引用本文： 蘭懷, 王輝山, 薛曉東, 尹宗濤, 祝巖, 韓勁松, 馬東初, 蒲菲菲. 風濕性心臟病合并持續性心房顫動患者左心房內徑增大對心房肌組織 AngⅡ/Rac1/STAT3 途徑表達的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(11): 993-999. doi: 10.7507/1007-4848.201710021 復制
心房顫動（atrial fibrillation，房顫）是臨床最常見的一種心律失常，因其人群發病率高、并發癥復雜、易于復發等特點成為當今嚴重危害人類健康的心血管疾病之一[1]。導致持續性房顫發生的主要原因之一是風濕性心臟瓣膜病，尤其是風濕性二尖瓣疾病[2]。持續性房顫患者均出現不同程度的心房重構，作為公認的房顫發生機制，心房重構主要包括心房電重構、收縮功能重構和心房結構重構三個方面[3]。眾多證據表明心房結構重構在房顫的發生與維持中起著關鍵作用[4-5]。心房結構異常導致了傳導異質性而有利于房顫發生，心房結構重構常伴有心房容積的增加，而隨之改變的左房內徑也與房顫的發生顯著相關[6]。
目前心房結構重構具體分子機制仍未明確。Tsai 等[7]研究發現，血管緊張素 Ⅱ（AngⅡ）/Rac GTP 酶激活蛋白 1（Rac1）/信號轉導與轉錄激活因子 3（STAT3）信號途徑在介導心房結構重構以及房顫中起著重要作用，并且氯沙坦及他汀類藥物可以逆轉 AngⅡ介導房顫的心房重構。在持續性房顫患者中隨心房結構重構的發展左房內徑逐漸增大，然而心房肌組織中 AngⅡ/Rac1/STAT3 信號途徑表達水平的如何改變卻未有報道。本研究通過觀察風濕性心臟病合并持續性房顫患者，左心房內徑增大對心房肌組織纖維化程度以及 AngⅡ/Rac1/STAT3 信號途徑表達水平的影響，探討房顫心房結構重構機制。
1 材料與方法
1.1 臨床資料
選自 2011 年 3～12 月在我院行人工瓣膜置換術的風濕性心臟病患者 30 例，其中男 16 例、女 14 例，年齡 42～70（56.9±6.8）歲。其中 10 例竇性心律患者為對照組（A 組）；合并持續性房顫 20 例患者為病例組，并按左心房內徑（left atrial dimension，LAD）分為兩組，B 組 LAD 50～65 mm（n=10），C 組 LAD>65 mm（n=10）。診斷符合 2006 年美國心臟病學學會和美國心臟學會（ACC/AHA）房顫指南中房顫分類標準。術前經十二導聯心電圖、24 h 動態心電圖、心臟超聲心動圖及術后病理診斷確診，并排除近 3 個月口服血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（ARB）及他汀類藥物患者。所有患者均簽署有關知情同意書，并獲得沈陽軍區總醫院倫理委員會許可。
1.2 主要試劑
人 Ang Ⅱ 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國 Peninsula 公司）、蛋白酶抑制劑（美國 Thermo 公司）、兔抗人 Rac1 多克隆抗體（美國 Santa Cruz 公司）、鼠抗人 STAT3 多克隆抗體（美國 CST 公司）、鼠抗人 GAPDH 單克隆抗體（美國 Santa Cruz 公司）、辣根酶標記山羊抗小鼠 IgG（美國 Santa Cruz 公司）。心房肌組織細胞漿蛋白質提取裂解液成分：HEPES（10 mmol/L，pH 7.90）、KCl（10.0 mmol/L）、MgCl2·6H2O（1.50 mmol/L）、DTT（1.0 mmol/L）、PMSF（1.0 mmol/L）、NaF（25 mmol/L），Na3VO4（1 mmol/L）、蛋白酶抑制劑（1 μl/ml）。
