引用本文： 李斌, 宋鐵牛, 蔣鵬, 楊建寶, 朱多杰, 藺軍平, 馮海明, 敬濤. DDX46 基因對裸鼠食管鱗癌移植瘤生長的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2019, 26(2): 169-174. doi: 10.7507/1007-4848.201807008 復制
目前大多數抗腫瘤藥物作用機理是靶向腫瘤細胞的 DNA 或蛋白質，而新近 Lee 等[1]研究發現：DNA 和蛋白質之間的中介物質 mRNA 可能是全新的靶點。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成員，在 mRNA 前體剪接和核糖體組裝中發揮核心作用[2-3]。DDX46 在多種人類惡性腫瘤組織如結腸腺癌[4]、骨肉瘤[5]、膀胱癌[6]等高表達，提示其可能是一個新的癌基因，參與腫瘤的發生和發展。我們前期研究發現 DDX46 在食管鱗癌組織中異常高表達，利用 shRNA 抑制 DDX46 表達能降低食管鱗癌 Eca-109 細胞增殖，并誘導細胞凋亡[7-8]，表明 DDX46 表達上調可能參與食管鱗癌細胞的惡性行為。但目前這些研究均停留在體外細胞水平，DDX46 對活體動物食管鱗癌的作用尚不清楚。本研究利用裸鼠皮下移植瘤動物模型和活體成像技術，觀察 DDX46 表達降低后裸鼠移植瘤的生長變化，在活體動物模型中進一步研究 DDX46 在食管鱗癌發生發展中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 主要實驗儀器和試劑
小動物活體成像系統（Perkin Elmer）。RNAlater（Qiagen）、Trizol 試劑（Invitrogen）、胎牛血清（Ausbian）、胰蛋白酶（上海生工）、M-MLV 逆轉錄酶（Promega）、Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer Set（廣州銳博）、SYBR premix ex taq（TaKaRa）、PCR 擴增試劑盒（TaKaRa）、dNTPs（Promega）、EDTA（上海生工）、Primer（廣州銳博）、Lipofectamine 2000 轉染試劑（Invitrogen）、RPMI-1640 細胞培養基（Lonza）、BulletKit 內皮細胞培養基（Lonza）、DDX46 抗體（Abcam）、GAPDH 抗體（Sigma）、Caspase-3 抗體（Santa Cruz）、PARP-1 抗體（Santa Cruz）、ECL Western blotting Substrate 試劑盒（Thermo Fisher Scientific）、戊巴比妥鈉（Sigma）。
1.1.2 細胞培養
人食管鱗癌細胞 Eca-109 購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，人永生化食管鱗狀上皮細胞 Het-1A 購于上海拜力生物科技有限公司。通過慢病毒載體構建獲得 DDX46 基因沉默的慢病毒顆粒（實驗組：DDX46-shRNA-LV）及空載體慢病毒顆粒（對照組：Control-LV），分別感染食管鱗癌 Eca-109 細胞株。Eca-109 細胞培養于 RPMI-1640 培養液中，Het-1A（空白對照組）培養于 BulletKit 內皮細胞培養基中，均置于 37℃、5% CO2 培養箱內。取對數生長期細胞接種裸鼠。
1.1.3 實驗動物
4 周齡健康雌性 BALB/c 裸鼠 25 只，購自上海靈暢生物科技有限公司［許可證號碼：SCXK（滬）2013-0018］，在 SPF 級環境飼養。
1.2 實驗方法
1.2.1 DDX46-shRNA 慢病毒載體制備和包裝
