TLR4/NF-κB 信號通路介導的血管炎癥參與A 型主動脈夾層的發病機制. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2019, 26(8): 748-753. doi: 10.7507/1007-4848.201811021 復制
主動脈夾層（aortic dissection，AD）是一種發病率和死亡率非常高的外科急癥。 AD 的發病特點在于中膜病變，內膜撕裂而造成血液經撕裂口進入動脈壁中形成夾層。根據 Stanford 夾層分型，A 型主動脈夾層（type A aortic dissection，TAAD）累及升主動脈，也可累及主動脈弓、胸降主動脈和腹主動脈；Stanford B 型夾層累及胸降主動脈，可同時累及腹主動脈[1]。國際急性主動脈夾層注冊表數據庫（IRAD）顯示：過去 17 年里 TAAD 手術治療從 79% 增加到 90%。TAAD 院內死亡率顯著下降（31% 至 22%），手術死亡率雖有所下降但仍維持在較高水平（25%～18%）[2]。由于對 TAAD 發病機理還不完全理解，不能獲得能有效限制 TAAD 進展的藥物。
過去研究表明，TAAD 主要與遺傳性組織結締性疾病相關[3]，與免疫炎癥聯系不緊密。然而最近研究表明，無論 TAAD 與遺傳性聯系緊密與否，免疫-炎癥機制可能也參與主動脈壁重塑[4-6]。在 TAAD 患者中，由活化的 T 和 B 淋巴細胞和巨噬細胞組成的細胞群滲透到血管瘤周圍和破裂的主動脈壁邊緣。此外，已觀察到 TAAD 患者的促炎細胞因子增加[7]。由此表明免疫炎癥機制可能參與 TAAD 病理生理。雖然關于主動脈免疫炎癥理論的研究很多，但主要集中在腹主動脈瘤（AAA），關于 TAAD 研究較少。到目前為止免疫炎癥在 TAAD 發病機制中的確切作用仍不清楚。但目前發現幾種有關 TAAD 的生物標志物，包括 D-二聚體、平滑肌細胞、金屬蛋白酶 8 和肌腱蛋白 C[8]。
Toll 樣受體-4（toll-like receptors-4，TLR4）是調控先天性免疫的重要效應分子，參與多種疾病的病理生理過程，另外已有文獻指出在主動脈壁細胞中可檢測 TLR4 表達，特別是在內皮細胞和血管平滑肌細胞中高表達[9]。TLR4 的這些特征表明它可能在 TAAD 中起著致病作用。本研究旨在確定 TAAD 患者中 TLR4 的表達是否增加，并確定其在 TAAD 中的作用。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入 2015 年 9 月至 2018 年 1 月哈爾濱醫科大學附屬第一醫院心臟大血管外科住院治療的急性 TAAD 患者。入選標準為：（1）急性疾病（<14 d）；（2）AD 的診斷成像評估基于 2014 年歐洲指南[8]的建議；（3）根據斯坦福系統對胸主動脈夾層的解剖范圍進行分類。如果患者有以下一種或多種情況，則將患者排除在研究之外：（1）發病時間（>14 d）；（2）可引起炎癥因子水平變化的自身免疫性疾病或傳染病；（3）醫源性主動脈損傷、創傷性主動脈損傷和藥物使用；（4）合并其他心臟疾病，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟、病毒性心肌炎、心肌病、心功能不全、二尖瓣及主動脈瓣病變等；（5）某些遺傳綜合征，如馬方綜合征、Ehlers-Danlos 綜合征和主動脈炎；（6）遺傳性結締組織疾病；（7）壁內血腫和穿透性主動脈潰瘍；（8）伴有嚴重的肝腎損害。本研究經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。所有患者在參與研究之前都簽署了知情同意書。
1.2 組織和血漿樣品
組織樣本：TAAD 組為接受開放手術治療的 12 例 TAAD 患者的全層升主動脈壁樣本，其中男 8 例、女 4 例，年齡（50.4±1.97）歲。對照組在年齡和性別方面與試驗組相匹配，收集 12 例由哈爾濱醫科大學附屬第一醫院無主動脈夾層的心臟或腎臟移植供體提供的主動脈壁組織樣本，其中男 8 例、女 4 例，年齡（48.5±0.69）歲。所有樣本在–80℃ 下儲存用于進一步試驗。
