引用本文： 鄧麗, 楊慧, 劉宏宇, 蘇晶晶, 胡光, 遲超. 超氧對主動脈夾層患者圍術期紅細胞氧化應激以及能量代謝影響的體外實驗研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2019, 26(5): 465-469. doi: 10.7507/1007-4848.201808008 復制
主動脈夾層（aortic dissection，AD）患者圍術期低氧血癥（hypoxemia，HO）是臨床常見的并發癥，可導致多臟器功能障礙，延長患者的住院時間和增加費用，是圍術期最主要的致死因素之一[1]。如何及早對 HO 進行干預，降低圍術期病死率是目前心外科研究領域中的重點和難點[2]。超氧（ozone，O3）又稱臭氧、三氧，由 3 個氧原子組成，氧化性更強，水溶性更高，溶解度是普通氧氣的 10 倍，更易溶于血液和組織液，提供更充足的氧化和氧飽和作用[3]。實驗研究[4-5]證實 ozone 可以增加血漿里溶解的氧含量、提高紅細胞（red blood cells，RBCs）代謝，增加 RBCs 內三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和 2,3 二磷酸甘油酸（2,3-bisphosphoglyceric acid，2,3-DPG）含量，使氧離曲線右移，增加組織供氧；激活 RBCs 的磷酸戊糖代謝途徑，增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）生成，有利于維持 RBCs 膜的完整性。另外 ozone 還可以誘導抗氧化酶的過度表達從而清除生理和病理過程中形成過多的自由基，減少氧化應激反應。另外根據國際超氧協會指南推薦和臨床文獻報告[6]，ozone 可用于缺血、缺氧性疾病的治療，通過超氧自體氧合血療法（ozonated autohemotherapy，ozone-AHT），即根據患者體重抽取一定量靜脈血到無菌袋中，加入 ozone 進行體外氧合，5～10 min 后回輸到患者體內，可以有效提高患者血液氧含量，改善缺血缺氧性疾病的預后。本研究的主要目的是對 AD 圍術期的血液進行不同濃度的 ozone 預處理，通過檢測 RBCs 氧化損傷以及能量代謝指標的變化，估測出安全 ozone-AHT 的臨床干預濃度范圍，為 AD 圍術期 HO 應用 ozone-AHT 提供前期實驗理論基礎。
1 材料與方法
1.1 血樣標本收集
收集哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 2016 年 3～8 月 20 例 AD 患者術前肝素化（術前組）、體外循環停機（術后組）肝素化靜脈血 20 ml 置入無菌袋中，4℃ 冰箱保存。其中男 16 例、女 4 例，平均年齡（48.51±10.21）歲。病例納入標準：（1）需要體外循環（cardiopulmonary bypass，CPB）手術的 AD 患者；（2）30～60 歲。排除標準：（1）血液系統疾病；（2）外周血管疾病；（3）糖尿病；（4）一年內有腦血栓、心肌梗死病史，一年內接受支架介入手術，近期接受過其它有創手術的患者；（5）孕婦；（6）肝腎功能不全、接受人工肝、血液透析的患者。手術團隊應用同一標準流程來減少手術、麻醉以及 CPB 帶來的選擇性偏倚。本研究經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準（編號：201751），并獲得患者知情同意。
1.2 樣本超氧化處理
將術前、術后采集的 20 ml 靜脈血按照不同濃度組（0 μg/ml，40 μg/ml，60 μg/ml，80 μg/ml，160 μg/ml）分別置入不同的無菌袋中，ozone 來源于醫用 ozone 治療儀（HUMARES，Bruchsal，德國），根據實驗要求調制相應 ozone 濃度（40 μg/ml，60 μg/ml，80 μg/ml，160 μg/ml），本實驗濃度的選擇依據國際超氧協會推薦（在 ozone-AHT 療法中 40～80 μg/ml 的濃度為常用安全有效濃度）以及發表的文獻[4-5, 7]，按照 1∶1（1 ml 血∶1 ml 氣體）將 ozone 注入相應的血液樣本袋中，緩慢（40～60 次/min）順時針旋轉約 10 min，待氣體與血液充分反應完全。由于 ozone 反應非常迅速，為了獲得可靠的實驗結果，操作需要精細，注入氣體應緩慢，旋轉應勻速緩慢，避免過度搖晃產生氣泡導致血液破壞，加重溶血。樣本反應完畢，將血液緩慢抽出注入試管中，3 000 r/min 離心，將血漿和 RBCs 分離，分離后的 RBCs 用于制備提取 RBCs 膜蛋白。