1.3 實驗方法
1.3.1 標本采集
患者在術中建立體外循環后立即獲取右心耳標本重量約 300 mg。標本經修剪去除脂肪后，用 10% 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗凈后置于液氮中保存。
1.3.2 HE 及 Masson 染色
將部分心房肌組織以 10% PBS 中性甲醛固定，經脫水、清洗、石蠟包埋后制成切片，行 HE 及 Masson 染色作組織病理學檢測，觀察心房肌組織細胞形態及纖維化程度。采用顯微圖像分析系統檢測 Masson 染色纖維化區域面積值（ECM%），每張切片測定 10 個任意視野。
1.3.3 提取心肌組織胞漿蛋白質
從液氮中取出心房肌組織樣品解凍后剪碎，加入裂解液（按 1.0 g/3.0 ml）勻漿。將勻漿組織轉移至 EP 管內在冰上孵育 10 min，經 14 000 g×15 min，4℃ 離心吸取上清液 即為心房肌組織胞漿蛋白質，分裝后–80℃ 保存。
1.3.4 ELISA 分析
采用 ELISA 檢測心房肌組織胞漿蛋白質的 AngⅡ 濃度。用酶標儀在 450 nm 波長下依序測量各孔光密度（OD）值，制作標準曲線。
1.3.5 蛋白印跡定量分析
采用 Western blotting 檢測心房肌組織胞漿蛋白質中 Rac1（22kD）、STAT3（86kD）蛋白含量。其中 Ⅰ 抗比例 Rac1（1∶500）、STAT3（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）；Ⅱ 抗比例均為 1∶5 000。用 GAPDH 作為對照，進行定量分析。
1.4 統計學分析
采用 SPSS17.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（
±s）表示，多組之間均數比較采用單因素方差分析，實驗數據與左心房內徑之間的相關性分析用 Pearson 相關分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 臨床資料特征
所有風濕性心臟病患者臨床資料結果見表 1。房顫患者左心房內徑與對照組比較明顯增大，B 組與 A 組比較［（59.3±2.4）mm vs. （43.5±6.1）mm，P<0.05］，C 組與 A 組比較［（76.7±11.2）mmvs.（43.5±6.1）mm，P<0.001］，差異有統計學意義。而患者其他臨床資料特征，如年齡、性別構成比、左室射血分數等均無顯著差異。
表1
3 組患者臨床資料特征（
/例）
2.2 心肌組織細胞形態及纖維化改變
心房肌組織 HE 及 Masson 染色鏡下觀察結果見圖 1。A 組心肌細胞排列整齊，胞漿鮮紅豐富染色均勻，細胞核呈卵圓形位于中央較均一，心肌纖維束周圍僅見少量間質膠原纖維沉積；B、C 組心肌細胞肥大，細胞數目減少，肌纖維排列紊亂逐漸加重，細胞核大小不均一，心肌細胞周圍可見大量藍色膠原纖維分割包繞。計算 Masson 染色 ECM% 值結果見圖 2，B 組與 A 組比較（10.19%±2.56% vs. 5.21%±2.71%，P<0.05），C 組與 A 組比較（17.35%±2.01%vs. 5.21%±2.71%，P<0.001），C 組與 B 組比較（17.35%±2.01%vs. 10.19%±2.56%，P<0.001），差異均有統計學意義。結果顯示心房肌組織纖維化程度隨左心房內徑增大明顯增強，并與左心房內徑呈正相關（r=0.994 2，P=0.048 3）。
圖1
心房肌組織 HE 及 Masson 染色（×200）
