引用本文： 劉濤燕, 崔魏, 李弘夏, 吳福建, 蘭峰. 重組人血清白蛋白體外誘導干細胞向心肌細胞的分化. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(7): 604-609. doi: 10.7507/1007-4848.201705038 復制
心血管疾病是世界上死亡率最高的疾病之一，其中缺血性心臟病占絕大多數，因心肌細胞結構損傷導致心臟功能不可逆轉性改變，健存心肌細胞的代償能力不能滿足機體需求，而各種保守治療手段亦不能從根本上解決問題，心臟移植因受心臟移植供體來源、移植物抗宿主反應等方面的限制，使得至今仍無有效的治療方案，因此亟需一種新型的個體化治療方案，如疾病特異性或患者個體化藥物，抑或再生醫學的心臟組織[1]。近年來，干細胞生物學的飛速發展，大量的研究表明干細胞已經大范圍地應用于心血管疾病的治療及研究中[2-4]。
目前大量的研究集中在多能誘導干細胞向心肌細胞定向分化的方法的探討，現有的研究中有模擬胚胎發育的過程，激活 Activin-nodal 通路，骨形態生成蛋白（BMP），Wnt 和 FGF 信號通路誘導干細胞進入中胚層，隨后抑制 Wnt，BMP 和轉化生長因子β（TGF-β）信號通路將中胚層向心臟干細胞方向定向分化[5-8]。Lian 等[6]以 RPMI1640 培養基和 B27 細胞培養添加劑為基礎培養基，依次使用糖原合成酶激酶 3β（GSK3β）小分子抑制劑和 Wnt 小分子抑制劑調控 Wnt 信號通路使多潛能誘導干細胞向心肌細胞分化，用該方法分化可達到 83% 的分化效率，盡管如此，B27 含有 20 多種化學成分和牛血清白蛋白，牛血清白蛋白為動物源性且成分復雜，因此采用 B27 方法分化出來的心肌細胞臨床研究中存在局限性，本研究目的旨在探索一種新的且可應用于臨床研究的向心肌細胞定向分化方法
人血清白蛋白（HSA）作為人血漿中含量最豐富的蛋白，是激素、脂類等物質的轉運載體，其主要生理功能是調節血漿 pH 值和維持血漿滲透壓。植物源重組人血清白蛋白（rHSA）是一種來源于轉基因水稻的 rHSA，不含有動物源成分，能為無血清培養基提供更安全的選擇。在本研究中我們用 RMPI1640 及維生素 C 的基礎上加入不同濃度的植物源重組人血清白蛋白添加劑組成基礎培養基，成功地在體外誘導人多能干細胞分化為心肌細胞，而且達到較高的分化效率。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑
干細胞來源 NKX2.5eGFP/W-hESCs 購自北京賽貝公司。人多潛能干細胞培養基 PSCeasy 和 EDTA 購自中國 Cellapy 公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國 HyClone公司，RPMI1640 培養基購自美國 Gibco 公司，基質膠購自美國 BD 公司，Alexa Fluro 488 標記的山羊抗兔和 Alexa Fluro 594 標記的山羊抗鼠熒光二抗購自美國 Invertogen 公司。
1.1.2 主要儀器
主要儀器包括低速控溫離心機（Thermo Scientific CL10）、高速控溫離心機（Thermo）、電動移液器（Thermo scientific FinnpipetteC1）、CO2 培養箱（Thermo）、凍存管（Corning）、50 ml/15 ml 離心管、6 孔板/12 孔板、低粘附性培養皿、超凈臺、顯微鏡和水浴鍋。
1.2 方法
1.2.1 干細胞培養
取出 1 支凍存的干細胞，在 37℃ 水浴鍋內迅速融化，加入到含有 4 ml 人多潛能干細胞培養基的離心管中，200 g 5 min，吸去上清液，加入培養基重懸后加入到在 Matrigel 包被的細胞培養皿上，培養液為 PSCeasy，每 4～5 d 用 EDTA 消化后以團塊傳代。
