引用本文： 王牧野, 廖辰, 王麗娟, 仝傳迪, 高偉. 內皮祖細胞減少肺移植后的缺血-再灌注損傷. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(7): 610-615. doi: 10.7507/1007-4848.201709064 復制
肺缺血-再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury， LIRI）是肺移植（lung transportation，LT）后急性期主要死亡原因之一。約 20%~35% 的患者 LT 后發生 LIRI。LIRI 的主要機制為血管內皮細胞損傷，繼而激活核轉錄因子（nuclear factor，NF） -κB，從而引起嚴重的局部炎癥反應。移植肺組織內產生的大量炎癥因子通過血流釋放至外周血，從而引發全身炎癥反應。
內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）具有促進血管內皮細胞修復和再生的能力，同時具有免疫調節作用。EPC 通過抑制炎癥反應減輕內毒素導致的肺損傷和心肌缺血-再灌注損傷[1]。但 EPC 對 LT 后 LIRI 是否有治療作用還未見報道。本研究通過建立大鼠 LT 模型，并給予 EPC，觀察 EPC 對于 LIRI 的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和灌注方法
本實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。
選用 Wistar 大鼠 48 只，體重 250~300 g，抽取大鼠外周血，利用密度-梯度離心獲得單個核細胞，在 37℃、5% CO2 細胞生長培養基 EGM 中培養 10 d，通過 0.025% 胰蛋白酶–0.02% 乙二胺四乙酸收取粘附細胞，獲取 EPC。EPC 與 Dil-ac LDL 在 37℃ 孵育 1 h，PBS 清洗后，與 FITC-UEA-1 孵育 1 h，共聚焦顯微鏡鑒定 VEGFR2 和 CD34 [2]雙陽性細胞為 EPC[3-4]。24 只供體鼠給予腹腔內注射 3% 的巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，肝素化后打開胸腔，經右心室置管（16G）以 20 cm H2O 的壓力將 20 ml、4℃ 的生理鹽水注入肺動脈沖洗左肺。心-肺取出后于顯微鏡下進行左側肺門分離，并將左肺動、靜脈及左主支氣管與 cuff 管[5]連接（套袖法）[6]，建立肺移植模型。
將 24 只 Wistar 受體大鼠隨機分成假手術（shame）組，LIRI 組和 EPC（n=8）組。Shame 組大鼠僅接受麻醉，LIRI 和 EPC 組大鼠腹腔內注射 3% 的巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，氣管插管后行機械通氣（型號 683，Harvard Apparatus，Boston，MA，USA）。呼吸參數為：潮氣量為 10 ml/kg；呼吸頻率為 50 次/分鐘；吸入 50% O2+50% N2 混合氣；吸呼比為 1∶1。左側第 4、5 肋間開胸后，顯微鏡下暴露且分離左主支氣管和左肺動、靜脈。分離后，進行 LT[7]。手術過程中大鼠體溫維持在 37～39 ℃。
LT 再灌注后，PBS 組和 EPC 組分別靜脈給予 PBS 1 ml 或 EPC（約 1×106溶于 1 ml PBS 中）。待受體恢復自主呼吸，拔管并在無菌條件下飼養 24 h。再灌注 24 h 后，3 組大鼠肝素化，采集外周血、離心取上清。開胸經右心室置管，20 ml 4 ℃ 生理鹽水以 20 cm H2O 壓力沖洗移植肺。
部分用于制備組織勻漿（1∶9 比例），BCA 法測量移植肺組織勻漿中蛋白濃度；部分肺組織測量重量后于 80℃ 烘干 48 h，并測量重量，計算濕干重比。通過酶聯免疫法測量血清中炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 的濃度。組織學分析由 2 位獨立于本研究的病理專家評估。