圖2
Masson 染色纖維化區域面積值（ECM%）
*
2.3 ELISA 分析
ELISA 檢測心房肌組織胞漿蛋白質 AngⅡ濃度結果見圖 3。B 組與 A 組比較，差異無統計學意義［（1.61±0.41）pg/mg vs. （0.93±0.33）pg/mg，P=0.321］。C 組與 A 組比較［（4.59±2.56）pg/mg vs. （0.93±0.33）pg/mg，P<0.001］，C 組與 B 組比較［（4.59±2.56）pg/mgvs. （1.61±0.41）pg/mg，P<0.001］，差異有統計學意義。可見心房肌組織中 AngⅡ濃度隨左心房內徑增大明顯增加，并與左心房內徑呈正相關（r=0.886，P<0.01）。
圖3
ELISA 檢測心房肌組織 AngⅡ（pg/mg 蛋白）濃度
a：風濕性心臟病患者房顫組與對照組比較，心房肌組織中 AngⅡ 濃度明顯增加，*
2.4 蛋白印跡定量分析
Western blotting 檢測心房肌組織胞漿蛋白質的 Rac1 蛋白含量結果見圖 4。C 組與 A 組比較，差異有統計學意義（0.535±0.275 vs. 0.229±0.088，P<0.01）。B 組與 A 組比較（0.373±0.175vs. 0.229±0.088，P=0.112），C 組與 B 組比較（0.535±0.275 vs. 0.373±0.175，P=0.074），差異無統計學意義。心房肌組織中 Rac1 蛋白隨左心房內徑增大表達水平增強，并與左心房內徑呈正相關（r=0.758，P<0.01）。
圖4
Western blotting 檢測心房肌組織胞漿蛋白質的 Rac1 蛋白含量結果
a：蛋白印跡法檢測心房肌組織 Rac1 蛋白含量；b：風濕性心臟病患者房顫組與對照組比較，心房肌組織中 Rac1 蛋白含量明顯增加，*
Western blotting 檢測心房肌組織胞漿蛋白質的 STAT3 蛋白含量結果見圖 5。B 組與 A 組比較（0.773±0.376 vs. 0.436±0.099，P<0.05），C 組與 A 組比較（0.990±0.469vs. 0.436±0.099，P<0.05），差異有統計學意義，C 組與 B 組比較，差異無統計學意義（0.990±0.469vs. 0.773±0.376，P=0.179）。心房肌組織中 STAT3 蛋白隨左心房內徑增大表達水平增強，并與左心房內徑呈正相關（r=0.602，P<0.01）。
圖5
Western blotting 檢測心房肌組織胞漿蛋白質的 STAT3 蛋白含量
a：蛋白印跡法檢測心房肌組織 STAT3 蛋白含量；b：風濕性心臟病患者房顫組與對照組比較，心房肌組織中 STAT3 蛋白含量明顯增加，*
3 討論
心房結構重構最重要特征是心房纖維化[3]。而心房纖維化與細胞外基質重塑共同構成了心房擴張的核心機制，引起心房內徑的增加。此外 Spach 等[8]研究顯示，房顫的發生隨著心房纖維化程度的增加而增加，表明心房纖維化是房顫發生與持續的重要因素。本研究證實風濕性心臟病合并持續性房顫患者，心房纖維化程度隨左房內徑增大明顯增強，符合心房結構重構的特征。