血漿樣本：入院后立即收集 TAAD 患者的血漿樣本，所有對照都是從同一社區收集的。TAAD 組 43 例，對照組 50 例（表 1）。TAAD 組和對照組血漿樣品，以 3 000 r/min 離心 5 min，分離成 500 μL 等分樣品，并儲存在–80℃。
表1
患者的臨床和生化特征［
/例（%）］
1.3 Western blotting 檢測
根據制造商的說明書，用含有蛋白酶抑制劑（Thermo Fisher Scientific，上海，中國）的 RIPA 裂解緩沖液（Beyotime Biotechnology，上海，中國）從主動脈樣本中提取蛋白。使用增強的 BCA 蛋白質測定試劑盒（Beyotime Biotechnology，上海，中國）定量總蛋白質濃度，并在 12.5% SDS-PAGE 凝膠上分離蛋白質樣品。電泳后，將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并與針對 TLR4（Wanleibio，沈陽，中國），MyD88（Wanleibio），TRAF-6（Wanleibio），NF-κBp65（Abcam），IL-1β（Wanleibio）和 β-肌動蛋白（ZSGB-BIO，北京，中國）的抗體一起孵育。在用 5% 無脂奶粉封閉后，將膜與適當的一抗在 4℃ 溫育 24 h。洗滌 3 次后，將膜與過氧化物酶偶聯的二抗（ZSGB-BIO，北京，中國）一起溫育，最后化學發光試劑顯色。
1.4 免疫組化（IHC）
通過 IHC 檢測主動脈壁樣品中 CD68 細胞（巨噬細胞）。制備福爾馬林固定和石蠟包埋的切片（6 μm），并與 CD68（Abcam，Cambridge，MA，USA）的一抗在 4℃ 下溫育過夜，然后用二氨基聯苯胺染色，蘇木精復染。用蓋玻片安裝切片并在光學顯微鏡下檢查。
1.5 細胞因子檢測
根據制造商的說明書（R&D Systems，北京，中國），使用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定 IL-1β 的血漿炎性細胞因子。
1.6 靜脈血液指標調查
入院時在進行任何手術之前，收集所有患者靜脈血。使用自動分光光度計和使用 Olympus AU640 Autoanalyzer（Olympus，Kobe，日本）的酶比色法測量 12 h 空腹血清總膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。在 Hitachi 7600 Autoanalyzer（Hitachi，東京，日本）上使用 Jaffe 動力學方法進行其他生物化學測量。
1.7 統計學分析
正態分布的計量資料使用 ANOVA、獨立樣本 t 檢驗比較兩組變量差異。非正態分布的計量資料組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。 Spearman 相關分析用于評估血漿 IL-1β 以及與血漿 D-二聚體相關性。受試者工作特征（ROC）曲線用于評估血清細胞因子的診斷效果并確定相應的截止點。多因素分析采用 logistic 回歸方法以確定血清 IL-1β 在 TAAD 風險中的預測值，并調整潛在的混雜因素。所有數據以中位數和四分位數表示或均數±標準差（
±s）表示。統計分析采用 SPSS16.0（Chicago，IL，USA）。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 在 TAAD 患者的升主動脈壁中 TLR4/NF-κB 依賴信號通路蛋白質高表達
通過 Western blotting 檢測，從 TAAD 主動脈壁組織樣本與對照組組織樣本檢測 TLR4/NF-κB 依賴信號通路的各節點分子的蛋白質水平。與對照組樣本相比較，TAAD 樣品顯示 TLR4、Myd88、TRAF-6、NF-κBp65、IL-1β 的蛋白質表達水平顯著增加；見圖 1。
圖1
Western blotting 檢測結果
TLR4/NF-κB 信號通路的各節點分子的蛋白質水平在對照組和 TAAD 組比較
2.2 TAAD 患者的升主動脈壁和血漿中炎癥標志物升高
通過 IHC 檢驗主動脈壁組織樣本中的 CD68，TAAD 組中的 CD68 高于對照組，表明 TAAD 組織中巨噬細胞的顯著增多（圖 2）。ELISA 檢測 43 例 TAAD 患者和 50 例無 TAAD 患者（對照組）血漿細胞因子 IL-1β，TAAD 組 IL-1β 水平顯著高于對照組（圖 3）。