1.2 統計學分析
所有數據使用 SPSS 統計軟件 19.0 進行分析。正態分布數據以均數±標準差（
）表示，采用單時間點的未配對 t 檢驗或重復測量方差分析進行比較。P<0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 EPC 的鑒定
培育 10 d 后，共收集約（8~10）×106個 EPC （圖1a）。通過熒光顯微鏡觀察 EPC 表面標記物 VEGFR-2 和 CD34，（圖 1b、圖 1c）。利用 EPC 吞噬 UEA-1 和 DiI-ac-LDL，能夠進一步確認（圖 1）。
圖1
EPC 熒光鑒定染色（400 倍）
a：單層 EPC；b：VEGFR-2 陽性細胞（紅色）；c：CD34 陽性細胞（綠色）；d：DiI-acLDL 陽性細胞（紅色）；e：UEA-1 陽性細胞（綠色）；f：DiI-acLDL 和 UEA 雙陽性細胞（黃色）
2.2 EPC 在移植肺組織的分布
LT 后，EPC 組注射孵育 DiI-acetyl-LDL 后的 EPC。肺移植 24 h 后，肺組織切片孵育 CD34 抗體 1 h，通過免疫熒光檢查判斷 EPC 在移植肺中的分布。圖 2a 為攜帶 DiI-acetyl-LDL 的細胞，圖2b 為移植肺組織中 CD34 表達陽性的細胞，圖 2c 為細胞核染色，圖2d 為 LDL 和 CD34 雙陽性細胞在肺內的分布。
圖2
EPC 在移植肺組織的檢測（200 倍）
通過熒光顯微鏡下觀察 Dil-acLDL 和 CD34 在肺組織中表達情況，判斷 EPC 在移植肺中的分布情況；a：組織切片中 Dil-acLDL 細胞；b：CD34 表達陽性細胞；c：細胞核染色；d：Dil-acLDL 和 CD34 雙反應陽性細胞
2.3 EPC 對肺泡毛細血管通透性的影響
再灌注 24 h 之后，LIRI 和 EPC 組氧合指數低于 shame 組，濕干比及蛋白質濃度高于 shame 組（P<0.05）。與 LIRI 組比較，EPC 組的氧合指數升高，濕干比和蛋白質濃度降低（P<0.05，圖 3）。
圖3
EPC 對移植肺毛細血管通透性的影響
2.4 EPC 對肺移植后炎癥反應的影響
再灌注 24 h 后，LIRI 組和 EPC 組外周血中腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-6 和 IL-10 高于 shame 組上升（P<0.05），與 LIRI 組比較，EPC 組外周血中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 降低，而 IL-10 升高（P<0.05，圖 4）。
圖4
EPC 對缺血-再灌注引起的炎癥反應的作用
LIRI 組和 EPC 組移植肺組織中 NF-κB 表達多于 shame 組（P<0.05），與 LIRI 組比較，EPC 組 NF-κB 表達降低（P<0.05，圖 5）。
圖5
移植肺中 ET-1、eNOS、iNOS、MLC、NF-κB、Bax、Bcl-2 和活化型半胱天冬酶-3 表達情況
2.5 內皮祖細胞減少組織損傷
LT 24 h 后，與 shame 組比較，LIRI 和 EPC 組移植肺出現典型的病理學改變，包括嚴重的肺水腫、肺泡壁增厚、肺泡斷裂、透明膜形成和出血。與 LIRI 組比較，EPC 組的肺損傷明顯少于 PBS 組（圖 6）。
圖6
EPC 減少移植肺的組織病理學損傷（a、b、c：200 倍；d、e、f：400 倍）
a、d：假手術組正常肺組織；b、e：PBS 組；c、f：EPC 組
3 討論
本研究結果證實，EPC 可以改善 LT 后肺泡毛細血管通透性和換氣功能，抑制 LT 后炎癥反應，減輕 LT 的組織學損傷[8]。
