引用本文： 劉剛, 師博文, 何曉敏, 黃駿榮, 陳會文, 祝忠群. 慢性缺氧對新生大鼠腦白質及腦發育的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(11): 986-992. doi: 10.7507/1007-4848.201801064 復制
紫紺型先天性心臟病（CHD）患者因胎兒期及新生兒期慢性缺氧導致腦發育延遲和腦白質（WM）損傷，增加了心臟手術中腦的易損性，是導致手術后患兒神經和行為發育異常的重要因素之一[1-3]。因此研究 CHD 胎兒和新生兒腦損傷機制及防治方法具有重要意義。然而，目前缺乏合適的動物模型。
當前研究腦損傷的動物模型大多以結扎單側頸總動脈或聯合短暫缺氧制作急性或亞急性腦損傷[4]，由于這些動物模型都是急性缺血或缺氧損傷，完全不同于慢性缺氧過程。在紫紺型 CHD 患兒中，圍產期慢性缺氧一方面可造成缺氧性 WM 損傷，另一方面還會造成整個大腦組織發育的不成熟，而以往的急性缺血缺氧動物模型無法復制這些改變，為了模擬紫紺型 CHD 產前和產后慢性腦缺氧腦損傷過程，我們從兩個方面對動物模型改進：（1）所選動物的腦發育程度接近人類胎兒妊娠晚期和新生兒期：選擇出生 3～14 d（P3～P14）新生 Sprague-Dawley 大鼠，其腦發育程度與人類妊娠末 3 個月（孕 24～36 周）和新生兒期極為相近[5-6]，來模擬人類 WM 易損期；（2）通過控制環境氧濃度，維持在 10.5%±1.0% 氧濃度條件下[7]，進行飼養 12 d 至 P14，造成一個相當于人類紫紺型 CHD 患兒圍產期的慢性缺氧過程。通過這些改進，探討這種模型腦發育延遲和 WM 損傷與 CHD 患兒腦損傷的一致性，為進一步研究 CHD 的腦損傷機制及防治方法打下基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及模型制作
雌性妊娠 18 d（E18）Sprague-Dawley 大鼠 6 只，體重 416.3～465.7 g，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司。實驗操作嚴格遵守中國科學院上海藥物研究所實驗動物管理委員會規定。恒溫 24℃，光照∶黑暗 12 h∶12 h 飼養待其分娩。分娩當日記作 P0（n=79），于分娩第 4 d（P3）將新生大鼠隨機分組，每窩控制數量 12 只，余剔除（n=7）。P3 新生大鼠共 72 只，體重 8.3～11.6 g，雌雄不限，每組 36 只。實驗組：同母鼠一起放入自制密閉有機玻璃箱中，箱頂 2 孔（直徑分別為 8 mm、5 mm），分別連接氧氮混合氣（11% O2，余 N2）和氧氣檢測儀（浙江杭州梅城氧氣檢測儀器廠，中國），箱底鋪設鈉石灰吸收二氧化碳和水。密閉箱體后，先快速通入高純氮 3 min，待箱內氧氣濃度下降至 12% 時通入氧氮混合氣（11%O2，余 N2），維持密閉箱內氧氣濃度 10.5%±1.0%，恒溫 24℃，光照∶黑暗 12 h∶12 h 飼養。每日上午 9 時開箱一次，測量并記錄新生大鼠體重，后迅速封閉培養箱，恢復缺氧環境，方法同上，整個過程不超過 30 min，每隔 2 d 補充食物飲水，更換便料。對照組恒溫 24 ℃，光照∶黑暗 12 h∶12 h 飼養，每日相同時間測量記錄體重。
1.2 實驗試劑
少突膠質祖細胞（OPC）標記物 PDGFRα（PDGFRα 為大鼠血小板衍生生長因子受體 α）抗體，少突膠質前體細胞（PreOL）標記物 O4（O4 為腦硫脂）抗體購自 Cell Signaling Technology 公司。髓鞘堿性蛋白（MBP）抗體購自 Abcam 公司。羊抗鼠 IgG 熒光二抗購自 Invitrogen 公司。其他相關試劑均由 Sigma-Aldrich 公司提供。