研究發現，房顫時心房 AngⅡ 激活增強是引起心房纖維化的主要原因[9]。AngⅡ 通過與 AngⅡ1 型受體（AT1R）結合，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的磷酸化級聯反應，而 MAPKs 是刺激成纖維細胞增殖，引起細胞肥大及凋亡的重要調節因子[10-12]。AT1R 介導的信號途徑大多數通過與 G 蛋白偶聯受體結合。AngⅡ 與 AT1R 結合通過 G 蛋白激活 Src 家族激酶（c-Src），而 Src/Grb2/SOS 復合物形成導致鳥苷三磷酸酶（GTPase）、Ras 蛋白的激活[13]。除此 GTPase-Ras 與 MAPKs 相互作用，使細胞外信號調節激酶（ERKs）1、2（MEK-1、MEK-2）激活，最終 MEK-1 與 MEK-2 磷酸化使 AngⅡ 激活 MAPKs 信號級聯反應擴大[11]。本研究證實風濕性心臟病合并持續性房顫患者，心房肌組織中 AngⅡ 濃度隨著左房內徑增大增加明顯，可見房顫時心房肌組織中 AngⅡ 激活增強。
研究顯示在心臟特征性過度表達 Rac1 的轉基因小鼠模型（RacET）的心房結構改變中，出現明顯的心房擴張以及通過 Rac1 下調 PAK 的激活促進了心房結構的改變[14]。 而 Tsai 等[7]研究發現 AngⅡ 誘導 PAK 的激活出現在心房成纖維細胞中而并非心房肌細胞，因此 AngⅡ/Rac1 介導的心房結構重構機制可能是通過心房成纖維細胞促進了心房纖維化。Rac1 作為小 GTP 結合蛋白是 Rho GTP 酶超家族成員介導細胞內信號轉導因子，參與調節依賴 NADPH 的氧化應激途徑[15]。在房顫患者與動物房顫模型的心房組織中 Rac1 激活以及 Rac1 介導 NADPH 產生的超氧化物陰離子增加[16-17]。由此可知 Rac1 激活上調與房顫發病機制有關。本研究發現風濕性心臟病合并持續性房顫患者，心房肌組織 Rac1 蛋白隨著左房內徑增大表達水平增強。我們推測 Rac1 蛋白表達水平增強與 AngⅡ 激活及氧化應激有關。Adam 等[14]研究應用羅舒伐他汀治療 RacET 小鼠降低了房顫的發生率。這些研究顯示應用他汀類藥物抑制 AngⅡ 誘導 Rac1 的激活有利于預防心房重構與房顫的發生。他汀類藥物抑制 AngⅡ 誘導的心肌氧化應激增加以及抑制 Rac1 介導煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶激活產生的心房重構，同時降低了術后患者房顫的發生率[18-19]。
STAT3 屬于 STAT 蛋白家族中的細胞質轉錄因子，AngⅡ 通過 AT1R 激活 STAT3[20]。研究顯示心肌過度表達 AT1R 小鼠轉基因模型（AT1R-TG）中，出現心臟顯著肥厚及心肌重構[21]。而最近研究發現在小鼠 AT1R-TG 模型中，STAT3 中 Tyr705 或 Ser727 磷酸化過程未受到影響，然而觀察到 STAT3 的信使 RNA（mRNA）和總蛋白量增加。在此小鼠 AT1R-TG 模型中，未磷酸化的 STAT3 在細胞核中蓄積同時與啟動因子 p300 結合，引起心臟發生肥厚和功能障礙[22]。此研究說明了通過 AT1R 介導上調 STAT3 的表達，而未磷酸化的 STAT3 促進了心臟重構。Tsai 等[7]認為在心房肌細胞和成纖維細胞中 AngⅡ 誘導激活 STAT3 存在兩種不同的信號轉導機制，然而必須通過 Rac1 因子。在心房肌細胞 AngⅡ 可能直接通過 Rac1 激活 STAT3 和通過 JAK 或者 TYK 獨立機制激活 STAT3。而在心房成纖維細胞中 AngⅡ 激活 STAT3 需要 Rac1 誘導自分泌或旁分泌因子和 JAK 機制。本研究發現風濕性心臟病合并持續性房顫患者，心房肌組織 STAT3 蛋白隨著左房內徑增大表達水平增強，可見房顫時心房肌組織中 STAT3 激活增強。
我們的研究表明在風濕性心臟病合并持續性房顫患者心房肌組織中，心房肌纖維化程度及 AngⅡ/Rac1/STAT3 信號途徑隨表達水平左房內徑增大明顯增強，抑制該途徑的表達，可能延緩房顫心房結構重構的發展。本研究的局限性，因心臟外科手術的特殊性，為防止左房出血并未能獲取左心耳心肌組織。同時未能排除三尖瓣反流和肺動脈壓力對心房纖維化的影響以及口服藥物藥理作用和相關細胞因子的干預。此外本研究為非隨機對照試驗，病例樣本數偏少，未來可以增加樣本數量和動物模型進一步研究。