1.2.2 誘導分化
NKX2.5eGFP/W-hESCs 培養至一定匯合度后，用帶有 6 μM CHIR99021 的 CRA3（RPMI1640，植物源 rHSA 和維生素 C 配制而成） 培養 2 d 后，更換帶有 5 μM Wnt信號抑制劑 IWP-2 的維持培養基 CRA3 處理 2 d 后，接著更換 CRA3 直至大量的自發跳動心肌細胞出現。
1.2.3 流式細胞儀分析
開啟 LSR Fortessa 流式細胞儀，啟動 BD FACSDiva Software v6.6 軟件，以標準微球（BDTMCytometer Setup&Tracking Beads，CST）校準儀器變異系數（CV）值、電壓范圍和其他參數，全部通過后即可上樣檢測。樣品用心肌消化液消化成單個細胞后，離心，用 PBS 重懸清洗，離心，用 4% 多聚甲醛固定 5～10 min 后即可上機分析。
1.2.4 RT-qPCR
提取 RNA 后用反轉錄盒提供的 RNA 逆轉錄酶進行反轉錄，得到 cDNA 模板。之后以 2 μl 模板（1∶20）稀釋+10 μl 雙鏈嵌合熒光染色法實時多聚酶鏈反應混合液（SYBR green PCR Master mix）+2 μl 引物組成的 20 μl 體系并在 Bio-Rad iQ5 實時定量 PCR 儀進行實驗，進行融解曲線分析后獲得可靠 CT 值曲線，目的基因相對表達量計算公式：2（CT 內參–CT 靶基因）。
1.2.5 免疫熒光
在鋪有蓋玻片的 24 孔板中，接種干細胞誘導分化的心肌細胞。用新鮮配制的 4% 多聚甲醛固定細胞 30 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。用 0.4% triton X-100（PBS 配制）對細胞透化處理 10 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。3% 牛血清蛋白封閉 30 min。加入一抗心肌肌鈣蛋白 T（cTnT，1∶100），4℃孵育過夜，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。加入二抗，37℃孵育 45 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。加入含 DAPI 的封片劑封片后，在熒光顯微鏡下讀片。
1.2.6 電子顯微鏡分析超微結構
用胰酶將貼壁的心肌細胞消化下來，離心吸去上清液，加入戊二醛固定過夜，脫水、浸透、包埋、切片和染色，打開 JEM-2100 電子顯微鏡觀察。
1.3 統計學分析
采用 Graphic prism 作圖及統計，計量資料以均數±標準差（
）表示，計量資料比較采用獨立樣本 t 檢驗，心肌細胞對不同濃度心臟藥物的反應采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 優化心肌細胞分化體系
為了更好地探索化學成份明確的心肌分化培養方法，本研究采用的 NKX2.5eGFP/W-hESCs 干細胞系，干細胞在向心肌細胞定向分化過程中進入心肌前體細胞階段后常以 NKX2.5 作為標記，當干細胞分化成心肌細胞后則會被檢測到綠色熒光。在 RMPI1640 及維生素 C 的基礎上分別加入不同濃度的植物源替代的 rHSA（0、50、100、200 g/L）添加劑組成基礎培養基 CRA3。人胚胎干細胞克隆界限清楚，形態扁平，細胞核質比高，當匯合度達到 75% 后，開始加入 CHIR99021，48 h 后加入 IWP-2。在 CHIR99021 加入后，干細胞開始分化，克隆形狀不斷變化，細胞同時向周圍延伸，在分化 9 d 左右開始，rHSA 濃度為 100 g/L 和 200 g/L 就能出現跳動的心肌細胞，并在熒光顯微鏡下能觀察到綠色熒光（圖 1）。而濃度為 0、50 g/L 的 rHSA 組成的基礎培養基不能分化出跳動的心肌細胞。