1.3 腦重量測定
P14 每組各取新生大鼠 9 只，低溫冰凍麻醉后，斷頭取腦，取出新鮮腦組織，迅速稱取腦重量。稱量結束后–80℃ 凍存待用。
1.4 腦組織病理變化 H&E 染色
P14 每組取 9 只，灌流取腦，立即將其浸入 4% 多聚甲醛溶液，室溫固定 48 h。梯度脫水后石蠟包埋修片至室下區（SVZ），切片 5 μm（每隔 10 張取 1 張，每只取 4 張）。涂片水洗后石蠟切片于二甲苯（1）（2）（3）中脫蠟各 5～10 min，然后經無水、95% 乙醇、85% 乙醇、75% 乙醇各 5 min。自來水沖洗 1 min。蘇木素染色液（Harris）染色 3～5 min，自來水洗 1～2 min，0.8%～1.0% 的鹽酸酒精分化，自來水沖洗，稀碳酸鋰水溶液返藍，水洗 1～2 min 入伊紅染液（醇溶性）染 1～2 s，直接入 95% 乙醇，無水乙醇中脫水 1～2 min，二甲苯透明、封固、鏡檢。使用圖像分析系統（NIH Image J）測量左右腦室以及整個腦片的面積。計算兩腦室總面積與全腦切面總面積的比值作為腦室大小指數[8-9]。
1.5 免疫組織化學檢測
P14 每組取 9 只，灌流取腦，取出腦組織，立即將其浸入 4% 多聚甲醛溶液，室溫固定 48 h，加入 30% 蔗糖溶液 4℃ 冰箱脫水 72 h，徹底脫水后用 OCT 包埋劑在冰凍切片機（Leica，Switzerland）包埋，設置箱體–22℃，刀片–22℃，快速修片，待 SVZ 區出現，將腦切成 20 μm（每隔 3 張取 1 張，每只取 4 張）并置于載玻片上；室溫下用含 10% GS 封閉 1 h。將稀釋好的一抗孵育玻片上的腦切片，濕盒中 4℃ 冰箱孵育過夜。PDGFRα，O4 及 MBP 抗體的稀釋濃度分別為 1∶200、1∶100 及 1∶400。次日，用 PBS 清洗玻片 3 次，再以 1∶400 比例稀釋聯有熒光的二抗和 1∶1 000 比例稀釋聯有熒光的 DAPI，用與一抗相同的方法孵育玻片，室溫避光 1～1.5 h，用 PBS 洗 3 遍后用防淬滅封片劑 Dako Cytomation 封片，熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）觀察。WM 區域高倍鏡（×400）下隨機選取 3 個視野，記錄陽性細胞數目，取平均值；觀察 WM 區域 MBP 分布情況。
1.6 蛋白免疫印跡（Western blotting）
取出新鮮腦組織，每只腦取 WM 區域 50 mg，1∶20 加入 RIPA 裂解液，利用超聲器將組織在裂解液中打碎，冰上裂解 60 min，收集裂解液至離心管，15 000 rcf 4℃ 離心 15 min。吸出上清液，取出 20 μl 用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，剩下的蛋白上清液中加入 4x 樣品緩沖液，沸水浴 10 min。樣品經 SDS/PAGE 電泳分離后轉移到 PVDF 膜上。5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h，用稀釋 MBP（1∶1 000）和 β-actin（1∶10 000）一抗孵育過夜。次日，TBST 洗 3 遍，每次 10 min。然后與稀釋的二抗 Ms（1∶10 000）室溫孵育 1 h。TBST 洗 3 遍，ECL 顯色后用 ImageQuantLAS4000 成像儀器顯影拍照。蛋白灰度條帶用 Image J 軟件分析。
1.7 轉棒實驗
每組各留 9 只 SD 鼠（P14），常氧恒溫 24℃，光照∶黑暗 12 h∶12 h 條件下飼養至 P30，行為學測試—轉棒實驗評估運動協調能力。實驗開始前對所有鼠以 10 r/min 轉速訓練 3 d，每天 3 次，間隔時間長于 30 min。正式實驗設置初始轉速 5 r/min，30 s 內增至 20 r/min，總時間 300 s，記錄第一次掉落時間（棒上停留時間）。