LIRI 中，內皮細胞缺氧、再氧合，激活內皮細胞核轉錄因子，釋放大量的炎癥因子[9]，導致移植肺嚴重損傷。移植肺內的炎癥因子還可以隨著再灌注血流釋放到外周血中，引發全身炎癥反應，甚至導致肺外器官的損傷 [10-12]。EPC 對急性肺損傷和心臟 IRI 損傷有治療作用。本研究通過建立肺移植模型給予 EPC，觀察其對 LIRI 的作用及其機制。
結果顯示，EPC 可以降低 LT 后組織濕干重比和蛋白濃度、提高氧合指數。說明 EPC 可以改善 LT 后肺泡毛細血管通透性，改善移植肺組織換氣功能。組織學檢查顯示，EPC 可以減輕 LT 后組織損傷，減少肺內出血和炎癥細胞的浸潤、減輕肺泡水腫、抑制肺泡透明膜的形成。說明 EPC 可以減輕 LT 后的組織損傷。
考慮到炎癥反應在 LIRI 中的關鍵作用，本研究通過測量外周血中炎癥因子的濃度，探討 EPC 對 IRI 損傷的作用機制。缺血-再灌注促進了核轉錄因子的磷酸化，并且觸發了炎癥細胞的激活以及化學趨化因子的形成[13-14]，進而促進巨噬細胞、中性粒細胞向損傷部位趨化、浸潤并釋放大量細胞因子。本研究結果顯示，EPC 可以減少外周血中促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 的釋放，這一結果與先前文獻報道結果一致[15]。同時，EPC 還可以促進 IL-10 的生成。IL-10 能夠對抗 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的作用，并且抑制炎癥細胞的遷移[16]。因此，IL-10 也是 EPC 抗炎的作用機制之一。由于 NF-κB 在炎癥反應中的核心作用，本研究測量移植肺組織中 NF-κB 的表達情況，結果顯示，EPC 可以減少抑制肺組織中 NF-κB 的表達。因此，我們推測，EPC 對 IRI 后炎癥反應的治療作用可能是通過其對 NF-κB 的抑制作用而實現的。
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綜上，本研究結果表明 EPC 能夠減少肺的缺血-再灌注損傷。EPC 對 IRI 的保護可能由于內皮祖細胞能夠改善內皮的功能和結構，調控 NF-κB 的磷酸化和炎癥反應有關。
肺缺血-再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury， LIRI）是肺移植（lung transportation，LT）后急性期主要死亡原因之一。約 20%~35% 的患者 LT 后發生 LIRI。LIRI 的主要機制為血管內皮細胞損傷，繼而激活核轉錄因子（nuclear factor，NF） -κB，從而引起嚴重的局部炎癥反應。移植肺組織內產生的大量炎癥因子通過血流釋放至外周血，從而引發全身炎癥反應。
內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）具有促進血管內皮細胞修復和再生的能力，同時具有免疫調節作用。EPC 通過抑制炎癥反應減輕內毒素導致的肺損傷和心肌缺血-再灌注損傷[1]。但 EPC 對 LT 后 LIRI 是否有治療作用還未見報道。本研究通過建立大鼠 LT 模型，并給予 EPC，觀察 EPC 對于 LIRI 的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和灌注方法
本實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。
選用 Wistar 大鼠 48 只，體重 250~300 g，抽取大鼠外周血，利用密度-梯度離心獲得單個核細胞，在 37℃、5% CO2 細胞生長培養基 EGM 中培養 10 d，通過 0.025% 胰蛋白酶–0.02% 乙二胺四乙酸收取粘附細胞，獲取 EPC。EPC 與 Dil-ac LDL 在 37℃ 孵育 1 h，PBS 清洗后，與 FITC-UEA-1 孵育 1 h，共聚焦顯微鏡鑒定 VEGFR2 和 CD34 [2]雙陽性細胞為 EPC[3-4]。24 只供體鼠給予腹腔內注射 3% 的巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，肝素化后打開胸腔，經右心室置管（16G）以 20 cm H2O 的壓力將 20 ml、4℃ 的生理鹽水注入肺動脈沖洗左肺。心-肺取出后于顯微鏡下進行左側肺門分離，并將左肺動、靜脈及左主支氣管與 cuff 管[5]連接（套袖法）[6]，建立肺移植模型。