為了檢測不同濃度的 rHSA 分化心肌細胞的效率，我們將心肌細胞消化成單個細胞后做流式分析，結果如圖 2 所示，濃度分別為 0、50、100、200 g/L 的 rHSA 構成的心肌分化培養基的分化效率依次是 14.8%、19. 7%、26.7%、60.49%。因此后面的實驗均以 200 g/L 的 rHSA 配心肌分化培養基。
2.2 免疫熒光染色和 RT-QPCR
從分化開始每天鏡下觀察和記錄克隆的跳動情況以及跳動的頻率。心肌細胞的平均跳動頻率為 89 次/min（圖 3），在 NKX2.5eGFP/W-hESCs 分化成跳動的心肌細胞后進行心肌特異性標志物 cTNT 和 α-actinin 的免疫熒光染色，結果顯示均呈陽性（圖 4）。采用 RT-QPCR 的方法檢測了分化的第 0 d 和第 15 d 的細胞 OCT4，SOX2，NANOG，MYH7，TNNT2 等基因的表達情況，如圖 5 所示，分化第 0 d 的細胞強烈地表達干細胞多潛能因子 OCT4，SOX2，NANOG，不表達心肌特異基因如肌球蛋白重鏈 7（MYH7）和心肌肌鈣蛋白 T（TNNT2）；而分化至第 15 d 的細胞則顯著地表達 MYH7 和 TNNT2 等心肌特異性基因（圖 5）。
2.3 電子顯微鏡觀察心肌細胞超微結構
跳動 30 d 后的心肌細胞用來觀察細胞的超微結構，如圖 6 所示，心肌細胞形成雙核細胞，肌小節分散地分布在細胞內，Z 線明顯，肌小節之間有大量的線粒體為提供心肌細胞跳動需要的能量。
2.4 心肌細胞對藥物的反應
跳動的心肌細胞跳至 30 d 后給予藥物處理：β-腎上腺素受體激動劑異丙腎上腺素和 L-型鈣離子通道阻滯劑維拉帕米兩種藥物對心肌細胞的影響，結果如圖 3 所示，心肌細胞的跳動頻率隨著異丙腎上腺素濃度的上升呈劑量依賴性地加快，差異有統計學意義（F=9.842，P<0.001）；而維拉帕米的結果則與之相反，心跳速率隨著濃度的上升呈劑量依賴性地降低，但差異無統計學意義（F=2.715，P=0.08）。
圖1
顯微鏡觀察記錄成分明確分化方法心肌分化過程
圖2
流式分析檢測不同濃度的重組人血清白蛋白分化心肌細胞的效率
圖3
hiPSC-CM 對藥物的反應
*：與 0 nM異丙腎上腺素相比，
圖4
免疫熒光染色
圖5
熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異基因表達情況
*與 iPSCs 相比，
圖6
電子顯微鏡觀察心肌細胞超顯微結構
3 討論
心血管疾病是人類健康的頭號殺手，其中心肌梗死的發病率最高，目前各種保守治療手段不能從根本上解決問題，心臟移植受供體來源、移植物抗宿主反應等方面的限制給臨床治療帶來困擾，目前，干細胞及干細胞來源的心肌細胞已經大范圍地應用于心肌梗死的治療及研究，并取得了令人振奮的初步研究成果。盡管如此，研究者們一直致力于尋找一種體外誘導胚胎干細胞或多潛能干細胞分化為心肌細胞的方法，它耗費少，卻效率高、純度高、產量大并符合臨床應用的要求[9]。在本次研究中以不同濃度植物源 rHSA、維生素 C 和 RPMI1640 為基礎培養基（CRA3）依次使用 GSK3β 小分子抑制劑和 Wnt 小分子抑制劑將人多潛能干細胞分化成跳動的心肌細胞，濃度為 200 g/L 的植物源 rHSA 分化心肌細胞效率可達 60%。用該方法分化得到的心肌細胞表達心肌特異性結構蛋白 cTnT 和 α-actinin，超微結構顯示心肌胞內有明顯的肌絲及在核周圍分布大量的線粒體為心肌細胞跳動提供能量，這些結構均與人的心肌細胞相似；另外人多潛能干細胞衍生的心肌細胞（hPSC-CM）能自主性跳動，頻率 89 次/min，對心臟藥物生理反應也與人心肌細胞一致。