心房顫動（atrial fibrillation，房顫）是臨床最常見的一種心律失常，因其人群發病率高、并發癥復雜、易于復發等特點成為當今嚴重危害人類健康的心血管疾病之一[1]。導致持續性房顫發生的主要原因之一是風濕性心臟瓣膜病，尤其是風濕性二尖瓣疾病[2]。持續性房顫患者均出現不同程度的心房重構，作為公認的房顫發生機制，心房重構主要包括心房電重構、收縮功能重構和心房結構重構三個方面[3]。眾多證據表明心房結構重構在房顫的發生與維持中起著關鍵作用[4-5]。心房結構異常導致了傳導異質性而有利于房顫發生，心房結構重構常伴有心房容積的增加，而隨之改變的左房內徑也與房顫的發生顯著相關[6]。
目前心房結構重構具體分子機制仍未明確。Tsai 等[7]研究發現，血管緊張素 Ⅱ（AngⅡ）/Rac GTP 酶激活蛋白 1（Rac1）/信號轉導與轉錄激活因子 3（STAT3）信號途徑在介導心房結構重構以及房顫中起著重要作用，并且氯沙坦及他汀類藥物可以逆轉 AngⅡ介導房顫的心房重構。在持續性房顫患者中隨心房結構重構的發展左房內徑逐漸增大，然而心房肌組織中 AngⅡ/Rac1/STAT3 信號途徑表達水平的如何改變卻未有報道。本研究通過觀察風濕性心臟病合并持續性房顫患者，左心房內徑增大對心房肌組織纖維化程度以及 AngⅡ/Rac1/STAT3 信號途徑表達水平的影響，探討房顫心房結構重構機制。
1 材料與方法
1.1 臨床資料
選自 2011 年 3～12 月在我院行人工瓣膜置換術的風濕性心臟病患者 30 例，其中男 16 例、女 14 例，年齡 42～70（56.9±6.8）歲。其中 10 例竇性心律患者為對照組（A 組）；合并持續性房顫 20 例患者為病例組，并按左心房內徑（left atrial dimension，LAD）分為兩組，B 組 LAD 50～65 mm（n=10），C 組 LAD>65 mm（n=10）。診斷符合 2006 年美國心臟病學學會和美國心臟學會（ACC/AHA）房顫指南中房顫分類標準。術前經十二導聯心電圖、24 h 動態心電圖、心臟超聲心動圖及術后病理診斷確診，并排除近 3 個月口服血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（ARB）及他汀類藥物患者。所有患者均簽署有關知情同意書，并獲得沈陽軍區總醫院倫理委員會許可。
1.2 主要試劑
人 Ang Ⅱ 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國 Peninsula 公司）、蛋白酶抑制劑（美國 Thermo 公司）、兔抗人 Rac1 多克隆抗體（美國 Santa Cruz 公司）、鼠抗人 STAT3 多克隆抗體（美國 CST 公司）、鼠抗人 GAPDH 單克隆抗體（美國 Santa Cruz 公司）、辣根酶標記山羊抗小鼠 IgG（美國 Santa Cruz 公司）。心房肌組織細胞漿蛋白質提取裂解液成分：HEPES（10 mmol/L，pH 7.90）、KCl（10.0 mmol/L）、MgCl2·6H2O（1.50 mmol/L）、DTT（1.0 mmol/L）、PMSF（1.0 mmol/L）、NaF（25 mmol/L），Na3VO4（1 mmol/L）、蛋白酶抑制劑（1 μl/ml）。
1.3 實驗方法
1.3.1 標本采集