1.3 RBCs 膜蛋白提取制備
分離后的紅細胞 1∶3 加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS，0.01 M，pH=7.40）3 000 r/min 洗滌 3 次，然后取 1 ml 洗滌壓積 RBCs 直接溶于 40 倍體積預冷的破膜液中［低滲 Tris-HCl（0.01 M，pH=8.0），內含 0.02 mM 的苯甲基磺酰氟（PMSF，用丙三醇溶解）］，混勻至溶液變透明暗紅，于 4℃ 冰箱中放置 12 h 后離心 15 000 g，4℃，20 min，棄去離心管內的暗紅色上清液，將紅色絮狀沉淀重新懸于破膜液中離心15 000 g，4℃，30 min，重復洗滌 3 次，直至出現乳白色沉淀即為 RBCs 膜。所提得的膜中加入大約膜體積 4 倍的 2% 十二烷基硫酸鈉（SDS）進行裂解，超聲波破碎（冰浴，功率 20% 或 200 W，超聲 3 s，間隔 6 s，重復 10 次），BCA 法定量膜蛋白含量，–80℃ 凍存備用。
1.4 RBCs 氧化應激指標和能量代謝指標測定
酶聯免疫吸附劑測定法（ELISA）測定丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD），三磷酸腺苷（Na+-K+-ATP），2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG，南京建成生物，南京）具體步驟參照試劑說明書。
1.5 統計學分析
采用 SPSS13.0 軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（
）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析以及組間兩兩比較的 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
在對照組（0 μg/ml）中，術后 MDA 含量比術前含量顯著增加（P<0.05），術后 SOD、Na+-K+-ATP、2,3-DPG 較術前組顯著降低（P<0.05）。40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml 組術后 MDA 含量比術前組增加（P>0.05），SOD、Na+-K+-ATP、2,3-DPG 較術前組減少（P>0.05）。術前三個濃度組組間（40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml）與術后三個濃度組組間（40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml）MDA、SOD、Na+-K+-ATP、2,3-DPG 數值變化差異無統計學意義（P>0.05）。160 μg/ml 與其它所有濃度組相比，術前、術后 MDA 含量均增加，術前、術后 SOD、Na+-K+-ATP、2,3-DPG 均減少，差異有統計學意義（P<0.05，表 1）。
表1
Ozone 預處理對 RBCs 膜氧化/能量代謝指標的影響（
）
3 討論
AD 術后 HO 是心臟 CPB 手術圍術期常見的并發癥，研究[8]證實 CPB 術后 HO 發生率在 12.2%～27.1%，而 AD 術后則高達 51%。HO 延長機械通氣時間、住 ICU 時間和住院時間，增加患者花費和病死率[9]。臨床上解決 HO 的方法主要是通過增加氧的供給、減少氧的利用，改善肺功能、增加氧合等方式，其中最重要的環節就是增加氧的供給，改善肺部的氧合。