將 24 只 Wistar 受體大鼠隨機分成假手術（shame）組，LIRI 組和 EPC（n=8）組。Shame 組大鼠僅接受麻醉，LIRI 和 EPC 組大鼠腹腔內注射 3% 的巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，氣管插管后行機械通氣（型號 683，Harvard Apparatus，Boston，MA，USA）。呼吸參數為：潮氣量為 10 ml/kg；呼吸頻率為 50 次/分鐘；吸入 50% O2+50% N2 混合氣；吸呼比為 1∶1。左側第 4、5 肋間開胸后，顯微鏡下暴露且分離左主支氣管和左肺動、靜脈。分離后，進行 LT[7]。手術過程中大鼠體溫維持在 37～39 ℃。
LT 再灌注后，PBS 組和 EPC 組分別靜脈給予 PBS 1 ml 或 EPC（約 1×106溶于 1 ml PBS 中）。待受體恢復自主呼吸，拔管并在無菌條件下飼養 24 h。再灌注 24 h 后，3 組大鼠肝素化，采集外周血、離心取上清。開胸經右心室置管，20 ml 4 ℃ 生理鹽水以 20 cm H2O 壓力沖洗移植肺。
部分用于制備組織勻漿（1∶9 比例），BCA 法測量移植肺組織勻漿中蛋白濃度；部分肺組織測量重量后于 80℃ 烘干 48 h，并測量重量，計算濕干重比。通過酶聯免疫法測量血清中炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 的濃度。組織學分析由 2 位獨立于本研究的病理專家評估。
1.2 統計學分析
所有數據使用 SPSS 統計軟件 19.0 進行分析。正態分布數據以均數±標準差（
）表示，采用單時間點的未配對 t 檢驗或重復測量方差分析進行比較。P<0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 EPC 的鑒定
培育 10 d 后，共收集約（8~10）×106個 EPC （圖1a）。通過熒光顯微鏡觀察 EPC 表面標記物 VEGFR-2 和 CD34，（圖 1b、圖 1c）。利用 EPC 吞噬 UEA-1 和 DiI-ac-LDL，能夠進一步確認（圖 1）。
圖1
EPC 熒光鑒定染色（400 倍）
a：單層 EPC；b：VEGFR-2 陽性細胞（紅色）；c：CD34 陽性細胞（綠色）；d：DiI-acLDL 陽性細胞（紅色）；e：UEA-1 陽性細胞（綠色）；f：DiI-acLDL 和 UEA 雙陽性細胞（黃色）
2.2 EPC 在移植肺組織的分布
LT 后，EPC 組注射孵育 DiI-acetyl-LDL 后的 EPC。肺移植 24 h 后，肺組織切片孵育 CD34 抗體 1 h，通過免疫熒光檢查判斷 EPC 在移植肺中的分布。圖 2a 為攜帶 DiI-acetyl-LDL 的細胞，圖2b 為移植肺組織中 CD34 表達陽性的細胞，圖 2c 為細胞核染色，圖2d 為 LDL 和 CD34 雙陽性細胞在肺內的分布。
圖2
EPC 在移植肺組織的檢測（200 倍）
通過熒光顯微鏡下觀察 Dil-acLDL 和 CD34 在肺組織中表達情況，判斷 EPC 在移植肺中的分布情況；a：組織切片中 Dil-acLDL 細胞；b：CD34 表達陽性細胞；c：細胞核染色；d：Dil-acLDL 和 CD34 雙反應陽性細胞
2.3 EPC 對肺泡毛細血管通透性的影響
再灌注 24 h 之后，LIRI 和 EPC 組氧合指數低于 shame 組，濕干比及蛋白質濃度高于 shame 組（P<0.05）。與 LIRI 組比較，EPC 組的氧合指數升高，濕干比和蛋白質濃度降低（P<0.05，圖 3）。