1.8 統計學分析
數據結果以均數±標準差（
±s）表示。計量資料組間統計學差異用 SPSS22.0 統計軟件進行分析，采用獨立樣本 t 檢驗。統計分析均為雙側檢驗，檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 體重、腦重變化
紫紺型 CHD 患兒出生后常表現為低體重、頭圍小。為探討本模型能否有效模擬紫紺型 CHD 患兒生長發育，記錄分析慢性缺氧環境下新生鼠的體重和腦重變化。
2.1.1 體重變化
實驗組動物生長發育明顯落后于對照組，表現為體格小、毛稀疏、睜眼時間延遲。實驗組體重增長明顯慢于對照組，差異有統計學意義［（14.92±1.26）g vs. （30.26±1.81）g，t=7.51，P<0.01］；見圖 1a。
2.1.2 腦重變化
實驗組腦重明顯低于對照組［（0.68±0.05） g vs. （0.97±0.04）g，t=13.26，P<0.01］；見圖 1b。表明慢性缺氧引起新生鼠腦容量減少，導致腦發育延遲。
圖1
兩組體重、腦重變化
a：***
2.2 慢性缺氧后 HE 染色腦組織病理變化
HE 染色結果顯示：實驗組腦 WM 區域水腫、結構疏松雜亂，局部軟化壞死灶，細胞排列紊亂，腦室擴大（P<0.01）。表明慢性缺氧導致腦發育異常和 WM 損傷；見圖 2。
圖2
腦組織病理切片染色
a：左為對照組，右為實驗組；b：黑色箭頭為擴大的腦室；比例尺：a，b 為500 μm，c，d 為 25 μm；e：腦室大小指數，左右腦室面積與腦片總面積比值，實驗組指數大于對照組，***
2.3 免疫組織化學結果
2.3.1 少突膠質祖細胞（OPC）PDGFRα 熒光表達
少突膠質祖細胞（OPC，PDGFRα+）是腦 WM 中少突膠質細胞系的祖細胞，其增殖分化對 WM 發育和損傷修復至關重要。腦切片以 PDGFRα 抗體標記來評價慢性缺氧對 OPC 的損傷程度。高倍鏡視野下（×400）PDGFRα 陽性細胞在實驗組熒光表達減少（圖 3a、圖 3b），同對照組相比，差異有統計學意義（圖 3c）。
圖3
少突膠質祖細胞（OPC）PDGFRα 免疫熒光鑒定（×400）
PDGFRα 陽性免疫熒光染色呈紅色；DAPI 陽性免疫熒光染色呈藍色；a：對照組；b：實驗組；c： 統計圖，兩組 WM 區域（胼胝體）每高倍鏡下（×400）PDGFRα 陽性細胞個數，與對照組比較，***
2.3.2 少突膠質前體細胞（PreOL）O4+熒光表達
少突膠質細胞前體細胞（PreOL，O4+）是人類孕中后期及嬰幼兒期腦 WM 損傷的主要目標細胞，也是少突膠質細胞系分化發育重要中間細胞，對缺血缺氧非常敏感。以 O4 抗體標記來評價慢性缺氧對 PreOL 細胞的損傷程度。高倍鏡視野下（×400）O4 陽性細胞在實驗組熒光表達減少（圖 4a、圖 4b），同對照組相比，差異有統計學意義（圖 4c）。
圖4
少突膠質前體細胞（PreOL）O4 免疫熒光鑒定（×400）
O4 陽性免疫熒光染色呈綠色；DAPI 陽性免疫熒光染色呈藍色；a：對照組；b：實驗組；c：統計圖，兩組 WM 區域（胼胝體）每高倍鏡下（×400）O4 陽性細胞個數，與對照組比較，***
2.4 髓磷脂蛋白（MBP）定量分析
腦組織 MBP 表達變化可作為 WM 髓鞘化程度和損傷情況的指標。為探討本模型能否有效模擬紫紺型 CHD 術前慢性缺氧引起的腦 WM 低髓鞘化和損傷。新生鼠慢性缺氧 12 d 后于 P14 灌流取腦，冰凍切片，髓磷脂堿性蛋白 MBP 免疫熒光鑒定；P14 斷頭取腦，取新鮮腦 WM 區域組織，通過 Western blotting 測量 MBP 含量變化。結果與 MBP 免疫熒光變化情況符合，實驗組 MBP 較對照組表達量明顯下降（P<0.01）；見圖 5。說明慢性缺氧確實引起 MBP 表達量下降，進而導致 WM 損傷和低髓鞘化。