患者在術中建立體外循環后立即獲取右心耳標本重量約 300 mg。標本經修剪去除脂肪后，用 10% 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗凈后置于液氮中保存。
1.3.2 HE 及 Masson 染色
將部分心房肌組織以 10% PBS 中性甲醛固定，經脫水、清洗、石蠟包埋后制成切片，行 HE 及 Masson 染色作組織病理學檢測，觀察心房肌組織細胞形態及纖維化程度。采用顯微圖像分析系統檢測 Masson 染色纖維化區域面積值（ECM%），每張切片測定 10 個任意視野。
1.3.3 提取心肌組織胞漿蛋白質
從液氮中取出心房肌組織樣品解凍后剪碎，加入裂解液（按 1.0 g/3.0 ml）勻漿。將勻漿組織轉移至 EP 管內在冰上孵育 10 min，經 14 000 g×15 min，4℃ 離心吸取上清液 即為心房肌組織胞漿蛋白質，分裝后–80℃ 保存。
1.3.4 ELISA 分析
采用 ELISA 檢測心房肌組織胞漿蛋白質的 AngⅡ 濃度。用酶標儀在 450 nm 波長下依序測量各孔光密度（OD）值，制作標準曲線。
1.3.5 蛋白印跡定量分析
采用 Western blotting 檢測心房肌組織胞漿蛋白質中 Rac1（22kD）、STAT3（86kD）蛋白含量。其中 Ⅰ 抗比例 Rac1（1∶500）、STAT3（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）；Ⅱ 抗比例均為 1∶5 000。用 GAPDH 作為對照，進行定量分析。
1.4 統計學分析
采用 SPSS17.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（
±s）表示，多組之間均數比較采用單因素方差分析，實驗數據與左心房內徑之間的相關性分析用 Pearson 相關分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 臨床資料特征
所有風濕性心臟病患者臨床資料結果見表 1。房顫患者左心房內徑與對照組比較明顯增大，B 組與 A 組比較［（59.3±2.4）mm vs. （43.5±6.1）mm，P<0.05］，C 組與 A 組比較［（76.7±11.2）mmvs.（43.5±6.1）mm，P<0.001］，差異有統計學意義。而患者其他臨床資料特征，如年齡、性別構成比、左室射血分數等均無顯著差異。
表1
3 組患者臨床資料特征（
/例）
2.2 心肌組織細胞形態及纖維化改變
心房肌組織 HE 及 Masson 染色鏡下觀察結果見圖 1。A 組心肌細胞排列整齊，胞漿鮮紅豐富染色均勻，細胞核呈卵圓形位于中央較均一，心肌纖維束周圍僅見少量間質膠原纖維沉積；B、C 組心肌細胞肥大，細胞數目減少，肌纖維排列紊亂逐漸加重，細胞核大小不均一，心肌細胞周圍可見大量藍色膠原纖維分割包繞。計算 Masson 染色 ECM% 值結果見圖 2，B 組與 A 組比較（10.19%±2.56% vs. 5.21%±2.71%，P<0.05），C 組與 A 組比較（17.35%±2.01%vs. 5.21%±2.71%，P<0.001），C 組與 B 組比較（17.35%±2.01%vs. 10.19%±2.56%，P<0.001），差異均有統計學意義。結果顯示心房肌組織纖維化程度隨左心房內徑增大明顯增強，并與左心房內徑呈正相關（r=0.994 2，P=0.048 3）。
圖1
心房肌組織 HE 及 Masson 染色（×200）
圖2
Masson 染色纖維化區域面積值（ECM%）
*
2.3 ELISA 分析
