引用本文： 宋帥, 田地, 崔永, 高志, 王天佑, 胡健, 常棟. Stomatin 樣蛋白2（SLP-2）抑制裸鼠食管鱗狀細胞癌移植瘤生長的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(10): 885-889. doi: 10.7507/1007-4848.201709036 復制
Stomatin 樣蛋白 2（stomatin-like protein 2，SLP-2）是 stomatin 超家族成員，作為外周膜蛋白穩定存在于紅細胞中，在 2000 年由 Wang 等[1]首次報道。Da Cruz 等[2]認為 SLP-2 也是一種線粒體蛋白，同時存在于質膜及線粒體內膜，與線粒體呼吸鏈功能有關，能夠增加細胞抗凋亡能力。最近研究表明，SLP-2 在多種人類惡性腫瘤組織如食管鱗狀細胞癌（鱗癌）[3]、子宮內膜癌[4]、喉鱗癌[5]、肺鱗癌[6]等高表達，提示其可能是一個新的癌癥相關基因，參與腫瘤的發生、發展和轉歸。
我們前期對 SLP-2 在食管鱗癌中的作用進行了系列研究，發現 SLP-2 在食管鱗癌中差異性高表達[7]。利用 siRNA 抑制 SLP-2 表達能降低食管鱗癌細胞侵襲能力[8]。上述研究表明，SLP-2 表達上調可能參與食管鱗癌細胞的惡性行為。但目前這些研究均停留在體外細胞水平，SLP-2 對活體動物食管鱗癌的作用究竟如何尚不得而知。我們最近建立了一種新的食管鱗癌原位移植動物模型，可以半定量評估活體動物的腫瘤生長能力[9]。本研究采用 RNA 干擾技術，建立特異性抑制目的基因 SLP-2 表達的食管鱗癌細胞株，利用裸鼠食管鱗癌原位移植動物模型和活體成像技術，觀察 SLP-2 表達降低后裸鼠體內原位移植腫瘤的生長變化，在活體動物模型中進一步研究 SLP-2 蛋白在食管鱗癌發生、發展中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 細胞培養
人食管鱗癌細胞系 KYSE30 細胞株由日本 Kyoto University 的 Shamida 博士惠贈。采用 LipofectamineTM 2000（Invitrogen 公司）試劑盒將 pLVX-Luciferase 質粒轉染 KYSE30 細胞，形成穩定表達熒光素酶的 KYSE30-Luc 細胞株[9]，用于活體成像檢查，并用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養液于 37℃、5% CO2 恒溫培養箱中培養。
1.1.2 實驗動物
健康雌性裸鼠 40 只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，8 周大小，體重 19～22 g，在無特定病原體（SPF）級環境飼養。我們的實驗所有操作均符合國家及中國醫學科學院腫瘤醫院關于實驗動物應用及管理的相關規定，并獲得中國醫學科學院腫瘤醫院動物實驗中心的批準。
1.1.3 引物的設計與合成
SLP-2 基因敲降序列由 Invitrogen 公司合成，選取 5 個 shRNA Target 序列；見表 1。對應引物序列見表 2。
表1
shRNATarget 序列
表2
合成的 SLP-2 基因敲降序列
1.2 實驗方法
1.2.1 shRNA 表達載體的構建和鑒定
將合成的 SLP-2 基因敲降序列按照退火、連接、轉化的步驟制作重組質粒，應用 Plus Minipreps DMA Purification System 試劑盒的操作說明提取和純化質粒。將純化后的質粒測序，選擇序列正確的質粒用 HEK293T 細胞進行慢病毒包裝，形成病毒質粒后轉染穩定表達熒光素酶的 KYSE30-Luc 細胞株，應用嘌呤霉素篩選轉染成功的細胞株。Western blotting 實驗檢測轉染細胞的 SLP-2 蛋白表達水平，選擇穩定降低 SLP-2 表達的細胞株用于進一步動物實驗。
1.2.2 裸鼠原位移植瘤模型的建立