圖5
髓鞘堿性蛋白 MBP 免疫熒光鑒定
MBP 陽性免疫熒光染色為綠色；左為對照組（a，c），右為實驗組（b，d）；比例尺：a、b 為250 μm，c、d 為 50 μm；e，f：腦白質 MBP 蛋白免疫印跡鑒定； e：MBP 表達條帶，左為對照組（
2.5 行為學測試：轉棒實驗
紫紺型 CHD 患兒會出現神經發育障礙，表現為智力、語言、運動協調能力等[3, 10]。為了評估慢性缺氧是否引起新生鼠神經發育結果異常，P14 兩組新生鼠（各余 9 只）自然條件下培養至 P30，轉棒實驗評估其運動協調能力。結果顯示，同對照組相比，實驗組棒上停留時間（第一次掉落時間）明顯縮短，差異有統計學意義（P<0.01）；見圖 6。表明慢性缺氧導致 SD 鼠運動協調能力下降，神經發育結果受損。
圖6
SD 大鼠 P30 轉棒實驗
同對照組（
3 討論
在紫紺型 CHD 的腦損傷研究中，人們往往發現存在兩種交織在一起的腦病理學改變：腦發育延遲和 WM 損傷。在腦發育延遲方面，主要表現為頭圍減小、腦容積減小、腦成熟度下降以及腦的大體結構發育異常如腦室擴大、皮質發育延遲、小腦蚓部和胼胝體發育不全等，可引起患兒運動、平衡協調等障礙[11]。在 WM 損傷方面，主要表現彌漫性 WM 損傷。WM 占人類腦容量的 50%[12]，位于皮層下，其主要成分是髓磷脂，髓磷脂形成軸突的髓鞘包繞軸突外面，這一過程稱軸突髓鞘化（myelination）。髓鞘化與少突膠質細胞（OL）細胞系的發生和成熟密切相關，OPCs 具有自我更新的能力，主要起源于哺乳動物大腦中最大的胚種區：SVZ，隨后細胞擴增，OPCs 遷移到 WM 進行分化，經歷從 OPCs→PreOL（O4+）→未成熟 OL（O1+）→成熟 OL 四個發育階段[13-14]。在 OL 細胞系中，PreOL 對缺血缺氧損傷最敏感，彌漫性 WM 損傷主要表現為 OL 細胞系發育障礙造成髓磷脂分泌減少而引起 WM 的低髓鞘化狀態，從而可引起患兒注意力障礙、多動癥、執行功能障礙、記憶力損傷和語言障礙等[15]。
在本研究中，我們發現慢性缺氧新生大鼠呈現明顯的腦發育延遲和 WM 損傷現象：（1）腦發育延遲：慢性缺氧不但造成大鼠體重減輕，更造成腦重減輕，容積減小，與對照組的差異有統計學意義；形態學染色結果表明腦室周圍 WM 區域水腫、結構疏松雜亂、局部軟化壞死灶、細胞排列紊亂、腦室擴大更加明顯；對 P30 大鼠進行轉棒行為學測試發現實驗組棒上停留時間明顯短于對照組，說明腦神經發育障礙會導致運動和協調功能受損[16]；（2）WM 損傷：形成 WM 中軸突髓鞘的少突膠質細胞系的顯著改變：OPC 和 PreOL 顯著減少，尤其以 OPC 減少更為顯著，不同于急性缺血損傷中以 PreOL 損傷為主的表現，反映慢性缺氧可造成少突膠質細胞系損傷，從而 MBP 蛋白表達減少，導致軸突髓鞘化障礙，最終引起 WM 損傷。這些細胞學、組織病理學和神經功能的變化與紫紺型 CHD 的腦發育異常和 WM 損傷相似。
先前研究大腦損傷動物模型多數都是采用急性缺血缺氧損傷模型，往往通過結扎大鼠單側頸總動脈，然后 8%氧氣缺氧 3～5 h，48 h 后結扎側可見皮質、海馬和紋狀體損傷，皮質下以及腦室周圍白質也可累及[17-18]。該類模型造成腦部血流變化和細胞代謝紊亂，能提供短期和遠期神經病理學損傷和功能評價，與慢性缺氧腦損傷病理還是存在差異。本研究采用貼合人類孕 24～36 周和新生兒期發育程度相似的新生大鼠（P3～P14）和慢性低氧環境[5- 6]，模擬紫紺型 CHD 胎兒圍產期間慢性缺氧過程，復制了紫紺型 CHD 慢性缺氧腦發育和損傷相似形態和組織及細胞學改變。因此，我們認為該模型可作為進一步研究紫紺型 CHD 圍產期 WM 和腦發育損傷的機制和防治的實驗研究工具。而且作者體會該模型價格相對低廉、成功率高、重復性好、易于操作，值得推廣。