DDX46 基因 RNAi 靶點序列和 shRNA 慢病毒載體制備和包裝由上海吉凱基因化學技術有限公司設計完成，DDX46 基因 shRNA 序列：5'-AGAAATCACCAGGCTCATA-3'，陰性對照序列應用公認序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'[9]。
1.2.2 qRT-PCR 檢測 Eca-109 細胞 DDX46 基因的敲減效率
感染后 72 h，熒光顯微鏡觀察報告基因綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，熒光率即為陽性感染率，細胞感染效率達到 70% 以上者可以繼續下游實驗。收集目的細胞，用 2 000 rpm 離心 5 min 后，棄去上清液，沉淀的細胞中加入 Trizol 裂解液 1 ml，充分混勻后靜置于室溫下 5 min，然后轉移至 1.5 ml EP 管中，完成細胞樣本 Trizol 裂解。依據 Invitrogen 公司 Trizol 操作說明書完成總 RNA 抽提。依據 Promega 公司 M-MLV 操作說明書逆轉錄 RNA 獲得 cDNA。以 GAPDH 基因為內參，兩步法進行 qRT-PCR，2-??Ct法計算 DDX46 基因 mRNA 的相對表達量（?Ct=目的基因 Ct 值－內參基因 Ct 值；??Ct=實驗組?Ct 值－對照組?Ct 平均值）。實驗重復 3 次。
1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的建立
慢病毒感染食管鱗癌 Eca-109 細胞 144 h 后進行裸鼠接種，接種前 1 d 將各實驗組成瘤細胞胰蛋白酶消化，以保證第 2 d 接種的細胞處于對數生長期，完全培養基重懸成細胞懸液。Control-LV 組和 DDX46-shRNA-LV 組各 10 只 BALB/c 裸鼠，每只 4×106 個成瘤細胞皮下注射至右前肢腋下；Het-1A 組 5 只，每只裸鼠每側 4×106 個成瘤細胞分別皮下注射至雙側前肢腋下。
1.2.4 檢測成瘤情況
接種 14 d 后裸鼠稱重，游標卡尺測量移植瘤大小（長徑、短徑，單位：mm），計算瘤體體積（π/6?×長徑×短徑×短徑）。每周 2 次，連續 3 周。按 10 μl/g 腹腔注射 0.7% 戊巴比妥鈉麻醉動物，食指輕輕按壓動物胸口，測試心跳以保證動物處在成活狀態，將其放置于活體成像儀下進行成像，觀察熒光，保存數據。接種 31 d，腹腔注射麻醉后頸椎脫位處死實驗動物，取出腫瘤，測量瘤體大小并稱重，液氮冷凍后–80℃ 冰箱保存。
1.2.5 Western blotting 檢測
取 20 mg 移植瘤組織，加入 100 μl 蛋白裂解液，裂解 30 min，勻漿后 4℃、12 000 rpm 離心 30 min，完成細胞總蛋白抽提。取上清 BCA 法測定蛋白濃度。按每孔上樣量 20 μg 進行 SDS-PAGE 電泳，4℃ 穩壓將蛋白電轉移至硝酸纖維素（PVDF）膜上，封閉液室溫封閉 PVDF 膜 2 h；封閉液稀釋一抗（anti-DDX46 稀釋度 1∶200，anti-Caspase-3 稀釋度 1∶1 000，anti-PARP-1 稀釋度 1∶1 000，anti-GAPDH 稀釋度 1∶2 000），然后稀釋的一抗孵育封閉好的 PVDF 膜 4℃ 過夜，TBST 液洗膜 3 次，每次 10 min；封閉液稀釋相應的二抗（稀釋度 1∶2 000），然后稀釋的二抗室溫下孵育 PVDF 膜 2 h，TBST 液再洗膜 3 次，每次 10 min；按照 ECL Western blotting Substrate 試劑盒說明書完成 X 線顯影，晾干后用凝膠成像處理系統掃描拍照，進行灰度值分析。
1.3 統計學分析
應用 SPSS19.0 統計軟件分析數據，計量資料用均數±標準差（
）表示，組間比較采用 t 檢驗。計數資料以率表示，組間比較采用 χ2 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結 果
2.1 DDX46-shRNA 慢病毒有效抑制 DDX46 基因的表達