ELISA 檢測心房肌組織胞漿蛋白質 AngⅡ濃度結果見圖 3。B 組與 A 組比較，差異無統計學意義［（1.61±0.41）pg/mg vs. （0.93±0.33）pg/mg，P=0.321］。C 組與 A 組比較［（4.59±2.56）pg/mg vs. （0.93±0.33）pg/mg，P<0.001］，C 組與 B 組比較［（4.59±2.56）pg/mgvs. （1.61±0.41）pg/mg，P<0.001］，差異有統計學意義。可見心房肌組織中 AngⅡ濃度隨左心房內徑增大明顯增加，并與左心房內徑呈正相關（r=0.886，P<0.01）。
圖3
ELISA 檢測心房肌組織 AngⅡ（pg/mg 蛋白）濃度
a：風濕性心臟病患者房顫組與對照組比較，心房肌組織中 AngⅡ 濃度明顯增加，*
2.4 蛋白印跡定量分析
Western blotting 檢測心房肌組織胞漿蛋白質的 Rac1 蛋白含量結果見圖 4。C 組與 A 組比較，差異有統計學意義（0.535±0.275 vs. 0.229±0.088，P<0.01）。B 組與 A 組比較（0.373±0.175vs. 0.229±0.088，P=0.112），C 組與 B 組比較（0.535±0.275 vs. 0.373±0.175，P=0.074），差異無統計學意義。心房肌組織中 Rac1 蛋白隨左心房內徑增大表達水平增強，并與左心房內徑呈正相關（r=0.758，P<0.01）。
圖4
Western blotting 檢測心房肌組織胞漿蛋白質的 Rac1 蛋白含量結果
a：蛋白印跡法檢測心房肌組織 Rac1 蛋白含量；b：風濕性心臟病患者房顫組與對照組比較，心房肌組織中 Rac1 蛋白含量明顯增加，*
Western blotting 檢測心房肌組織胞漿蛋白質的 STAT3 蛋白含量結果見圖 5。B 組與 A 組比較（0.773±0.376 vs. 0.436±0.099，P<0.05），C 組與 A 組比較（0.990±0.469vs. 0.436±0.099，P<0.05），差異有統計學意義，C 組與 B 組比較，差異無統計學意義（0.990±0.469vs. 0.773±0.376，P=0.179）。心房肌組織中 STAT3 蛋白隨左心房內徑增大表達水平增強，并與左心房內徑呈正相關（r=0.602，P<0.01）。
圖5
Western blotting 檢測心房肌組織胞漿蛋白質的 STAT3 蛋白含量
a：蛋白印跡法檢測心房肌組織 STAT3 蛋白含量；b：風濕性心臟病患者房顫組與對照組比較，心房肌組織中 STAT3 蛋白含量明顯增加，*
3 討論
心房結構重構最重要特征是心房纖維化[3]。而心房纖維化與細胞外基質重塑共同構成了心房擴張的核心機制，引起心房內徑的增加。此外 Spach 等[8]研究顯示，房顫的發生隨著心房纖維化程度的增加而增加，表明心房纖維化是房顫發生與持續的重要因素。本研究證實風濕性心臟病合并持續性房顫患者，心房纖維化程度隨左房內徑增大明顯增強，符合心房結構重構的特征。
研究發現，房顫時心房 AngⅡ 激活增強是引起心房纖維化的主要原因[9]。AngⅡ 通過與 AngⅡ1 型受體（AT1R）結合，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的磷酸化級聯反應，而 MAPKs 是刺激成纖維細胞增殖，引起細胞肥大及凋亡的重要調節因子[10-12]。AT1R 介導的信號途徑大多數通過與 G 蛋白偶聯受體結合。AngⅡ 與 AT1R 結合通過 G 蛋白激活 Src 家族激酶（c-Src），而 Src/Grb2/SOS 復合物形成導致鳥苷三磷酸酶（GTPase）、Ras 蛋白的激活[13]。除此 GTPase-Ras 與 MAPKs 相互作用，使細胞外信號調節激酶（ERKs）1、2（MEK-1、MEK-2）激活，最終 MEK-1 與 MEK-2 磷酸化使 AngⅡ 激活 MAPKs 信號級聯反應擴大[11]。本研究證實風濕性心臟病合并持續性房顫患者，心房肌組織中 AngⅡ 濃度隨著左房內徑增大增加明顯，可見房顫時心房肌組織中 AngⅡ 激活增強。