紫紺型先天性心臟病（CHD）患者因胎兒期及新生兒期慢性缺氧導致腦發育延遲和腦白質（WM）損傷，增加了心臟手術中腦的易損性，是導致手術后患兒神經和行為發育異常的重要因素之一[1-3]。因此研究 CHD 胎兒和新生兒腦損傷機制及防治方法具有重要意義。然而，目前缺乏合適的動物模型。
當前研究腦損傷的動物模型大多以結扎單側頸總動脈或聯合短暫缺氧制作急性或亞急性腦損傷[4]，由于這些動物模型都是急性缺血或缺氧損傷，完全不同于慢性缺氧過程。在紫紺型 CHD 患兒中，圍產期慢性缺氧一方面可造成缺氧性 WM 損傷，另一方面還會造成整個大腦組織發育的不成熟，而以往的急性缺血缺氧動物模型無法復制這些改變，為了模擬紫紺型 CHD 產前和產后慢性腦缺氧腦損傷過程，我們從兩個方面對動物模型改進：（1）所選動物的腦發育程度接近人類胎兒妊娠晚期和新生兒期：選擇出生 3～14 d（P3～P14）新生 Sprague-Dawley 大鼠，其腦發育程度與人類妊娠末 3 個月（孕 24～36 周）和新生兒期極為相近[5-6]，來模擬人類 WM 易損期；（2）通過控制環境氧濃度，維持在 10.5%±1.0% 氧濃度條件下[7]，進行飼養 12 d 至 P14，造成一個相當于人類紫紺型 CHD 患兒圍產期的慢性缺氧過程。通過這些改進，探討這種模型腦發育延遲和 WM 損傷與 CHD 患兒腦損傷的一致性，為進一步研究 CHD 的腦損傷機制及防治方法打下基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及模型制作
雌性妊娠 18 d（E18）Sprague-Dawley 大鼠 6 只，體重 416.3～465.7 g，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司。實驗操作嚴格遵守中國科學院上海藥物研究所實驗動物管理委員會規定。恒溫 24℃，光照∶黑暗 12 h∶12 h 飼養待其分娩。分娩當日記作 P0（n=79），于分娩第 4 d（P3）將新生大鼠隨機分組，每窩控制數量 12 只，余剔除（n=7）。P3 新生大鼠共 72 只，體重 8.3～11.6 g，雌雄不限，每組 36 只。實驗組：同母鼠一起放入自制密閉有機玻璃箱中，箱頂 2 孔（直徑分別為 8 mm、5 mm），分別連接氧氮混合氣（11% O2，余 N2）和氧氣檢測儀（浙江杭州梅城氧氣檢測儀器廠，中國），箱底鋪設鈉石灰吸收二氧化碳和水。密閉箱體后，先快速通入高純氮 3 min，待箱內氧氣濃度下降至 12% 時通入氧氮混合氣（11%O2，余 N2），維持密閉箱內氧氣濃度 10.5%±1.0%，恒溫 24℃，光照∶黑暗 12 h∶12 h 飼養。每日上午 9 時開箱一次，測量并記錄新生大鼠體重，后迅速封閉培養箱，恢復缺氧環境，方法同上，整個過程不超過 30 min，每隔 2 d 補充食物飲水，更換便料。對照組恒溫 24 ℃，光照∶黑暗 12 h∶12 h 飼養，每日相同時間測量記錄體重。
1.2 實驗試劑
少突膠質祖細胞（OPC）標記物 PDGFRα（PDGFRα 為大鼠血小板衍生生長因子受體 α）抗體，少突膠質前體細胞（PreOL）標記物 O4（O4 為腦硫脂）抗體購自 Cell Signaling Technology 公司。髓鞘堿性蛋白（MBP）抗體購自 Abcam 公司。羊抗鼠 IgG 熒光二抗購自 Invitrogen 公司。其他相關試劑均由 Sigma-Aldrich 公司提供。
1.3 腦重量測定
P14 每組各取新生大鼠 9 只，低溫冰凍麻醉后，斷頭取腦，取出新鮮腦組織，迅速稱取腦重量。稱量結束后–80℃ 凍存待用。