慢病毒感染 72 h 后，熒光顯微鏡觀察目的細胞 GFP 的表達情況，100 倍視野計數各組熒光細胞和總細胞數，熒光細胞占比即為陽性感染率，本實驗細胞感染效率達到 80% 以上。經 DDX46-shRNA 慢病毒感染后，qRT-PCR 檢測結果顯示，Eca-109 細胞 DDX46 基因 mRNA 的表達受到顯著抑制（圖 1，P<0.01），算得敲減效率達到 90.3%。
圖1
熒光顯微鏡觀察慢病毒目的細胞感染率（×100），qRT-PCR 檢測 DDX46 基因敲減效率（** P < 0.01）
2.2 沉默 DDX46 基因抑制裸鼠成瘤（瘤體測量）
成瘤細胞接種 14 d 后測量移植瘤長徑和短徑，計算瘤體體積，共計 6 個檢測時點，結果顯示：Control-LV 組在第 1 檢測時點（接種 14 d）已有 5 只裸鼠成瘤，而 DDX46-shRNA-LV 組此時無成瘤裸鼠；Control-LV 組在第 2 檢測時點（接種 17 d）已全部裸鼠成瘤，而 DDX46-shRNA-LV 組在此時只有 5 只裸鼠成瘤；DDX46-shRNA-LV 組在第 5 檢測時點（接種 28 d）仍有 1 只裸鼠未成瘤，到第 6 檢測時點才完成本組全部裸鼠成瘤。繪制各組目的細胞移植瘤體積增長曲線（圖 2）。接種 31 d，腹腔注射麻醉后頸椎脫位處死裸鼠，醫用剪刀和鑷子取出移植瘤稱重，DDX46-shRNA-LV 組瘤體重量較 Control-LV 組顯著減輕［（0.335±0.186）g vs.（0.713±0.198）g，P<0.001］。沉默 DDX46 基因使得裸鼠移植瘤生長明顯減緩（圖 3）。
圖2
裸鼠移植瘤體積增長曲線（*** P < 0.001）
圖3
裸鼠移植瘤平均重量比較（*** P < 0.001）
2.3 沉默 DDX46 基因抑制裸鼠成瘤（活體小動物成像）
腹腔注射 0.7% 戊巴比妥鈉麻醉各組實驗動物，將其放置于活體成像儀下進行成像，觀察熒光，DDX46-shRNA-LV 組熒光區總熒光表達量和平均熒光表達量均明顯低于 Control-LV 組（圖 4，P<0.001），說明 RNAi 沉默 DDX46 基因顯著抑制 Eca-109 細胞裸鼠成瘤。
圖4
小動物活體成像圖
2.4 接種 Het-1A 細胞無裸鼠成瘤
Het-1A 細胞懸液每側 4×106 個細胞量分別雙側前肢腋下皮下注射接種裸鼠，觀察 31 d，裸鼠無移植瘤生長（圖 5）。
圖5
熒光顯微鏡觀察目的細胞（×100），接種 Het-1A 細胞裸鼠不成瘤
2.5 Western blotting 檢測結果
沉默 DDX46 基因后，Western blotting 檢測移植瘤組織 DDX46 蛋白和凋亡信號通路關鍵分子的表達水平，結果見圖 6，灰度分析結果顯示：DDX46蛋白表達水平顯著下降，而 cleaved Caspase-3 和 cleaved PARP-1 蛋白表達水平顯著上調（P<0.01），提示沉默 DDX46 基因可激活細胞凋亡信號轉導通路。
圖6
沉默 DDX46 基因后 Western blotting 檢測 DDX46 和細胞凋亡標志蛋白的表達情況
3 討 論
食管癌是極具中國特色的疾病，世界近 60% 的食管癌發生在中國，居我國所有惡性腫瘤死亡率第 4 位[10]。我國食管癌的組織學類型 90% 以上為鱗癌，對于食管鱗癌的治療雖有手術、化療、放療及其他輔助療法，但其遠期療效很不理想，嚴重威脅國人健康[10-11]。食管鱗癌靶向治療的相關研究尚處于萌芽階段，目前許多靶向藥物的相關研究多針對胃-食管連接部腺癌開展，這些研究結果對于食管鱗癌是否適合尚不清楚[12]。