圖2
免疫組化染色
a：CD68 在對照組升主動脈壁中的表達（×400）；b：CD68 在 TAAD 組升主動脈壁中的表達（箭頭為 CD68，×400）；c：CD68 在對照組和 TAAD 組量化值的比較（ImageJ 軟件 1.8.0）
圖3
ELISA 檢測結果
ELISA 檢測血漿中 IL-1β，TAAD 組中的 IL-1β 整體高于對照組
2.3 TAAD 患者和對照組患者臨床特征的比較
43 例 TAAD 患者的白細胞明顯高于對照組［11.21（8.34～13.46）×109/L vs. 7.25（5.67～10.06）×109/L，P<0.001］，TAAD 組高血壓病比例高于對照組［27（62.79%） vs. 17（34.00%），P=0.001］。此外，TAAD 組患者比對照組患者有更高的 D-二聚體水平 ［5.31（3.12～8.85）mg/L vs. 0.88（0.52～1.36）mg/L，P<0.001］。TAAD 組患者血清 IL-1β 水平為 4.03（3.20～4.97）pg/mL，高于對照組 2.74（2.05～3.87）pg/mL（P<0.001）。
2.4 血漿 IL-1β 與 D-二聚體的相關性
許多研究表明，血漿 D-二聚體與 TAAD 患者的發病率呈顯著正相關，這可以作為 TAAD 發病的有效預測因子。因此，我們通過 Spearman 相關分析進一步分析了急性 TAAD 患者血漿 IL-1β 與 D-二聚體之間的關系。結果顯示 IL-1β 與 D-二聚體呈正相關（圖 4）。采用多因素 logistic 回歸分析表明除 D-二聚體外， IL-1β 是 TAAD 顯著且獨立的因子［OR=2.34，95%CI（1.14，3.71，P=0.015］；見表 2。
圖4
IL-1β 與 D-二聚體相關性
表2
TAAD 危險因素的多因素 logistic 分析
2.5 血漿 IL-1β 和 D-二聚體在 TAAD 中的診斷價值預測
ROC 曲線分析顯示 IL-1β 和 D-二聚體在 TAAD 中具有一定的診斷價值，結合 D-二聚體與 IL-1β 為最佳診斷，其次是 D-二聚體，最后是 IL-1β（圖 5）。D-二聚體的曲線下面積（AUC）為 0.927［95%CI（0.858，0.968）］，靈敏度為 83.6%，特異性為 91.2%（表 3）。 IL-1β 的 AUC 為 0.806［95%CI（0.716，0.878）］，敏感性為 73.5%，特異性為 68.3%。結合 D-二聚體與 IL-1β 的 AUC 為 0.966［95%CI（0.910，0.992）］。
圖5
IL-1β 與 D-二聚體單項檢測和聯合檢測的 ROC 曲線圖
表3
ROC 曲線 AUC 值
2.6 TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白與血清 IL-1β 相關性分析
Western blotting 檢測表明 TLR4/NF-κB 信號通路的相關蛋白和血清 IL-1β 在 TAAD 組中均高表達，TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白均與血清 IL-1β 呈正相關（圖 6），表明 TLR4/NF-κB 信號通路介導炎癥反應參與 TAAD 發病機制。
圖6
TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白與血清 IL-1β 相關性分析
3 討論
有關 TAAD 的發病機制，特別是循環標志物的鑒定，仍然是研究興趣的焦點。 雖然 TAAD 生物標志物和 TLR4 在心血管疾病中的作用已有較大發現，但 TLR4 在 TAAD 發病機制中的確切作用尚不清楚。 在本研究中，TLR4 介導的免疫途徑似乎參與了 TAAD 發病的病理機制，并且 TLR4 介導的炎癥產物如 IL-1β 被確立為具有重要診斷價值的新型生物標志物。