1.4 腦組織病理變化 H&E 染色
P14 每組取 9 只，灌流取腦，立即將其浸入 4% 多聚甲醛溶液，室溫固定 48 h。梯度脫水后石蠟包埋修片至室下區（SVZ），切片 5 μm（每隔 10 張取 1 張，每只取 4 張）。涂片水洗后石蠟切片于二甲苯（1）（2）（3）中脫蠟各 5～10 min，然后經無水、95% 乙醇、85% 乙醇、75% 乙醇各 5 min。自來水沖洗 1 min。蘇木素染色液（Harris）染色 3～5 min，自來水洗 1～2 min，0.8%～1.0% 的鹽酸酒精分化，自來水沖洗，稀碳酸鋰水溶液返藍，水洗 1～2 min 入伊紅染液（醇溶性）染 1～2 s，直接入 95% 乙醇，無水乙醇中脫水 1～2 min，二甲苯透明、封固、鏡檢。使用圖像分析系統（NIH Image J）測量左右腦室以及整個腦片的面積。計算兩腦室總面積與全腦切面總面積的比值作為腦室大小指數[8-9]。
1.5 免疫組織化學檢測
P14 每組取 9 只，灌流取腦，取出腦組織，立即將其浸入 4% 多聚甲醛溶液，室溫固定 48 h，加入 30% 蔗糖溶液 4℃ 冰箱脫水 72 h，徹底脫水后用 OCT 包埋劑在冰凍切片機（Leica，Switzerland）包埋，設置箱體–22℃，刀片–22℃，快速修片，待 SVZ 區出現，將腦切成 20 μm（每隔 3 張取 1 張，每只取 4 張）并置于載玻片上；室溫下用含 10% GS 封閉 1 h。將稀釋好的一抗孵育玻片上的腦切片，濕盒中 4℃ 冰箱孵育過夜。PDGFRα，O4 及 MBP 抗體的稀釋濃度分別為 1∶200、1∶100 及 1∶400。次日，用 PBS 清洗玻片 3 次，再以 1∶400 比例稀釋聯有熒光的二抗和 1∶1 000 比例稀釋聯有熒光的 DAPI，用與一抗相同的方法孵育玻片，室溫避光 1～1.5 h，用 PBS 洗 3 遍后用防淬滅封片劑 Dako Cytomation 封片，熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）觀察。WM 區域高倍鏡（×400）下隨機選取 3 個視野，記錄陽性細胞數目，取平均值；觀察 WM 區域 MBP 分布情況。
1.6 蛋白免疫印跡（Western blotting）
取出新鮮腦組織，每只腦取 WM 區域 50 mg，1∶20 加入 RIPA 裂解液，利用超聲器將組織在裂解液中打碎，冰上裂解 60 min，收集裂解液至離心管，15 000 rcf 4℃ 離心 15 min。吸出上清液，取出 20 μl 用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，剩下的蛋白上清液中加入 4x 樣品緩沖液，沸水浴 10 min。樣品經 SDS/PAGE 電泳分離后轉移到 PVDF 膜上。5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h，用稀釋 MBP（1∶1 000）和 β-actin（1∶10 000）一抗孵育過夜。次日，TBST 洗 3 遍，每次 10 min。然后與稀釋的二抗 Ms（1∶10 000）室溫孵育 1 h。TBST 洗 3 遍，ECL 顯色后用 ImageQuantLAS4000 成像儀器顯影拍照。蛋白灰度條帶用 Image J 軟件分析。
1.7 轉棒實驗
每組各留 9 只 SD 鼠（P14），常氧恒溫 24℃，光照∶黑暗 12 h∶12 h 條件下飼養至 P30，行為學測試—轉棒實驗評估運動協調能力。實驗開始前對所有鼠以 10 r/min 轉速訓練 3 d，每天 3 次，間隔時間長于 30 min。正式實驗設置初始轉速 5 r/min，30 s 內增至 20 r/min，總時間 300 s，記錄第一次掉落時間（棒上停留時間）。
1.8 統計學分析