體內氧氣的運輸包括物理溶解和化學結合兩種形式。物理溶解約占血液運輸氧總量的 1.5%。化學結合的形式是氧合血紅蛋白，這是氧氣運輸的主要形式，占血液運輸氧總量的 98.5%。文獻[10-11]證實疾病狀態、手術應激、CPB 的非生理性異物界面接觸以及灌注模式都可以導致體內氧化應激反應的升高，繼而影響細胞膜表面能量代謝，Na+-K+-ATP 酶活性降低，鈉鉀泵功能失調，胞內 Ca+超載，RBCs 變硬、柔順度降低、變形性下降，形成球狀棘型細胞，此外，ATP 減少也不利于維持 RBCs 膜脂質的穩定及更新，脂酰化反應受損，細胞內溶血磷脂酰膽堿積聚，加上 pH 改變、RBCs 膜酶活性下降、能力耗竭等因素都會導致 RBCs 變形成棘球狀細胞、裂口 RBCs 等畸形 RBCs，細胞內陽離子通透性增高，最終導致細胞球形變和溶血的發生，嚴重影響了氧的運輸和代謝[12-13]。疾病本身（例如 AD 發病）與手術下的應激、CPB 非生理性特性會使術中、術后氧化應激水平升高、氧化反應增強[14-15]、組織器官發生氧自由基介導的缺血-再灌注損傷，這些因素會引起術后臟器功能不全（肺損傷、低氧血癥、腎功能不全等）[16]，尤其在 AD 這種創傷大、CPB 時間長的手術里，缺血-再灌注損傷等相關因素的低氧血癥就更加常見[1]。本研究證實了 AD 患者經歷 CPB 術后可以引起體內 RBCs 氧化應激水平的提高和能量代謝損傷，在未給 ozone 處理的 0 μg/ml 組中可以看出經歷 CPB 后氧化指標 MDA 從（7.55±1.04）nmol/mg prot 升高至（9.34±2.03）nmol/mg prot，抗氧化應激指標 SOD 從（13.39±2.19）U/L 降低至（11.13±1.22）U/L，能量代謝指標 Na+-K+-ATP 從（0.62±0.15）nmol/L 降至（0.47±0.08）nmol/L，2,3-DPG 從（2.28±0.27）U/mg prot 降至（2.01±0.24）U/mg prot。而適度的 ozone（40～80 μg/ml）處理可以減輕氧化應激損傷，增加 RBCs 的能量代謝，表現為 MDA 含量不同程度的下降，SOD、Na+-K+-ATP、2,3-DPG 不同程度的升高，但是該實驗沒有證實各個濃度組間（40～80 μg/ml）差異有統計學意義。這可能跟樣本量、CPB 時間等因素有關，還需要進一步研究證實。另外有文獻[17]認為中高濃度的超氧（60～80 μg/ml）會有負面影響，加重氧化反應或引起免疫抑制，但在本實驗中，未證實這一觀點。高濃度 160 μg/ml ozone 破壞作用明顯，會增加 MDA 的生成，降低 SOD 的含量，超過安全濃度的 ozone 具有破壞作用（P>0.05），不適合用于臨床干預，該實驗也印證了超氧協會以及相關研究對于臨床安全濃度的推薦[18]。由于 ozone 本身是一種強氧化劑，為了發揮其有效治療作用，應遵循安全濃度范圍，避免超量使用。臨床上使用 ozone 自體血療法時一般都是從小濃度開始（30 μg/ml），逐步增加到 40～50 μg/ml，為了安全起見國內目前使用的 ozone 治療機的最高濃度一般<60 μg/ml。
正常人 100 ml 動脈血中血紅蛋白結合的氧約為 19.5 ml。因此，加強攜氧能力，增加游離氧的溶解可以從另一個方面改善機體的供氧。Ozone 具有強大的氧溶解性，溶解度是氧氣的 10 倍，可以提供充足的氧飽和作用，另外還可以引起體內短暫的氧化應激反應增強，刺激體內抗氧化系統過度表達，多種氧自由基清除酶（谷胱甘肽過氧化氫酶、SOD 等）生成增加，清除過量的氧自由基，降低氧化應激反應，減輕細胞氧自由基導致的缺血-再灌注損傷[19]。此外，ozone 還可以通過激活細胞內能量代謝，增加 2,3-DPG 生成，激活三羧酸循環，使 ATP 的含量增加，從而增加 RBCs 攜氧量、促進血紅蛋白氧合曲線解離，降低氧的親合力，促進氧向細胞內擴散，增加外周組織供氧量，改善臟器缺血，例如腦梗死[20]。由于 ozone 的醫療效果與其濃度有密切等關系，并且對于改善臨床缺血缺氧性疾病最安全有效的使用方式是 ozone 自體血回輸法，因此只有體外超氧化血液安全、有效的前提下才能回輸超氧化血，因此本實驗著重解決濃度相關與氧化應激以及能量代謝的體外研究，為回輸超氧化血提供理論基礎。
本研究雖在體外實驗證實了 ozone 可以減輕 RBCs 氧化應激反應，增強 RBCs 的能量代謝，但由于是體外實驗，因此其是否真正可以減輕患者圍術期氧化應激反應，改善 RBC 攜氧能力還有待于進一步的體內實驗證實，但只有在證實體外超氧化血安全、有效的情況下才能回輸超氧化血到體內（ozone 是一種強氧化性氣體不能直接注入體內或者經氣道吸入），因此這部分實驗研究是十分必要的。