研究顯示在心臟特征性過度表達 Rac1 的轉基因小鼠模型（RacET）的心房結構改變中，出現明顯的心房擴張以及通過 Rac1 下調 PAK 的激活促進了心房結構的改變[14]。 而 Tsai 等[7]研究發現 AngⅡ 誘導 PAK 的激活出現在心房成纖維細胞中而并非心房肌細胞，因此 AngⅡ/Rac1 介導的心房結構重構機制可能是通過心房成纖維細胞促進了心房纖維化。Rac1 作為小 GTP 結合蛋白是 Rho GTP 酶超家族成員介導細胞內信號轉導因子，參與調節依賴 NADPH 的氧化應激途徑[15]。在房顫患者與動物房顫模型的心房組織中 Rac1 激活以及 Rac1 介導 NADPH 產生的超氧化物陰離子增加[16-17]。由此可知 Rac1 激活上調與房顫發病機制有關。本研究發現風濕性心臟病合并持續性房顫患者，心房肌組織 Rac1 蛋白隨著左房內徑增大表達水平增強。我們推測 Rac1 蛋白表達水平增強與 AngⅡ 激活及氧化應激有關。Adam 等[14]研究應用羅舒伐他汀治療 RacET 小鼠降低了房顫的發生率。這些研究顯示應用他汀類藥物抑制 AngⅡ 誘導 Rac1 的激活有利于預防心房重構與房顫的發生。他汀類藥物抑制 AngⅡ 誘導的心肌氧化應激增加以及抑制 Rac1 介導煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶激活產生的心房重構，同時降低了術后患者房顫的發生率[18-19]。
STAT3 屬于 STAT 蛋白家族中的細胞質轉錄因子，AngⅡ 通過 AT1R 激活 STAT3[20]。研究顯示心肌過度表達 AT1R 小鼠轉基因模型（AT1R-TG）中，出現心臟顯著肥厚及心肌重構[21]。而最近研究發現在小鼠 AT1R-TG 模型中，STAT3 中 Tyr705 或 Ser727 磷酸化過程未受到影響，然而觀察到 STAT3 的信使 RNA（mRNA）和總蛋白量增加。在此小鼠 AT1R-TG 模型中，未磷酸化的 STAT3 在細胞核中蓄積同時與啟動因子 p300 結合，引起心臟發生肥厚和功能障礙[22]。此研究說明了通過 AT1R 介導上調 STAT3 的表達，而未磷酸化的 STAT3 促進了心臟重構。Tsai 等[7]認為在心房肌細胞和成纖維細胞中 AngⅡ 誘導激活 STAT3 存在兩種不同的信號轉導機制，然而必須通過 Rac1 因子。在心房肌細胞 AngⅡ 可能直接通過 Rac1 激活 STAT3 和通過 JAK 或者 TYK 獨立機制激活 STAT3。而在心房成纖維細胞中 AngⅡ 激活 STAT3 需要 Rac1 誘導自分泌或旁分泌因子和 JAK 機制。本研究發現風濕性心臟病合并持續性房顫患者，心房肌組織 STAT3 蛋白隨著左房內徑增大表達水平增強，可見房顫時心房肌組織中 STAT3 激活增強。
我們的研究表明在風濕性心臟病合并持續性房顫患者心房肌組織中，心房肌纖維化程度及 AngⅡ/Rac1/STAT3 信號途徑隨表達水平左房內徑增大明顯增強，抑制該途徑的表達，可能延緩房顫心房結構重構的發展。本研究的局限性，因心臟外科手術的特殊性，為防止左房出血并未能獲取左心耳心肌組織。同時未能排除三尖瓣反流和肺動脈壓力對心房纖維化的影響以及口服藥物藥理作用和相關細胞因子的干預。此外本研究為非隨機對照試驗，病例樣本數偏少，未來可以增加樣本數量和動物模型進一步研究。