圖3
EPC 對移植肺毛細血管通透性的影響
2.4 EPC 對肺移植后炎癥反應的影響
再灌注 24 h 后，LIRI 組和 EPC 組外周血中腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-6 和 IL-10 高于 shame 組上升（P<0.05），與 LIRI 組比較，EPC 組外周血中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 降低，而 IL-10 升高（P<0.05，圖 4）。
圖4
EPC 對缺血-再灌注引起的炎癥反應的作用
LIRI 組和 EPC 組移植肺組織中 NF-κB 表達多于 shame 組（P<0.05），與 LIRI 組比較，EPC 組 NF-κB 表達降低（P<0.05，圖 5）。
圖5
移植肺中 ET-1、eNOS、iNOS、MLC、NF-κB、Bax、Bcl-2 和活化型半胱天冬酶-3 表達情況
2.5 內皮祖細胞減少組織損傷
LT 24 h 后，與 shame 組比較，LIRI 和 EPC 組移植肺出現典型的病理學改變，包括嚴重的肺水腫、肺泡壁增厚、肺泡斷裂、透明膜形成和出血。與 LIRI 組比較，EPC 組的肺損傷明顯少于 PBS 組（圖 6）。
圖6
EPC 減少移植肺的組織病理學損傷（a、b、c：200 倍；d、e、f：400 倍）
a、d：假手術組正常肺組織；b、e：PBS 組；c、f：EPC 組
3 討論
本研究結果證實，EPC 可以改善 LT 后肺泡毛細血管通透性和換氣功能，抑制 LT 后炎癥反應，減輕 LT 的組織學損傷[8]。
LIRI 中，內皮細胞缺氧、再氧合，激活內皮細胞核轉錄因子，釋放大量的炎癥因子[9]，導致移植肺嚴重損傷。移植肺內的炎癥因子還可以隨著再灌注血流釋放到外周血中，引發全身炎癥反應，甚至導致肺外器官的損傷 [10-12]。EPC 對急性肺損傷和心臟 IRI 損傷有治療作用。本研究通過建立肺移植模型給予 EPC，觀察其對 LIRI 的作用及其機制。
結果顯示，EPC 可以降低 LT 后組織濕干重比和蛋白濃度、提高氧合指數。說明 EPC 可以改善 LT 后肺泡毛細血管通透性，改善移植肺組織換氣功能。組織學檢查顯示，EPC 可以減輕 LT 后組織損傷，減少肺內出血和炎癥細胞的浸潤、減輕肺泡水腫、抑制肺泡透明膜的形成。說明 EPC 可以減輕 LT 后的組織損傷。
考慮到炎癥反應在 LIRI 中的關鍵作用，本研究通過測量外周血中炎癥因子的濃度，探討 EPC 對 IRI 損傷的作用機制。缺血-再灌注促進了核轉錄因子的磷酸化，并且觸發了炎癥細胞的激活以及化學趨化因子的形成[13-14]，進而促進巨噬細胞、中性粒細胞向損傷部位趨化、浸潤并釋放大量細胞因子。本研究結果顯示，EPC 可以減少外周血中促炎因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 的釋放，這一結果與先前文獻報道結果一致[15]。同時，EPC 還可以促進 IL-10 的生成。IL-10 能夠對抗 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的作用，并且抑制炎癥細胞的遷移[16]。因此，IL-10 也是 EPC 抗炎的作用機制之一。由于 NF-κB 在炎癥反應中的核心作用，本研究測量移植肺組織中 NF-κB 的表達情況，結果顯示，EPC 可以減少抑制肺組織中 NF-κB 的表達。因此，我們推測，EPC 對 IRI 后炎癥反應的治療作用可能是通過其對 NF-κB 的抑制作用而實現的。
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綜上，本研究結果表明 EPC 能夠減少肺的缺血-再灌注損傷。EPC 對 IRI 的保護可能由于內皮祖細胞能夠改善內皮的功能和結構，調控 NF-κB 的磷酸化和炎癥反應有關。