近年來 RNA 在生命系統中的重要性備受關注，涉及 RNA 的生物進程需要 RNA 解旋酶，RNA 解旋酶利用三磷酸腺苷（ATP）水解產生的能量實現 RNA 解旋或核糖核蛋白結構重組，幾乎參與了 RNA 代謝的所有環節[13-14]。RNA 解旋酶可以通過改變癌基因表達水平、基因突變或者參入腫瘤啟動和進展相關信號轉導通路、調控腫瘤耐藥基因的表達，參與腫瘤的發生發展[15]。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成員，人類 DDX46 基因位于染色體 5q31.1，有 26 個外顯子，編碼的 DDX46 蛋白分子量為 131 kDa[16]。我們前期研究發現 DDX46 蛋白表達主要定位于細胞核，食管鱗癌組織中的表達明顯高于相對應食管正常組織[7]，與人正常食管上皮細胞 Het-1A 相比，食管鱗癌細胞 Eca-109 中 DDX46 基因 mRNA 的表達顯著上調，抑制 DDX46 表達能降低食管鱗癌 Eca-109 細胞增殖，阻滯細胞周期于 G0/G1 期，并誘導細胞凋亡[8]。目前尚未見 DDX46 與裸鼠成瘤的相關報道。動物實驗更能模擬人類的生理和病理條件，獲得的實驗數據更具有說服力。本實驗在前期研究的基礎上，選用 DDX46 高表達的食管鱗癌細胞株 Eca-109，采用 RNAi 技術沉默 Eca-109 細胞中 DDX46 基因的表達，以 BALB/c 裸鼠為移植瘤載體，通過皮下注射腫瘤細胞使其成瘤，觀察 DDX46 表達降低對裸鼠移植瘤生長的影響，在體內環境中進一步驗證 DDX46 在食管鱗癌發生發展中的作用。結果表明 DDX46 表達降低后移植瘤生長明顯減慢，提示降低 DDX46 表達可以抑制食管鱗癌的生長，證實 DDX46 參與食管鱗癌的發生發展過程。
為闡明其可能的作用機制，本實驗應用 Western blotting 檢測移植瘤組織中細胞凋亡信號通路關鍵分子的變化，發現沉默 DDX46 基因后，移植瘤 DDX46 蛋白表達水平明顯下調，而 cleaved Caspase-3 和 cleaved PARP-1 蛋白表達水平顯著上調。Caspase-3 是參與細胞凋亡的關鍵執行分子，在凋亡信號轉導的許多途徑中發揮功能，正常以無活性的酶原形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡[17]。PARP 是存在于多數真核細胞中的一個多功能蛋白質翻譯后修飾酶，在 DNA 損傷修復與細胞凋亡中發揮著重要作用。PARP 在體外可以被多種 Caspase 剪切，在體內是 Caspase-3 的主要剪切對象。因此，PARP 剪切被認為是細胞凋亡的一個重要指標，也通常被認為是 Caspase-3 激活的指標[18]。體內裸鼠成瘤實驗證實降低 DDX46 表達可激活細胞凋亡信號通路，抑制食管鱗癌細胞增殖，結果與之前體外細胞實驗一致[8]。
Lee 等[1]研究發現，mRNA 中有一小部分編碼一些與腫瘤有某種聯系的蛋白質，并且這些 mRNA 攜帶獨特標記，能結合到 eIF3 開啟或者關閉 mRNA 翻譯，從而調節核糖體內蛋白質翻譯，這使得 mRNA 上的結合位點成為了一種很有前景的藥物靶標。RNA 解旋酶 DDX46 在 mRNA 前體剪接和核糖體組裝中發揮核心作用[2-3]，其表達的異常必然影響選擇性剪切過程。Zhang 等[19]研究發現肺腺癌中 SMC4 和 DDX46 的 mRNA 表達水平顯著正相關，SMC4 和 DDX46 在細胞周期各個時相均存在共定位，SMC4 可能通過與 DDX46 相互作用影響選擇性剪切，進而導致腫瘤的發生。Zheng 等[20]研究發現，DDX46 能結合到抗病毒效應分子 mRNA 的 CCGGUU 保守基序上，當病毒感染時 DDX46 與 m6A 去甲基化酶 ALKBH5 結合增加，使得與 DDX46 結合的抗病毒效應分子 mRNA 發生去甲基化修飾而導致其核滯留，阻滯了這些抗病毒效應分子的蛋白表達從而降低干擾素產生，最終抑制了抗病毒天然免疫應答反應。
綜上所述，DDX46 的表達水平與食管鱗癌的生長密切相關，沉默 DDX46 基因可顯著抑制食管鱗癌細胞裸鼠移植瘤的生長，其機制可能是通過激活細胞凋亡信號通路，進而發揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用。DDX46 是否通過細胞核內 RNA 修飾的方式參與調控食管鱗癌發生發展還有待進一步研究證實。