TLR4 能夠識別病原體和內源性配體，并激活 NF-κB 和炎性細胞因子信號傳導途徑，從而激活先天免疫系統[10-13]。本研究的結果顯示 TLR4 及其主要信號分子在 TAAD 的主動脈組織中過表達。這些結果表明 TLR4 的表達增加可能與 TAAD 有關。然而，很少有研究分析 TAAD 患者 TLR4 表達增加的原因和 TLR4 與 TAAD 病因的因果關系。盡管 TLR4 的表達在健康成人動脈中很大程度上是不可檢測的，但它存在于主動脈壁細胞內并且在動脈損傷時增加，導致炎癥反應增強。此外，主動脈壁損傷時內皮細胞和血管平滑肌細胞上的 TLR4 誘導 NF-κB 轉錄因子的活化以及許多炎癥介質和金屬蛋白酶（MMP）的產生和釋放[9, 14]。巨噬細胞能夠釋放和調節促炎細胞因子（IL-1β）和 MMPs 的活性，這些細胞因子在導致基質降解中起到重要的作用[15]。最近的研究還表明，巨噬細胞產生內源性配體，與 TLR-4 受體結合，從而激活 NF-κB 介導的細胞遷移、激活、增殖和分化的細胞信號通路[16]。本研究結果還表明 TAAD 患者主動脈介質中巨噬細胞明顯增多。在 TAAD 患者的升主動脈組織中的炎性細胞和 TLR4 的共同活化巨噬細胞，從而加強主動脈壁基質的降解。這促進了 TLR4 的釋放，從而誘導 NF-κB 活化，IL-1β 的產生并增加 MMP 的表達，這可能引起主動脈壁的進一步退化。
實際上，已有研究[17]報道了腹主動脈瘤與 IL-1β 發病機制之間存在聯系，并且可以通過 IL-1β 的遺傳和藥理學抑制來阻斷主動脈瘤的形成和進展。IL-1β 與 TAAD 之間的關系仍不清楚。目前 TAAD 診斷的主要檢查是主動脈 CT 血管造影（CTA）[18]，磁共振成像（MRI）也是主動脈夾層檢查重要項目，其靈敏度為 95%～98%，特異性為 94%～98%[19]。但主動脈 CTA 和 MRI 不是急性胸痛患者常規檢查項目，而且存在轉運風險。MRI 成像時間長，不適合急危重患者，無法急診實施，并限制了體內金屬異物、起搏器植入術的患者。CTA 增強掃描需要注射對比劑，需護理協作，基層醫院在夜間常規開展存在困難。而結合患者病史、癥狀、體征和生物標記物進行早期診斷，可能成為今后研究方向。本研究表明，血漿 IL-1β 升高可作為 TAAD 的獨立危險標志物。目前已經確立 D-二聚體是 TAAD 風險預測因子，但 D-二聚體升高也可能提示肺栓塞[8]；同樣，IL-1β 升高也可能提示其他疾病。因此，聯合多種生物標志物對 TAAD 的診斷更為準確，本次研究 ROC 曲線分析同樣也證明這一點，結合 D-二聚體與 IL-1β 評估為最佳的診斷。
主動脈夾層（aortic dissection，AD）是一種發病率和死亡率非常高的外科急癥。 AD 的發病特點在于中膜病變，內膜撕裂而造成血液經撕裂口進入動脈壁中形成夾層。根據 Stanford 夾層分型，A 型主動脈夾層（type A aortic dissection，TAAD）累及升主動脈，也可累及主動脈弓、胸降主動脈和腹主動脈；Stanford B 型夾層累及胸降主動脈，可同時累及腹主動脈[1]。國際急性主動脈夾層注冊表數據庫（IRAD）顯示：過去 17 年里 TAAD 手術治療從 79% 增加到 90%。TAAD 院內死亡率顯著下降（31% 至 22%），手術死亡率雖有所下降但仍維持在較高水平（25%～18%）[2]。由于對 TAAD 發病機理還不完全理解，不能獲得能有效限制 TAAD 進展的藥物。
過去研究表明，TAAD 主要與遺傳性組織結締性疾病相關[3]，與免疫炎癥聯系不緊密。然而最近研究表明，無論 TAAD 與遺傳性聯系緊密與否，免疫-炎癥機制可能也參與主動脈壁重塑[4-6]。在 TAAD 患者中，由活化的 T 和 B 淋巴細胞和巨噬細胞組成的細胞群滲透到血管瘤周圍和破裂的主動脈壁邊緣。此外，已觀察到 TAAD 患者的促炎細胞因子增加[7]。由此表明免疫炎癥機制可能參與 TAAD 病理生理。雖然關于主動脈免疫炎癥理論的研究很多，但主要集中在腹主動脈瘤（AAA），關于 TAAD 研究較少。到目前為止免疫炎癥在 TAAD 發病機制中的確切作用仍不清楚。但目前發現幾種有關 TAAD 的生物標志物，包括 D-二聚體、平滑肌細胞、金屬蛋白酶 8 和肌腱蛋白 C[8]。