綜上所述，在 AD 患者血液體外實驗中，ozone 可以有效減輕 RBCs 的氧化應激反應，改善 AD 患者體外血液中 RBCs 膜的能量代謝，ozone 是安全、有效的，可以回輸到體內。
主動脈夾層（aortic dissection，AD）患者圍術期低氧血癥（hypoxemia，HO）是臨床常見的并發癥，可導致多臟器功能障礙，延長患者的住院時間和增加費用，是圍術期最主要的致死因素之一[1]。如何及早對 HO 進行干預，降低圍術期病死率是目前心外科研究領域中的重點和難點[2]。超氧（ozone，O3）又稱臭氧、三氧，由 3 個氧原子組成，氧化性更強，水溶性更高，溶解度是普通氧氣的 10 倍，更易溶于血液和組織液，提供更充足的氧化和氧飽和作用[3]。實驗研究[4-5]證實 ozone 可以增加血漿里溶解的氧含量、提高紅細胞（red blood cells，RBCs）代謝，增加 RBCs 內三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和 2,3 二磷酸甘油酸（2,3-bisphosphoglyceric acid，2,3-DPG）含量，使氧離曲線右移，增加組織供氧；激活 RBCs 的磷酸戊糖代謝途徑，增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）生成，有利于維持 RBCs 膜的完整性。另外 ozone 還可以誘導抗氧化酶的過度表達從而清除生理和病理過程中形成過多的自由基，減少氧化應激反應。另外根據國際超氧協會指南推薦和臨床文獻報告[6]，ozone 可用于缺血、缺氧性疾病的治療，通過超氧自體氧合血療法（ozonated autohemotherapy，ozone-AHT），即根據患者體重抽取一定量靜脈血到無菌袋中，加入 ozone 進行體外氧合，5～10 min 后回輸到患者體內，可以有效提高患者血液氧含量，改善缺血缺氧性疾病的預后。本研究的主要目的是對 AD 圍術期的血液進行不同濃度的 ozone 預處理，通過檢測 RBCs 氧化損傷以及能量代謝指標的變化，估測出安全 ozone-AHT 的臨床干預濃度范圍，為 AD 圍術期 HO 應用 ozone-AHT 提供前期實驗理論基礎。
1 材料與方法
1.1 血樣標本收集
收集哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 2016 年 3～8 月 20 例 AD 患者術前肝素化（術前組）、體外循環停機（術后組）肝素化靜脈血 20 ml 置入無菌袋中，4℃ 冰箱保存。其中男 16 例、女 4 例，平均年齡（48.51±10.21）歲。病例納入標準：（1）需要體外循環（cardiopulmonary bypass，CPB）手術的 AD 患者；（2）30～60 歲。排除標準：（1）血液系統疾病；（2）外周血管疾病；（3）糖尿病；（4）一年內有腦血栓、心肌梗死病史，一年內接受支架介入手術，近期接受過其它有創手術的患者；（5）孕婦；（6）肝腎功能不全、接受人工肝、血液透析的患者。手術團隊應用同一標準流程來減少手術、麻醉以及 CPB 帶來的選擇性偏倚。本研究經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準（編號：201751），并獲得患者知情同意。
1.2 樣本超氧化處理
將術前、術后采集的 20 ml 靜脈血按照不同濃度組（0 μg/ml，40 μg/ml，60 μg/ml，80 μg/ml，160 μg/ml）分別置入不同的無菌袋中，ozone 來源于醫用 ozone 治療儀（HUMARES，Bruchsal，德國），根據實驗要求調制相應 ozone 濃度（40 μg/ml，60 μg/ml，80 μg/ml，160 μg/ml），本實驗濃度的選擇依據國際超氧協會推薦（在 ozone-AHT 療法中 40～80 μg/ml 的濃度為常用安全有效濃度）以及發表的文獻[4-5, 7]，按照 1∶1（1 ml 血∶1 ml 氣體）將 ozone 注入相應的血液樣本袋中，緩慢（40～60 次/min）順時針旋轉約 10 min，待氣體與血液充分反應完全。由于 ozone 反應非常迅速，為了獲得可靠的實驗結果，操作需要精細，注入氣體應緩慢，旋轉應勻速緩慢，避免過度搖晃產生氣泡導致血液破壞，加重溶血。樣本反應完畢，將血液緩慢抽出注入試管中，3 000 r/min 離心，將血漿和 RBCs 分離，分離后的 RBCs 用于制備提取 RBCs 膜蛋白。