目前大多數抗腫瘤藥物作用機理是靶向腫瘤細胞的 DNA 或蛋白質，而新近 Lee 等[1]研究發現：DNA 和蛋白質之間的中介物質 mRNA 可能是全新的靶點。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成員，在 mRNA 前體剪接和核糖體組裝中發揮核心作用[2-3]。DDX46 在多種人類惡性腫瘤組織如結腸腺癌[4]、骨肉瘤[5]、膀胱癌[6]等高表達，提示其可能是一個新的癌基因，參與腫瘤的發生和發展。我們前期研究發現 DDX46 在食管鱗癌組織中異常高表達，利用 shRNA 抑制 DDX46 表達能降低食管鱗癌 Eca-109 細胞增殖，并誘導細胞凋亡[7-8]，表明 DDX46 表達上調可能參與食管鱗癌細胞的惡性行為。但目前這些研究均停留在體外細胞水平，DDX46 對活體動物食管鱗癌的作用尚不清楚。本研究利用裸鼠皮下移植瘤動物模型和活體成像技術，觀察 DDX46 表達降低后裸鼠移植瘤的生長變化，在活體動物模型中進一步研究 DDX46 在食管鱗癌發生發展中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 主要實驗儀器和試劑
小動物活體成像系統（Perkin Elmer）。RNAlater（Qiagen）、Trizol 試劑（Invitrogen）、胎牛血清（Ausbian）、胰蛋白酶（上海生工）、M-MLV 逆轉錄酶（Promega）、Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer Set（廣州銳博）、SYBR premix ex taq（TaKaRa）、PCR 擴增試劑盒（TaKaRa）、dNTPs（Promega）、EDTA（上海生工）、Primer（廣州銳博）、Lipofectamine 2000 轉染試劑（Invitrogen）、RPMI-1640 細胞培養基（Lonza）、BulletKit 內皮細胞培養基（Lonza）、DDX46 抗體（Abcam）、GAPDH 抗體（Sigma）、Caspase-3 抗體（Santa Cruz）、PARP-1 抗體（Santa Cruz）、ECL Western blotting Substrate 試劑盒（Thermo Fisher Scientific）、戊巴比妥鈉（Sigma）。
1.1.2 細胞培養
人食管鱗癌細胞 Eca-109 購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，人永生化食管鱗狀上皮細胞 Het-1A 購于上海拜力生物科技有限公司。通過慢病毒載體構建獲得 DDX46 基因沉默的慢病毒顆粒（實驗組：DDX46-shRNA-LV）及空載體慢病毒顆粒（對照組：Control-LV），分別感染食管鱗癌 Eca-109 細胞株。Eca-109 細胞培養于 RPMI-1640 培養液中，Het-1A（空白對照組）培養于 BulletKit 內皮細胞培養基中，均置于 37℃、5% CO2 培養箱內。取對數生長期細胞接種裸鼠。
1.1.3 實驗動物
4 周齡健康雌性 BALB/c 裸鼠 25 只，購自上海靈暢生物科技有限公司［許可證號碼：SCXK（滬）2013-0018］，在 SPF 級環境飼養。
1.2 實驗方法
1.2.1 DDX46-shRNA 慢病毒載體制備和包裝
DDX46 基因 RNAi 靶點序列和 shRNA 慢病毒載體制備和包裝由上海吉凱基因化學技術有限公司設計完成，DDX46 基因 shRNA 序列：5'-AGAAATCACCAGGCTCATA-3'，陰性對照序列應用公認序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'[9]。