本研究使用 NKX2.5eGFP/W-hESCs 工具細胞株探討不同濃度植物源 rHSA，NKX2.5 基因是心肌特異性的轉錄因子，因此通過流式檢測 NKX2.5-GFP 的陽性細胞數來評估心肌細胞陽性率[10]。本研究采用的白蛋白是一種來源于轉基因水稻的 rHSA。無植物源 rHSA 的培養基分化前 6 d 無細胞死亡、細胞發生形變但無熒光表達且至第 9 d 無跳動心肌細胞，而高濃度植物源 rHSA 能得到較高分化效率。植物源 rHSA 提高誘導多能干細胞向心肌細胞分化效率的具體機制目前還不清楚，但白蛋白在培養基中扮演著多種重要的角色，包括可以作為解毒劑或緩沖劑結合脂質和過量的蛋白質、維持激素和生長肽的穩定以及能結合自由基以減少對細胞的氧化損傷。本基礎培養基中還添加了維生素 C，大量的研究報道維生素 C 可提高心肌分化效率，在心肌分化過程中不僅起到抗氧化的作用還促進心肌相關基因如 GATA4，MYH6 和 MYH7 的表達[11-13]。采用這種方法誘導分化產生的心肌細胞能為以后的干細胞臨床應用打下良好的基礎。
體外分化心肌細胞的方法有很多，大多數研究方法均以 RPMI1640 和 B27 作為基礎培養基，采用定向誘導分化系統[14-16]，即利用 activin A 和 BMP4 兩種因子的序貫作用，仿照了心臟在胚胎發育過程中激活了 nodal 和 Wnt 信號通路促進胚胎形成原腸胚進入中胚層，而后抑制 Wnt 信號通路使得中胚層細胞向心肌細胞定向分化，如穆軍升等[15]以 RPMI1640-B27 為基礎培養基，依次加入 bFGF，activin A，BMP4 等誘導因子分化效率為 66.7%。然而誘導劑大多價格昂貴，尤其是人干細胞的誘導因子增加了分化的費用。考慮到這點，我們采用小分子的分化方法，在第一階段使用 GSK-3 抑制劑 CHIR99021，將干細胞向中胚層階段分化，在第二階段使用 Wnt/β-catenin 抑制劑 IWP-2 向心肌細胞定向分化，這極大地降低了誘導成本，為體外心肌細胞分化策略具有重要的指導意義。盡管干細胞到臨床的治療應用還有一段很長的路要走，但是我們有理由相信，在不久的將來干細胞治療心力衰竭的臨床應用終究會變為現實。
心血管疾病是世界上死亡率最高的疾病之一，其中缺血性心臟病占絕大多數，因心肌細胞結構損傷導致心臟功能不可逆轉性改變，健存心肌細胞的代償能力不能滿足機體需求，而各種保守治療手段亦不能從根本上解決問題，心臟移植因受心臟移植供體來源、移植物抗宿主反應等方面的限制，使得至今仍無有效的治療方案，因此亟需一種新型的個體化治療方案，如疾病特異性或患者個體化藥物，抑或再生醫學的心臟組織[1]。近年來，干細胞生物學的飛速發展，大量的研究表明干細胞已經大范圍地應用于心血管疾病的治療及研究中[2-4]。
目前大量的研究集中在多能誘導干細胞向心肌細胞定向分化的方法的探討，現有的研究中有模擬胚胎發育的過程，激活 Activin-nodal 通路，骨形態生成蛋白（BMP），Wnt 和 FGF 信號通路誘導干細胞進入中胚層，隨后抑制 Wnt，BMP 和轉化生長因子β（TGF-β）信號通路將中胚層向心臟干細胞方向定向分化[5-8]。Lian 等[6]以 RPMI1640 培養基和 B27 細胞培養添加劑為基礎培養基，依次使用糖原合成酶激酶 3β（GSK3β）小分子抑制劑和 Wnt 小分子抑制劑調控 Wnt 信號通路使多潛能誘導干細胞向心肌細胞分化，用該方法分化可達到 83% 的分化效率，盡管如此，B27 含有 20 多種化學成分和牛血清白蛋白，牛血清白蛋白為動物源性且成分復雜，因此采用 B27 方法分化出來的心肌細胞臨床研究中存在局限性，本研究目的旨在探索一種新的且可應用于臨床研究的向心肌細胞定向分化方法