1.3 RBCs 膜蛋白提取制備
分離后的紅細胞 1∶3 加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS，0.01 M，pH=7.40）3 000 r/min 洗滌 3 次，然后取 1 ml 洗滌壓積 RBCs 直接溶于 40 倍體積預冷的破膜液中［低滲 Tris-HCl（0.01 M，pH=8.0），內含 0.02 mM 的苯甲基磺酰氟（PMSF，用丙三醇溶解）］，混勻至溶液變透明暗紅，于 4℃ 冰箱中放置 12 h 后離心 15 000 g，4℃，20 min，棄去離心管內的暗紅色上清液，將紅色絮狀沉淀重新懸于破膜液中離心15 000 g，4℃，30 min，重復洗滌 3 次，直至出現乳白色沉淀即為 RBCs 膜。所提得的膜中加入大約膜體積 4 倍的 2% 十二烷基硫酸鈉（SDS）進行裂解，超聲波破碎（冰浴，功率 20% 或 200 W，超聲 3 s，間隔 6 s，重復 10 次），BCA 法定量膜蛋白含量，–80℃ 凍存備用。
1.4 RBCs 氧化應激指標和能量代謝指標測定
酶聯免疫吸附劑測定法（ELISA）測定丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD），三磷酸腺苷（Na+-K+-ATP），2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG，南京建成生物，南京）具體步驟參照試劑說明書。
1.5 統計學分析
采用 SPSS13.0 軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析以及組間兩兩比較的 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
在對照組（0 μg/ml）中，術后 MDA 含量比術前含量顯著增加（P<0.05），術后 SOD、Na+-K+-ATP、2,3-DPG 較術前組顯著降低（P<0.05）。40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml 組術后 MDA 含量比術前組增加（P>0.05），SOD、Na+-K+-ATP、2,3-DPG 較術前組減少（P>0.05）。術前三個濃度組組間（40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml）與術后三個濃度組組間（40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml）MDA、SOD、Na+-K+-ATP、2,3-DPG 數值變化差異無統計學意義（P>0.05）。160 μg/ml 與其它所有濃度組相比，術前、術后 MDA 含量均增加，術前、術后 SOD、Na+-K+-ATP、2,3-DPG 均減少，差異有統計學意義（P<0.05，表 1）。
表1
Ozone 預處理對 RBCs 膜氧化/能量代謝指標的影響（）
3 討論
AD 術后 HO 是心臟 CPB 手術圍術期常見的并發癥，研究[8]證實 CPB 術后 HO 發生率在 12.2%～27.1%，而 AD 術后則高達 51%。HO 延長機械通氣時間、住 ICU 時間和住院時間，增加患者花費和病死率[9]。臨床上解決 HO 的方法主要是通過增加氧的供給、減少氧的利用，改善肺功能、增加氧合等方式，其中最重要的環節就是增加氧的供給，改善肺部的氧合。