1.2.2 qRT-PCR 檢測 Eca-109 細胞 DDX46 基因的敲減效率
感染后 72 h，熒光顯微鏡觀察報告基因綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，熒光率即為陽性感染率，細胞感染效率達到 70% 以上者可以繼續下游實驗。收集目的細胞，用 2 000 rpm 離心 5 min 后，棄去上清液，沉淀的細胞中加入 Trizol 裂解液 1 ml，充分混勻后靜置于室溫下 5 min，然后轉移至 1.5 ml EP 管中，完成細胞樣本 Trizol 裂解。依據 Invitrogen 公司 Trizol 操作說明書完成總 RNA 抽提。依據 Promega 公司 M-MLV 操作說明書逆轉錄 RNA 獲得 cDNA。以 GAPDH 基因為內參，兩步法進行 qRT-PCR，2-??Ct法計算 DDX46 基因 mRNA 的相對表達量（?Ct=目的基因 Ct 值－內參基因 Ct 值；??Ct=實驗組?Ct 值－對照組?Ct 平均值）。實驗重復 3 次。
1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的建立
慢病毒感染食管鱗癌 Eca-109 細胞 144 h 后進行裸鼠接種，接種前 1 d 將各實驗組成瘤細胞胰蛋白酶消化，以保證第 2 d 接種的細胞處于對數生長期，完全培養基重懸成細胞懸液。Control-LV 組和 DDX46-shRNA-LV 組各 10 只 BALB/c 裸鼠，每只 4×106 個成瘤細胞皮下注射至右前肢腋下；Het-1A 組 5 只，每只裸鼠每側 4×106 個成瘤細胞分別皮下注射至雙側前肢腋下。
1.2.4 檢測成瘤情況
接種 14 d 后裸鼠稱重，游標卡尺測量移植瘤大小（長徑、短徑，單位：mm），計算瘤體體積（π/6?×長徑×短徑×短徑）。每周 2 次，連續 3 周。按 10 μl/g 腹腔注射 0.7% 戊巴比妥鈉麻醉動物，食指輕輕按壓動物胸口，測試心跳以保證動物處在成活狀態，將其放置于活體成像儀下進行成像，觀察熒光，保存數據。接種 31 d，腹腔注射麻醉后頸椎脫位處死實驗動物，取出腫瘤，測量瘤體大小并稱重，液氮冷凍后–80℃ 冰箱保存。
1.2.5 Western blotting 檢測
取 20 mg 移植瘤組織，加入 100 μl 蛋白裂解液，裂解 30 min，勻漿后 4℃、12 000 rpm 離心 30 min，完成細胞總蛋白抽提。取上清 BCA 法測定蛋白濃度。按每孔上樣量 20 μg 進行 SDS-PAGE 電泳，4℃ 穩壓將蛋白電轉移至硝酸纖維素（PVDF）膜上，封閉液室溫封閉 PVDF 膜 2 h；封閉液稀釋一抗（anti-DDX46 稀釋度 1∶200，anti-Caspase-3 稀釋度 1∶1 000，anti-PARP-1 稀釋度 1∶1 000，anti-GAPDH 稀釋度 1∶2 000），然后稀釋的一抗孵育封閉好的 PVDF 膜 4℃ 過夜，TBST 液洗膜 3 次，每次 10 min；封閉液稀釋相應的二抗（稀釋度 1∶2 000），然后稀釋的二抗室溫下孵育 PVDF 膜 2 h，TBST 液再洗膜 3 次，每次 10 min；按照 ECL Western blotting Substrate 試劑盒說明書完成 X 線顯影，晾干后用凝膠成像處理系統掃描拍照，進行灰度值分析。
1.3 統計學分析
應用 SPSS19.0 統計軟件分析數據，計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用 t 檢驗。計數資料以率表示，組間比較采用 χ2 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結 果
2.1 DDX46-shRNA 慢病毒有效抑制 DDX46 基因的表達