人血清白蛋白（HSA）作為人血漿中含量最豐富的蛋白，是激素、脂類等物質的轉運載體，其主要生理功能是調節血漿 pH 值和維持血漿滲透壓。植物源重組人血清白蛋白（rHSA）是一種來源于轉基因水稻的 rHSA，不含有動物源成分，能為無血清培養基提供更安全的選擇。在本研究中我們用 RMPI1640 及維生素 C 的基礎上加入不同濃度的植物源重組人血清白蛋白添加劑組成基礎培養基，成功地在體外誘導人多能干細胞分化為心肌細胞，而且達到較高的分化效率。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑
干細胞來源 NKX2.5eGFP/W-hESCs 購自北京賽貝公司。人多潛能干細胞培養基 PSCeasy 和 EDTA 購自中國 Cellapy 公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國 HyClone公司，RPMI1640 培養基購自美國 Gibco 公司，基質膠購自美國 BD 公司，Alexa Fluro 488 標記的山羊抗兔和 Alexa Fluro 594 標記的山羊抗鼠熒光二抗購自美國 Invertogen 公司。
1.1.2 主要儀器
主要儀器包括低速控溫離心機（Thermo Scientific CL10）、高速控溫離心機（Thermo）、電動移液器（Thermo scientific FinnpipetteC1）、CO2 培養箱（Thermo）、凍存管（Corning）、50 ml/15 ml 離心管、6 孔板/12 孔板、低粘附性培養皿、超凈臺、顯微鏡和水浴鍋。
1.2 方法
1.2.1 干細胞培養
取出 1 支凍存的干細胞，在 37℃ 水浴鍋內迅速融化，加入到含有 4 ml 人多潛能干細胞培養基的離心管中，200 g 5 min，吸去上清液，加入培養基重懸后加入到在 Matrigel 包被的細胞培養皿上，培養液為 PSCeasy，每 4～5 d 用 EDTA 消化后以團塊傳代。
1.2.2 誘導分化
NKX2.5eGFP/W-hESCs 培養至一定匯合度后，用帶有 6 μM CHIR99021 的 CRA3（RPMI1640，植物源 rHSA 和維生素 C 配制而成） 培養 2 d 后，更換帶有 5 μM Wnt信號抑制劑 IWP-2 的維持培養基 CRA3 處理 2 d 后，接著更換 CRA3 直至大量的自發跳動心肌細胞出現。
1.2.3 流式細胞儀分析
開啟 LSR Fortessa 流式細胞儀，啟動 BD FACSDiva Software v6.6 軟件，以標準微球（BDTMCytometer Setup&Tracking Beads，CST）校準儀器變異系數（CV）值、電壓范圍和其他參數，全部通過后即可上樣檢測。樣品用心肌消化液消化成單個細胞后，離心，用 PBS 重懸清洗，離心，用 4% 多聚甲醛固定 5～10 min 后即可上機分析。
1.2.4 RT-qPCR
提取 RNA 后用反轉錄盒提供的 RNA 逆轉錄酶進行反轉錄，得到 cDNA 模板。之后以 2 μl 模板（1∶20）稀釋+10 μl 雙鏈嵌合熒光染色法實時多聚酶鏈反應混合液（SYBR green PCR Master mix）+2 μl 引物組成的 20 μl 體系并在 Bio-Rad iQ5 實時定量 PCR 儀進行實驗，進行融解曲線分析后獲得可靠 CT 值曲線，目的基因相對表達量計算公式：2（CT 內參–CT 靶基因）。
1.2.5 免疫熒光
在鋪有蓋玻片的 24 孔板中，接種干細胞誘導分化的心肌細胞。用新鮮配制的 4% 多聚甲醛固定細胞 30 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。用 0.4% triton X-100（PBS 配制）對細胞透化處理 10 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。3% 牛血清蛋白封閉 30 min。加入一抗心肌肌鈣蛋白 T（cTnT，1∶100），4℃孵育過夜，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。加入二抗，37℃孵育 45 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min。加入含 DAPI 的封片劑封片后，在熒光顯微鏡下讀片。