Toll 樣受體-4（toll-like receptors-4，TLR4）是調控先天性免疫的重要效應分子，參與多種疾病的病理生理過程，另外已有文獻指出在主動脈壁細胞中可檢測 TLR4 表達，特別是在內皮細胞和血管平滑肌細胞中高表達[9]。TLR4 的這些特征表明它可能在 TAAD 中起著致病作用。本研究旨在確定 TAAD 患者中 TLR4 的表達是否增加，并確定其在 TAAD 中的作用。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入 2015 年 9 月至 2018 年 1 月哈爾濱醫科大學附屬第一醫院心臟大血管外科住院治療的急性 TAAD 患者。入選標準為：（1）急性疾病（<14 d）；（2）AD 的診斷成像評估基于 2014 年歐洲指南[8]的建議；（3）根據斯坦福系統對胸主動脈夾層的解剖范圍進行分類。如果患者有以下一種或多種情況，則將患者排除在研究之外：（1）發病時間（>14 d）；（2）可引起炎癥因子水平變化的自身免疫性疾病或傳染病；（3）醫源性主動脈損傷、創傷性主動脈損傷和藥物使用；（4）合并其他心臟疾病，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟、病毒性心肌炎、心肌病、心功能不全、二尖瓣及主動脈瓣病變等；（5）某些遺傳綜合征，如馬方綜合征、Ehlers-Danlos 綜合征和主動脈炎；（6）遺傳性結締組織疾病；（7）壁內血腫和穿透性主動脈潰瘍；（8）伴有嚴重的肝腎損害。本研究經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。所有患者在參與研究之前都簽署了知情同意書。
1.2 組織和血漿樣品
組織樣本：TAAD 組為接受開放手術治療的 12 例 TAAD 患者的全層升主動脈壁樣本，其中男 8 例、女 4 例，年齡（50.4±1.97）歲。對照組在年齡和性別方面與試驗組相匹配，收集 12 例由哈爾濱醫科大學附屬第一醫院無主動脈夾層的心臟或腎臟移植供體提供的主動脈壁組織樣本，其中男 8 例、女 4 例，年齡（48.5±0.69）歲。所有樣本在–80℃ 下儲存用于進一步試驗。
血漿樣本：入院后立即收集 TAAD 患者的血漿樣本，所有對照都是從同一社區收集的。TAAD 組 43 例，對照組 50 例（表 1）。TAAD 組和對照組血漿樣品，以 3 000 r/min 離心 5 min，分離成 500 μL 等分樣品，并儲存在–80℃。
表1
患者的臨床和生化特征［/例（%）］
1.3 Western blotting 檢測
根據制造商的說明書，用含有蛋白酶抑制劑（Thermo Fisher Scientific，上海，中國）的 RIPA 裂解緩沖液（Beyotime Biotechnology，上海，中國）從主動脈樣本中提取蛋白。使用增強的 BCA 蛋白質測定試劑盒（Beyotime Biotechnology，上海，中國）定量總蛋白質濃度，并在 12.5% SDS-PAGE 凝膠上分離蛋白質樣品。電泳后，將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并與針對 TLR4（Wanleibio，沈陽，中國），MyD88（Wanleibio），TRAF-6（Wanleibio），NF-κBp65（Abcam），IL-1β（Wanleibio）和 β-肌動蛋白（ZSGB-BIO，北京，中國）的抗體一起孵育。在用 5% 無脂奶粉封閉后，將膜與適當的一抗在 4℃ 溫育 24 h。洗滌 3 次后，將膜與過氧化物酶偶聯的二抗（ZSGB-BIO，北京，中國）一起溫育，最后化學發光試劑顯色。
1.4 免疫組化（IHC）
通過 IHC 檢測主動脈壁樣品中 CD68 細胞（巨噬細胞）。制備福爾馬林固定和石蠟包埋的切片（6 μm），并與 CD68（Abcam，Cambridge，MA，USA）的一抗在 4℃ 下溫育過夜，然后用二氨基聯苯胺染色，蘇木精復染。用蓋玻片安裝切片并在光學顯微鏡下檢查。
1.5 細胞因子檢測
根據制造商的說明書（R&D Systems，北京，中國），使用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定 IL-1β 的血漿炎性細胞因子。
1.6 靜脈血液指標調查
入院時在進行任何手術之前，收集所有患者靜脈血。使用自動分光光度計和使用 Olympus AU640 Autoanalyzer（Olympus，Kobe，日本）的酶比色法測量 12 h 空腹血清總膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。在 Hitachi 7600 Autoanalyzer（Hitachi，東京，日本）上使用 Jaffe 動力學方法進行其他生物化學測量。