慢病毒感染 72 h 后，熒光顯微鏡觀察目的細胞 GFP 的表達情況，100 倍視野計數各組熒光細胞和總細胞數，熒光細胞占比即為陽性感染率，本實驗細胞感染效率達到 80% 以上。經 DDX46-shRNA 慢病毒感染后，qRT-PCR 檢測結果顯示，Eca-109 細胞 DDX46 基因 mRNA 的表達受到顯著抑制（圖 1，P<0.01），算得敲減效率達到 90.3%。
圖1
熒光顯微鏡觀察慢病毒目的細胞感染率（×100），qRT-PCR 檢測 DDX46 基因敲減效率（** P < 0.01）
2.2 沉默 DDX46 基因抑制裸鼠成瘤（瘤體測量）
成瘤細胞接種 14 d 后測量移植瘤長徑和短徑，計算瘤體體積，共計 6 個檢測時點，結果顯示：Control-LV 組在第 1 檢測時點（接種 14 d）已有 5 只裸鼠成瘤，而 DDX46-shRNA-LV 組此時無成瘤裸鼠；Control-LV 組在第 2 檢測時點（接種 17 d）已全部裸鼠成瘤，而 DDX46-shRNA-LV 組在此時只有 5 只裸鼠成瘤；DDX46-shRNA-LV 組在第 5 檢測時點（接種 28 d）仍有 1 只裸鼠未成瘤，到第 6 檢測時點才完成本組全部裸鼠成瘤。繪制各組目的細胞移植瘤體積增長曲線（圖 2）。接種 31 d，腹腔注射麻醉后頸椎脫位處死裸鼠，醫用剪刀和鑷子取出移植瘤稱重，DDX46-shRNA-LV 組瘤體重量較 Control-LV 組顯著減輕［（0.335±0.186）g vs.（0.713±0.198）g，P<0.001］。沉默 DDX46 基因使得裸鼠移植瘤生長明顯減緩（圖 3）。
圖2
裸鼠移植瘤體積增長曲線（*** P < 0.001）
圖3
裸鼠移植瘤平均重量比較（*** P < 0.001）
2.3 沉默 DDX46 基因抑制裸鼠成瘤（活體小動物成像）
腹腔注射 0.7% 戊巴比妥鈉麻醉各組實驗動物，將其放置于活體成像儀下進行成像，觀察熒光，DDX46-shRNA-LV 組熒光區總熒光表達量和平均熒光表達量均明顯低于 Control-LV 組（圖 4，P<0.001），說明 RNAi 沉默 DDX46 基因顯著抑制 Eca-109 細胞裸鼠成瘤。
圖4
小動物活體成像圖
2.4 接種 Het-1A 細胞無裸鼠成瘤
Het-1A 細胞懸液每側 4×106 個細胞量分別雙側前肢腋下皮下注射接種裸鼠，觀察 31 d，裸鼠無移植瘤生長（圖 5）。
圖5
熒光顯微鏡觀察目的細胞（×100），接種 Het-1A 細胞裸鼠不成瘤
2.5 Western blotting 檢測結果
沉默 DDX46 基因后，Western blotting 檢測移植瘤組織 DDX46 蛋白和凋亡信號通路關鍵分子的表達水平，結果見圖 6，灰度分析結果顯示：DDX46蛋白表達水平顯著下降，而 cleaved Caspase-3 和 cleaved PARP-1 蛋白表達水平顯著上調（P<0.01），提示沉默 DDX46 基因可激活細胞凋亡信號轉導通路。
圖6
沉默 DDX46 基因后 Western blotting 檢測 DDX46 和細胞凋亡標志蛋白的表達情況
3 討 論
食管癌是極具中國特色的疾病，世界近 60% 的食管癌發生在中國，居我國所有惡性腫瘤死亡率第 4 位[10]。我國食管癌的組織學類型 90% 以上為鱗癌，對于食管鱗癌的治療雖有手術、化療、放療及其他輔助療法，但其遠期療效很不理想，嚴重威脅國人健康[10-11]。食管鱗癌靶向治療的相關研究尚處于萌芽階段，目前許多靶向藥物的相關研究多針對胃-食管連接部腺癌開展，這些研究結果對于食管鱗癌是否適合尚不清楚[12]。