1.2.6 電子顯微鏡分析超微結構
用胰酶將貼壁的心肌細胞消化下來，離心吸去上清液，加入戊二醛固定過夜，脫水、浸透、包埋、切片和染色，打開 JEM-2100 電子顯微鏡觀察。
1.3 統計學分析
采用 Graphic prism 作圖及統計，計量資料以均數±標準差（
）表示，計量資料比較采用獨立樣本 t 檢驗，心肌細胞對不同濃度心臟藥物的反應采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 優化心肌細胞分化體系
為了更好地探索化學成份明確的心肌分化培養方法，本研究采用的 NKX2.5eGFP/W-hESCs 干細胞系，干細胞在向心肌細胞定向分化過程中進入心肌前體細胞階段后常以 NKX2.5 作為標記，當干細胞分化成心肌細胞后則會被檢測到綠色熒光。在 RMPI1640 及維生素 C 的基礎上分別加入不同濃度的植物源替代的 rHSA（0、50、100、200 g/L）添加劑組成基礎培養基 CRA3。人胚胎干細胞克隆界限清楚，形態扁平，細胞核質比高，當匯合度達到 75% 后，開始加入 CHIR99021，48 h 后加入 IWP-2。在 CHIR99021 加入后，干細胞開始分化，克隆形狀不斷變化，細胞同時向周圍延伸，在分化 9 d 左右開始，rHSA 濃度為 100 g/L 和 200 g/L 就能出現跳動的心肌細胞，并在熒光顯微鏡下能觀察到綠色熒光（圖 1）。而濃度為 0、50 g/L 的 rHSA 組成的基礎培養基不能分化出跳動的心肌細胞。
為了檢測不同濃度的 rHSA 分化心肌細胞的效率，我們將心肌細胞消化成單個細胞后做流式分析，結果如圖 2 所示，濃度分別為 0、50、100、200 g/L 的 rHSA 構成的心肌分化培養基的分化效率依次是 14.8%、19. 7%、26.7%、60.49%。因此后面的實驗均以 200 g/L 的 rHSA 配心肌分化培養基。
2.2 免疫熒光染色和 RT-QPCR
從分化開始每天鏡下觀察和記錄克隆的跳動情況以及跳動的頻率。心肌細胞的平均跳動頻率為 89 次/min（圖 3），在 NKX2.5eGFP/W-hESCs 分化成跳動的心肌細胞后進行心肌特異性標志物 cTNT 和 α-actinin 的免疫熒光染色，結果顯示均呈陽性（圖 4）。采用 RT-QPCR 的方法檢測了分化的第 0 d 和第 15 d 的細胞 OCT4，SOX2，NANOG，MYH7，TNNT2 等基因的表達情況，如圖 5 所示，分化第 0 d 的細胞強烈地表達干細胞多潛能因子 OCT4，SOX2，NANOG，不表達心肌特異基因如肌球蛋白重鏈 7（MYH7）和心肌肌鈣蛋白 T（TNNT2）；而分化至第 15 d 的細胞則顯著地表達 MYH7 和 TNNT2 等心肌特異性基因（圖 5）。
2.3 電子顯微鏡觀察心肌細胞超微結構
跳動 30 d 后的心肌細胞用來觀察細胞的超微結構，如圖 6 所示，心肌細胞形成雙核細胞，肌小節分散地分布在細胞內，Z 線明顯，肌小節之間有大量的線粒體為提供心肌細胞跳動需要的能量。
2.4 心肌細胞對藥物的反應
跳動的心肌細胞跳至 30 d 后給予藥物處理：β-腎上腺素受體激動劑異丙腎上腺素和 L-型鈣離子通道阻滯劑維拉帕米兩種藥物對心肌細胞的影響，結果如圖 3 所示，心肌細胞的跳動頻率隨著異丙腎上腺素濃度的上升呈劑量依賴性地加快，差異有統計學意義（F=9.842，P<0.001）；而維拉帕米的結果則與之相反，心跳速率隨著濃度的上升呈劑量依賴性地降低，但差異無統計學意義（F=2.715，P=0.08）。