數據結果以均數±標準差（
±s）表示。計量資料組間統計學差異用 SPSS22.0 統計軟件進行分析，采用獨立樣本 t 檢驗。統計分析均為雙側檢驗，檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 體重、腦重變化
紫紺型 CHD 患兒出生后常表現為低體重、頭圍小。為探討本模型能否有效模擬紫紺型 CHD 患兒生長發育，記錄分析慢性缺氧環境下新生鼠的體重和腦重變化。
2.1.1 體重變化
實驗組動物生長發育明顯落后于對照組，表現為體格小、毛稀疏、睜眼時間延遲。實驗組體重增長明顯慢于對照組，差異有統計學意義［（14.92±1.26）g vs. （30.26±1.81）g，t=7.51，P<0.01］；見圖 1a。
2.1.2 腦重變化
實驗組腦重明顯低于對照組［（0.68±0.05） g vs. （0.97±0.04）g，t=13.26，P<0.01］；見圖 1b。表明慢性缺氧引起新生鼠腦容量減少，導致腦發育延遲。
圖1
兩組體重、腦重變化
a：***
2.2 慢性缺氧后 HE 染色腦組織病理變化
HE 染色結果顯示：實驗組腦 WM 區域水腫、結構疏松雜亂，局部軟化壞死灶，細胞排列紊亂，腦室擴大（P<0.01）。表明慢性缺氧導致腦發育異常和 WM 損傷；見圖 2。
圖2
腦組織病理切片染色
a：左為對照組，右為實驗組；b：黑色箭頭為擴大的腦室；比例尺：a，b 為500 μm，c，d 為 25 μm；e：腦室大小指數，左右腦室面積與腦片總面積比值，實驗組指數大于對照組，***
2.3 免疫組織化學結果
2.3.1 少突膠質祖細胞（OPC）PDGFRα 熒光表達
少突膠質祖細胞（OPC，PDGFRα+）是腦 WM 中少突膠質細胞系的祖細胞，其增殖分化對 WM 發育和損傷修復至關重要。腦切片以 PDGFRα 抗體標記來評價慢性缺氧對 OPC 的損傷程度。高倍鏡視野下（×400）PDGFRα 陽性細胞在實驗組熒光表達減少（圖 3a、圖 3b），同對照組相比，差異有統計學意義（圖 3c）。
圖3
少突膠質祖細胞（OPC）PDGFRα 免疫熒光鑒定（×400）
PDGFRα 陽性免疫熒光染色呈紅色；DAPI 陽性免疫熒光染色呈藍色；a：對照組；b：實驗組；c： 統計圖，兩組 WM 區域（胼胝體）每高倍鏡下（×400）PDGFRα 陽性細胞個數，與對照組比較，***
2.3.2 少突膠質前體細胞（PreOL）O4+熒光表達
少突膠質細胞前體細胞（PreOL，O4+）是人類孕中后期及嬰幼兒期腦 WM 損傷的主要目標細胞，也是少突膠質細胞系分化發育重要中間細胞，對缺血缺氧非常敏感。以 O4 抗體標記來評價慢性缺氧對 PreOL 細胞的損傷程度。高倍鏡視野下（×400）O4 陽性細胞在實驗組熒光表達減少（圖 4a、圖 4b），同對照組相比，差異有統計學意義（圖 4c）。
圖4
少突膠質前體細胞（PreOL）O4 免疫熒光鑒定（×400）
O4 陽性免疫熒光染色呈綠色；DAPI 陽性免疫熒光染色呈藍色；a：對照組；b：實驗組；c：統計圖，兩組 WM 區域（胼胝體）每高倍鏡下（×400）O4 陽性細胞個數，與對照組比較，***
2.4 髓磷脂蛋白（MBP）定量分析
腦組織 MBP 表達變化可作為 WM 髓鞘化程度和損傷情況的指標。為探討本模型能否有效模擬紫紺型 CHD 術前慢性缺氧引起的腦 WM 低髓鞘化和損傷。新生鼠慢性缺氧 12 d 后于 P14 灌流取腦，冰凍切片，髓磷脂堿性蛋白 MBP 免疫熒光鑒定；P14 斷頭取腦，取新鮮腦 WM 區域組織，通過 Western blotting 測量 MBP 含量變化。結果與 MBP 免疫熒光變化情況符合，實驗組 MBP 較對照組表達量明顯下降（P<0.01）；見圖 5。說明慢性缺氧確實引起 MBP 表達量下降，進而導致 WM 損傷和低髓鞘化。