近年來 RNA 在生命系統中的重要性備受關注，涉及 RNA 的生物進程需要 RNA 解旋酶，RNA 解旋酶利用三磷酸腺苷（ATP）水解產生的能量實現 RNA 解旋或核糖核蛋白結構重組，幾乎參與了 RNA 代謝的所有環節[13-14]。RNA 解旋酶可以通過改變癌基因表達水平、基因突變或者參入腫瘤啟動和進展相關信號轉導通路、調控腫瘤耐藥基因的表達，參與腫瘤的發生發展[15]。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成員，人類 DDX46 基因位于染色體 5q31.1，有 26 個外顯子，編碼的 DDX46 蛋白分子量為 131 kDa[16]。我們前期研究發現 DDX46 蛋白表達主要定位于細胞核，食管鱗癌組織中的表達明顯高于相對應食管正常組織[7]，與人正常食管上皮細胞 Het-1A 相比，食管鱗癌細胞 Eca-109 中 DDX46 基因 mRNA 的表達顯著上調，抑制 DDX46 表達能降低食管鱗癌 Eca-109 細胞增殖，阻滯細胞周期于 G0/G1 期，并誘導細胞凋亡[8]。目前尚未見 DDX46 與裸鼠成瘤的相關報道。動物實驗更能模擬人類的生理和病理條件，獲得的實驗數據更具有說服力。本實驗在前期研究的基礎上，選用 DDX46 高表達的食管鱗癌細胞株 Eca-109，采用 RNAi 技術沉默 Eca-109 細胞中 DDX46 基因的表達，以 BALB/c 裸鼠為移植瘤載體，通過皮下注射腫瘤細胞使其成瘤，觀察 DDX46 表達降低對裸鼠移植瘤生長的影響，在體內環境中進一步驗證 DDX46 在食管鱗癌發生發展中的作用。結果表明 DDX46 表達降低后移植瘤生長明顯減慢，提示降低 DDX46 表達可以抑制食管鱗癌的生長，證實 DDX46 參與食管鱗癌的發生發展過程。
為闡明其可能的作用機制，本實驗應用 Western blotting 檢測移植瘤組織中細胞凋亡信號通路關鍵分子的變化，發現沉默 DDX46 基因后，移植瘤 DDX46 蛋白表達水平明顯下調，而 cleaved Caspase-3 和 cleaved PARP-1 蛋白表達水平顯著上調。Caspase-3 是參與細胞凋亡的關鍵執行分子，在凋亡信號轉導的許多途徑中發揮功能，正常以無活性的酶原形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡[17]。PARP 是存在于多數真核細胞中的一個多功能蛋白質翻譯后修飾酶，在 DNA 損傷修復與細胞凋亡中發揮著重要作用。PARP 在體外可以被多種 Caspase 剪切，在體內是 Caspase-3 的主要剪切對象。因此，PARP 剪切被認為是細胞凋亡的一個重要指標，也通常被認為是 Caspase-3 激活的指標[18]。體內裸鼠成瘤實驗證實降低 DDX46 表達可激活細胞凋亡信號通路，抑制食管鱗癌細胞增殖，結果與之前體外細胞實驗一致[8]。
Lee 等[1]研究發現，mRNA 中有一小部分編碼一些與腫瘤有某種聯系的蛋白質，并且這些 mRNA 攜帶獨特標記，能結合到 eIF3 開啟或者關閉 mRNA 翻譯，從而調節核糖體內蛋白質翻譯，這使得 mRNA 上的結合位點成為了一種很有前景的藥物靶標。RNA 解旋酶 DDX46 在 mRNA 前體剪接和核糖體組裝中發揮核心作用[2-3]，其表達的異常必然影響選擇性剪切過程。Zhang 等[19]研究發現肺腺癌中 SMC4 和 DDX46 的 mRNA 表達水平顯著正相關，SMC4 和 DDX46 在細胞周期各個時相均存在共定位，SMC4 可能通過與 DDX46 相互作用影響選擇性剪切，進而導致腫瘤的發生。Zheng 等[20]研究發現，DDX46 能結合到抗病毒效應分子 mRNA 的 CCGGUU 保守基序上，當病毒感染時 DDX46 與 m6A 去甲基化酶 ALKBH5 結合增加，使得與 DDX46 結合的抗病毒效應分子 mRNA 發生去甲基化修飾而導致其核滯留，阻滯了這些抗病毒效應分子的蛋白表達從而降低干擾素產生，最終抑制了抗病毒天然免疫應答反應。
綜上所述，DDX46 的表達水平與食管鱗癌的生長密切相關，沉默 DDX46 基因可顯著抑制食管鱗癌細胞裸鼠移植瘤的生長，其機制可能是通過激活細胞凋亡信號通路，進而發揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用。DDX46 是否通過細胞核內 RNA 修飾的方式參與調控食管鱗癌發生發展還有待進一步研究證實。