圖1
顯微鏡觀察記錄成分明確分化方法心肌分化過程
圖2
流式分析檢測不同濃度的重組人血清白蛋白分化心肌細胞的效率
圖3
hiPSC-CM 對藥物的反應
*：與 0 nM異丙腎上腺素相比，
圖4
免疫熒光染色
圖5
熒光定量 PCR 檢測心肌細胞特異基因表達情況
*與 iPSCs 相比，
圖6
電子顯微鏡觀察心肌細胞超顯微結構
3 討論
心血管疾病是人類健康的頭號殺手，其中心肌梗死的發病率最高，目前各種保守治療手段不能從根本上解決問題，心臟移植受供體來源、移植物抗宿主反應等方面的限制給臨床治療帶來困擾，目前，干細胞及干細胞來源的心肌細胞已經大范圍地應用于心肌梗死的治療及研究，并取得了令人振奮的初步研究成果。盡管如此，研究者們一直致力于尋找一種體外誘導胚胎干細胞或多潛能干細胞分化為心肌細胞的方法，它耗費少，卻效率高、純度高、產量大并符合臨床應用的要求[9]。在本次研究中以不同濃度植物源 rHSA、維生素 C 和 RPMI1640 為基礎培養基（CRA3）依次使用 GSK3β 小分子抑制劑和 Wnt 小分子抑制劑將人多潛能干細胞分化成跳動的心肌細胞，濃度為 200 g/L 的植物源 rHSA 分化心肌細胞效率可達 60%。用該方法分化得到的心肌細胞表達心肌特異性結構蛋白 cTnT 和 α-actinin，超微結構顯示心肌胞內有明顯的肌絲及在核周圍分布大量的線粒體為心肌細胞跳動提供能量，這些結構均與人的心肌細胞相似；另外人多潛能干細胞衍生的心肌細胞（hPSC-CM）能自主性跳動，頻率 89 次/min，對心臟藥物生理反應也與人心肌細胞一致。
本研究使用 NKX2.5eGFP/W-hESCs 工具細胞株探討不同濃度植物源 rHSA，NKX2.5 基因是心肌特異性的轉錄因子，因此通過流式檢測 NKX2.5-GFP 的陽性細胞數來評估心肌細胞陽性率[10]。本研究采用的白蛋白是一種來源于轉基因水稻的 rHSA。無植物源 rHSA 的培養基分化前 6 d 無細胞死亡、細胞發生形變但無熒光表達且至第 9 d 無跳動心肌細胞，而高濃度植物源 rHSA 能得到較高分化效率。植物源 rHSA 提高誘導多能干細胞向心肌細胞分化效率的具體機制目前還不清楚，但白蛋白在培養基中扮演著多種重要的角色，包括可以作為解毒劑或緩沖劑結合脂質和過量的蛋白質、維持激素和生長肽的穩定以及能結合自由基以減少對細胞的氧化損傷。本基礎培養基中還添加了維生素 C，大量的研究報道維生素 C 可提高心肌分化效率，在心肌分化過程中不僅起到抗氧化的作用還促進心肌相關基因如 GATA4，MYH6 和 MYH7 的表達[11-13]。采用這種方法誘導分化產生的心肌細胞能為以后的干細胞臨床應用打下良好的基礎。
體外分化心肌細胞的方法有很多，大多數研究方法均以 RPMI1640 和 B27 作為基礎培養基，采用定向誘導分化系統[14-16]，即利用 activin A 和 BMP4 兩種因子的序貫作用，仿照了心臟在胚胎發育過程中激活了 nodal 和 Wnt 信號通路促進胚胎形成原腸胚進入中胚層，而后抑制 Wnt 信號通路使得中胚層細胞向心肌細胞定向分化，如穆軍升等[15]以 RPMI1640-B27 為基礎培養基，依次加入 bFGF，activin A，BMP4 等誘導因子分化效率為 66.7%。然而誘導劑大多價格昂貴，尤其是人干細胞的誘導因子增加了分化的費用。考慮到這點，我們采用小分子的分化方法，在第一階段使用 GSK-3 抑制劑 CHIR99021，將干細胞向中胚層階段分化，在第二階段使用 Wnt/β-catenin 抑制劑 IWP-2 向心肌細胞定向分化，這極大地降低了誘導成本，為體外心肌細胞分化策略具有重要的指導意義。盡管干細胞到臨床的治療應用還有一段很長的路要走，但是我們有理由相信，在不久的將來干細胞治療心力衰竭的臨床應用終究會變為現實。