1.7 統計學分析
正態分布的計量資料使用 ANOVA、獨立樣本 t 檢驗比較兩組變量差異。非正態分布的計量資料組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。 Spearman 相關分析用于評估血漿 IL-1β 以及與血漿 D-二聚體相關性。受試者工作特征（ROC）曲線用于評估血清細胞因子的診斷效果并確定相應的截止點。多因素分析采用 logistic 回歸方法以確定血清 IL-1β 在 TAAD 風險中的預測值，并調整潛在的混雜因素。所有數據以中位數和四分位數表示或均數±標準差（±s）表示。統計分析采用 SPSS16.0（Chicago，IL，USA）。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 在 TAAD 患者的升主動脈壁中 TLR4/NF-κB 依賴信號通路蛋白質高表達
通過 Western blotting 檢測，從 TAAD 主動脈壁組織樣本與對照組組織樣本檢測 TLR4/NF-κB 依賴信號通路的各節點分子的蛋白質水平。與對照組樣本相比較，TAAD 樣品顯示 TLR4、Myd88、TRAF-6、NF-κBp65、IL-1β 的蛋白質表達水平顯著增加；見圖 1。
圖1
Western blotting 檢測結果
TLR4/NF-κB 信號通路的各節點分子的蛋白質水平在對照組和 TAAD 組比較
2.2 TAAD 患者的升主動脈壁和血漿中炎癥標志物升高
通過 IHC 檢驗主動脈壁組織樣本中的 CD68，TAAD 組中的 CD68 高于對照組，表明 TAAD 組織中巨噬細胞的顯著增多（圖 2）。ELISA 檢測 43 例 TAAD 患者和 50 例無 TAAD 患者（對照組）血漿細胞因子 IL-1β，TAAD 組 IL-1β 水平顯著高于對照組（圖 3）。
圖2
免疫組化染色
a：CD68 在對照組升主動脈壁中的表達（×400）；b：CD68 在 TAAD 組升主動脈壁中的表達（箭頭為 CD68，×400）；c：CD68 在對照組和 TAAD 組量化值的比較（ImageJ 軟件 1.8.0）
圖3
ELISA 檢測結果
ELISA 檢測血漿中 IL-1β，TAAD 組中的 IL-1β 整體高于對照組
2.3 TAAD 患者和對照組患者臨床特征的比較
43 例 TAAD 患者的白細胞明顯高于對照組［11.21（8.34～13.46）×109/L vs. 7.25（5.67～10.06）×109/L，P<0.001］，TAAD 組高血壓病比例高于對照組［27（62.79%） vs. 17（34.00%），P=0.001］。此外，TAAD 組患者比對照組患者有更高的 D-二聚體水平 ［5.31（3.12～8.85）mg/L vs. 0.88（0.52～1.36）mg/L，P<0.001］。TAAD 組患者血清 IL-1β 水平為 4.03（3.20～4.97）pg/mL，高于對照組 2.74（2.05～3.87）pg/mL（P<0.001）。
2.4 血漿 IL-1β 與 D-二聚體的相關性
許多研究表明，血漿 D-二聚體與 TAAD 患者的發病率呈顯著正相關，這可以作為 TAAD 發病的有效預測因子。因此，我們通過 Spearman 相關分析進一步分析了急性 TAAD 患者血漿 IL-1β 與 D-二聚體之間的關系。結果顯示 IL-1β 與 D-二聚體呈正相關（圖 4）。采用多因素 logistic 回歸分析表明除 D-二聚體外， IL-1β 是 TAAD 顯著且獨立的因子［OR=2.34，95%CI（1.14，3.71，P=0.015］；見表 2。
圖4
IL-1β 與 D-二聚體相關性
表2
TAAD 危險因素的多因素 logistic 分析
2.5 血漿 IL-1β 和 D-二聚體在 TAAD 中的診斷價值預測