體內氧氣的運輸包括物理溶解和化學結合兩種形式。物理溶解約占血液運輸氧總量的 1.5%。化學結合的形式是氧合血紅蛋白，這是氧氣運輸的主要形式，占血液運輸氧總量的 98.5%。文獻[10-11]證實疾病狀態、手術應激、CPB 的非生理性異物界面接觸以及灌注模式都可以導致體內氧化應激反應的升高，繼而影響細胞膜表面能量代謝，Na+-K+-ATP 酶活性降低，鈉鉀泵功能失調，胞內 Ca+超載，RBCs 變硬、柔順度降低、變形性下降，形成球狀棘型細胞，此外，ATP 減少也不利于維持 RBCs 膜脂質的穩定及更新，脂酰化反應受損，細胞內溶血磷脂酰膽堿積聚，加上 pH 改變、RBCs 膜酶活性下降、能力耗竭等因素都會導致 RBCs 變形成棘球狀細胞、裂口 RBCs 等畸形 RBCs，細胞內陽離子通透性增高，最終導致細胞球形變和溶血的發生，嚴重影響了氧的運輸和代謝[12-13]。疾病本身（例如 AD 發病）與手術下的應激、CPB 非生理性特性會使術中、術后氧化應激水平升高、氧化反應增強[14-15]、組織器官發生氧自由基介導的缺血-再灌注損傷，這些因素會引起術后臟器功能不全（肺損傷、低氧血癥、腎功能不全等）[16]，尤其在 AD 這種創傷大、CPB 時間長的手術里，缺血-再灌注損傷等相關因素的低氧血癥就更加常見[1]。本研究證實了 AD 患者經歷 CPB 術后可以引起體內 RBCs 氧化應激水平的提高和能量代謝損傷，在未給 ozone 處理的 0 μg/ml 組中可以看出經歷 CPB 后氧化指標 MDA 從（7.55±1.04）nmol/mg prot 升高至（9.34±2.03）nmol/mg prot，抗氧化應激指標 SOD 從（13.39±2.19）U/L 降低至（11.13±1.22）U/L，能量代謝指標 Na+-K+-ATP 從（0.62±0.15）nmol/L 降至（0.47±0.08）nmol/L，2,3-DPG 從（2.28±0.27）U/mg prot 降至（2.01±0.24）U/mg prot。而適度的 ozone（40～80 μg/ml）處理可以減輕氧化應激損傷，增加 RBCs 的能量代謝，表現為 MDA 含量不同程度的下降，SOD、Na+-K+-ATP、2,3-DPG 不同程度的升高，但是該實驗沒有證實各個濃度組間（40～80 μg/ml）差異有統計學意義。這可能跟樣本量、CPB 時間等因素有關，還需要進一步研究證實。另外有文獻[17]認為中高濃度的超氧（60～80 μg/ml）會有負面影響，加重氧化反應或引起免疫抑制，但在本實驗中，未證實這一觀點。高濃度 160 μg/ml ozone 破壞作用明顯，會增加 MDA 的生成，降低 SOD 的含量，超過安全濃度的 ozone 具有破壞作用（P>0.05），不適合用于臨床干預，該實驗也印證了超氧協會以及相關研究對于臨床安全濃度的推薦[18]。由于 ozone 本身是一種強氧化劑，為了發揮其有效治療作用，應遵循安全濃度范圍，避免超量使用。臨床上使用 ozone 自體血療法時一般都是從小濃度開始（30 μg/ml），逐步增加到 40～50 μg/ml，為了安全起見國內目前使用的 ozone 治療機的最高濃度一般<60 μg/ml。
正常人 100 ml 動脈血中血紅蛋白結合的氧約為 19.5 ml。因此，加強攜氧能力，增加游離氧的溶解可以從另一個方面改善機體的供氧。Ozone 具有強大的氧溶解性，溶解度是氧氣的 10 倍，可以提供充足的氧飽和作用，另外還可以引起體內短暫的氧化應激反應增強，刺激體內抗氧化系統過度表達，多種氧自由基清除酶（谷胱甘肽過氧化氫酶、SOD 等）生成增加，清除過量的氧自由基，降低氧化應激反應，減輕細胞氧自由基導致的缺血-再灌注損傷[19]。此外，ozone 還可以通過激活細胞內能量代謝，增加 2,3-DPG 生成，激活三羧酸循環，使 ATP 的含量增加，從而增加 RBCs 攜氧量、促進血紅蛋白氧合曲線解離，降低氧的親合力，促進氧向細胞內擴散，增加外周組織供氧量，改善臟器缺血，例如腦梗死[20]。由于 ozone 的醫療效果與其濃度有密切等關系，并且對于改善臨床缺血缺氧性疾病最安全有效的使用方式是 ozone 自體血回輸法，因此只有體外超氧化血液安全、有效的前提下才能回輸超氧化血，因此本實驗著重解決濃度相關與氧化應激以及能量代謝的體外研究，為回輸超氧化血提供理論基礎。
本研究雖在體外實驗證實了 ozone 可以減輕 RBCs 氧化應激反應，增強 RBCs 的能量代謝，但由于是體外實驗，因此其是否真正可以減輕患者圍術期氧化應激反應，改善 RBC 攜氧能力還有待于進一步的體內實驗證實，但只有在證實體外超氧化血安全、有效的情況下才能回輸超氧化血到體內（ozone 是一種強氧化性氣體不能直接注入體內或者經氣道吸入），因此這部分實驗研究是十分必要的。
綜上所述，在 AD 患者血液體外實驗中，ozone 可以有效減輕 RBCs 的氧化應激反應，改善 AD 患者體外血液中 RBCs 膜的能量代謝，ozone 是安全、有效的，可以回輸到體內。