圖5
髓鞘堿性蛋白 MBP 免疫熒光鑒定
MBP 陽性免疫熒光染色為綠色；左為對照組（a，c），右為實驗組（b，d）；比例尺：a、b 為250 μm，c、d 為 50 μm；e，f：腦白質 MBP 蛋白免疫印跡鑒定； e：MBP 表達條帶，左為對照組（
2.5 行為學測試：轉棒實驗
紫紺型 CHD 患兒會出現神經發育障礙，表現為智力、語言、運動協調能力等[3, 10]。為了評估慢性缺氧是否引起新生鼠神經發育結果異常，P14 兩組新生鼠（各余 9 只）自然條件下培養至 P30，轉棒實驗評估其運動協調能力。結果顯示，同對照組相比，實驗組棒上停留時間（第一次掉落時間）明顯縮短，差異有統計學意義（P<0.01）；見圖 6。表明慢性缺氧導致 SD 鼠運動協調能力下降，神經發育結果受損。
圖6
SD 大鼠 P30 轉棒實驗
同對照組（
3 討論
在紫紺型 CHD 的腦損傷研究中，人們往往發現存在兩種交織在一起的腦病理學改變：腦發育延遲和 WM 損傷。在腦發育延遲方面，主要表現為頭圍減小、腦容積減小、腦成熟度下降以及腦的大體結構發育異常如腦室擴大、皮質發育延遲、小腦蚓部和胼胝體發育不全等，可引起患兒運動、平衡協調等障礙[11]。在 WM 損傷方面，主要表現彌漫性 WM 損傷。WM 占人類腦容量的 50%[12]，位于皮層下，其主要成分是髓磷脂，髓磷脂形成軸突的髓鞘包繞軸突外面，這一過程稱軸突髓鞘化（myelination）。髓鞘化與少突膠質細胞（OL）細胞系的發生和成熟密切相關，OPCs 具有自我更新的能力，主要起源于哺乳動物大腦中最大的胚種區：SVZ，隨后細胞擴增，OPCs 遷移到 WM 進行分化，經歷從 OPCs→PreOL（O4+）→未成熟 OL（O1+）→成熟 OL 四個發育階段[13-14]。在 OL 細胞系中，PreOL 對缺血缺氧損傷最敏感，彌漫性 WM 損傷主要表現為 OL 細胞系發育障礙造成髓磷脂分泌減少而引起 WM 的低髓鞘化狀態，從而可引起患兒注意力障礙、多動癥、執行功能障礙、記憶力損傷和語言障礙等[15]。
在本研究中，我們發現慢性缺氧新生大鼠呈現明顯的腦發育延遲和 WM 損傷現象：（1）腦發育延遲：慢性缺氧不但造成大鼠體重減輕，更造成腦重減輕，容積減小，與對照組的差異有統計學意義；形態學染色結果表明腦室周圍 WM 區域水腫、結構疏松雜亂、局部軟化壞死灶、細胞排列紊亂、腦室擴大更加明顯；對 P30 大鼠進行轉棒行為學測試發現實驗組棒上停留時間明顯短于對照組，說明腦神經發育障礙會導致運動和協調功能受損[16]；（2）WM 損傷：形成 WM 中軸突髓鞘的少突膠質細胞系的顯著改變：OPC 和 PreOL 顯著減少，尤其以 OPC 減少更為顯著，不同于急性缺血損傷中以 PreOL 損傷為主的表現，反映慢性缺氧可造成少突膠質細胞系損傷，從而 MBP 蛋白表達減少，導致軸突髓鞘化障礙，最終引起 WM 損傷。這些細胞學、組織病理學和神經功能的變化與紫紺型 CHD 的腦發育異常和 WM 損傷相似。
先前研究大腦損傷動物模型多數都是采用急性缺血缺氧損傷模型，往往通過結扎大鼠單側頸總動脈，然后 8%氧氣缺氧 3～5 h，48 h 后結扎側可見皮質、海馬和紋狀體損傷，皮質下以及腦室周圍白質也可累及[17-18]。該類模型造成腦部血流變化和細胞代謝紊亂，能提供短期和遠期神經病理學損傷和功能評價，與慢性缺氧腦損傷病理還是存在差異。本研究采用貼合人類孕 24～36 周和新生兒期發育程度相似的新生大鼠（P3～P14）和慢性低氧環境[5- 6]，模擬紫紺型 CHD 胎兒圍產期間慢性缺氧過程，復制了紫紺型 CHD 慢性缺氧腦發育和損傷相似形態和組織及細胞學改變。因此，我們認為該模型可作為進一步研究紫紺型 CHD 圍產期 WM 和腦發育損傷的機制和防治的實驗研究工具。而且作者體會該模型價格相對低廉、成功率高、重復性好、易于操作，值得推廣。