ROC 曲線分析顯示 IL-1β 和 D-二聚體在 TAAD 中具有一定的診斷價值，結合 D-二聚體與 IL-1β 為最佳診斷，其次是 D-二聚體，最后是 IL-1β（圖 5）。D-二聚體的曲線下面積（AUC）為 0.927［95%CI（0.858，0.968）］，靈敏度為 83.6%，特異性為 91.2%（表 3）。 IL-1β 的 AUC 為 0.806［95%CI（0.716，0.878）］，敏感性為 73.5%，特異性為 68.3%。結合 D-二聚體與 IL-1β 的 AUC 為 0.966［95%CI（0.910，0.992）］。
圖5
IL-1β 與 D-二聚體單項檢測和聯合檢測的 ROC 曲線圖
表3
ROC 曲線 AUC 值
2.6 TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白與血清 IL-1β 相關性分析
Western blotting 檢測表明 TLR4/NF-κB 信號通路的相關蛋白和血清 IL-1β 在 TAAD 組中均高表達，TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白均與血清 IL-1β 呈正相關（圖 6），表明 TLR4/NF-κB 信號通路介導炎癥反應參與 TAAD 發病機制。
圖6
TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白與血清 IL-1β 相關性分析
3 討論
有關 TAAD 的發病機制，特別是循環標志物的鑒定，仍然是研究興趣的焦點。 雖然 TAAD 生物標志物和 TLR4 在心血管疾病中的作用已有較大發現，但 TLR4 在 TAAD 發病機制中的確切作用尚不清楚。 在本研究中，TLR4 介導的免疫途徑似乎參與了 TAAD 發病的病理機制，并且 TLR4 介導的炎癥產物如 IL-1β 被確立為具有重要診斷價值的新型生物標志物。
TLR4 能夠識別病原體和內源性配體，并激活 NF-κB 和炎性細胞因子信號傳導途徑，從而激活先天免疫系統[10-13]。本研究的結果顯示 TLR4 及其主要信號分子在 TAAD 的主動脈組織中過表達。這些結果表明 TLR4 的表達增加可能與 TAAD 有關。然而，很少有研究分析 TAAD 患者 TLR4 表達增加的原因和 TLR4 與 TAAD 病因的因果關系。盡管 TLR4 的表達在健康成人動脈中很大程度上是不可檢測的，但它存在于主動脈壁細胞內并且在動脈損傷時增加，導致炎癥反應增強。此外，主動脈壁損傷時內皮細胞和血管平滑肌細胞上的 TLR4 誘導 NF-κB 轉錄因子的活化以及許多炎癥介質和金屬蛋白酶（MMP）的產生和釋放[9, 14]。巨噬細胞能夠釋放和調節促炎細胞因子（IL-1β）和 MMPs 的活性，這些細胞因子在導致基質降解中起到重要的作用[15]。最近的研究還表明，巨噬細胞產生內源性配體，與 TLR-4 受體結合，從而激活 NF-κB 介導的細胞遷移、激活、增殖和分化的細胞信號通路[16]。本研究結果還表明 TAAD 患者主動脈介質中巨噬細胞明顯增多。在 TAAD 患者的升主動脈組織中的炎性細胞和 TLR4 的共同活化巨噬細胞，從而加強主動脈壁基質的降解。這促進了 TLR4 的釋放，從而誘導 NF-κB 活化，IL-1β 的產生并增加 MMP 的表達，這可能引起主動脈壁的進一步退化。
實際上，已有研究[17]報道了腹主動脈瘤與 IL-1β 發病機制之間存在聯系，并且可以通過 IL-1β 的遺傳和藥理學抑制來阻斷主動脈瘤的形成和進展。IL-1β 與 TAAD 之間的關系仍不清楚。目前 TAAD 診斷的主要檢查是主動脈 CT 血管造影（CTA）[18]，磁共振成像（MRI）也是主動脈夾層檢查重要項目，其靈敏度為 95%～98%，特異性為 94%～98%[19]。但主動脈 CTA 和 MRI 不是急性胸痛患者常規檢查項目，而且存在轉運風險。MRI 成像時間長，不適合急危重患者，無法急診實施，并限制了體內金屬異物、起搏器植入術的患者。CTA 增強掃描需要注射對比劑，需護理協作，基層醫院在夜間常規開展存在困難。而結合患者病史、癥狀、體征和生物標記物進行早期診斷，可能成為今后研究方向。本研究表明，血漿 IL-1β 升高可作為 TAAD 的獨立危險標志物。目前已經確立 D-二聚體是 TAAD 風險預測因子，但 D-二聚體升高也可能提示肺栓塞[8]；同樣，IL-1β 升高也可能提示其他疾病。因此，聯合多種生物標志物對 TAAD 的診斷更為準確，本次研究 ROC 曲線分析同樣也證明這一點，結合 D-二聚體與 IL-1β 評估為最佳的診斷。