將經鑒定低表達 SLP-2 的細胞進行培養，取對數生長期細胞，用胰酶消化后計數，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS 液）稀釋成 1×107/L 濃度，用 1 ml 注射器在裸鼠右側下腹部皮下建立皮下移植瘤模型，每只裸鼠注射 100 μl。待皮下移植的腫瘤生長到 0.5～0.8 cm 大小后，將皮下移植瘤裸鼠用 3% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，切除皮下腫瘤。用我們前期研究的方法建立裸鼠原位移植瘤模型[9]，隔日觀察裸鼠的體重和生存情況。當某一只裸鼠開始出現體重減輕，一般情況差后，處死所有裸鼠。
1.2.3 活體成像檢查
在處死原位移植瘤裸鼠前用活體成像儀（IVIS Lumina，Caliper Life Science，Hopkinton，MA，USA）檢測腫瘤的熒光素酶值（ROI），其高低能反映腫瘤生長情況，從而比較 SLP-2 表達降低對原位移植腫瘤生長的影響。
1.2.4 病理學檢查
處死動物后，將原發腫瘤切除送病理學檢查。標本組織經 4% 多聚甲醛固定，常規脫水透明、浸蠟、石蠟包埋，切成厚度為 4 μm 的切片，烤片器 60℃ 烘烤 4 h，用于標準 HE 染色。病理標本由兩位資深病理醫師單獨在顯微鏡下進行觀察，判斷腫瘤的浸潤情況。
1.3 統計學分析
所有計量資料以均數±標準差（
）表示，是否符合正態分布采用 Kolmogorov-Smirnov 檢驗，符合正態分布者比較用 t 檢驗，非正態分布者比較用非參數檢驗。所有數據均采用 SPSS13.0 統計軟件進行統計處理。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Western blotting 檢測敲漿 SLP-2 表達的結果
雙酶切鑒定電泳位置正確的質粒測序結果提示 SLP-2-1、SLP-2-2、SLP-2-3 和 SLP-2-5 四條構建質粒序列正常。將上述四種質粒用慢病毒包裝成病毒顆粒后感染 KYSE30-Luc 細胞。將經過嘌呤霉素選擇得到的克隆擴增培養后，提取總蛋白行 Western blotting 檢測。結果顯示，與未做處理的親本 KYSE30-Luc 細胞比較，SLP-2-1 質粒和 SLP-2-2 質粒感染的細胞 SLP-2 表達水平明顯降低，而空載質粒（SHGFP）感染的細胞 SLP-2 表達水平無明顯變化（圖 1），表明低表達 SLP-2 的 KYSE30-Luc 細胞系構建成功。分別選取 SLP-2-1 質粒、SLP-2-2 質粒和 SHGFP 感染的細胞建立裸鼠原位移植瘤模型。
圖1
Western blotting 檢測 SLP-2 蛋白表達
2.2 活體成像檢測原位移植腫瘤的結果
將裸鼠原位移植瘤模型分為 3 組，組 1 為 SLP-2-1 質粒感染的細胞，組 2 為 SLP-2-2 質粒感染的細胞，組 3 為 SHGFP 感染的細胞。每組 12 只裸鼠，6 只用于建立皮下移植瘤，另 6 只用于建立原位移植瘤模型。實驗動物中 1 只裸鼠在術后第 6 周出現體重減輕、活動能力差，因此實驗的時間終點為第 6 周。處死動物前行活體成像檢測原位移植腫瘤 ROI（表 3）。結果顯示，組 1 與組 2 的 ROI 差異無統計學意義（P=0.943），表明兩組腫瘤的生長無明顯差異。但組 1 和組 2 的 ROI 均明顯低于組 3（P=0.002、0.000），提示 SLP-2 表達水平降低后，原位移植腫瘤的生長明顯下降。
表3
活體成像檢測結果（
）
2.3 病理學檢查
處死動物后將原位移植腫瘤送病理學檢查。結果顯示，組 1（圖 2a）、組 2（圖 2b）和組 3（圖 2c）移植腫瘤均有侵襲浸潤至食管肌層的表現。
圖2
病理切片顯示移植腫瘤均有侵襲浸潤至食管肌層的表現（×400）
a：組 1；b：組 2；c：組 3
3 討論
惡性腫瘤的發生、發展是多階段的漸進過程，眾多基因參與其中。SLP-2 基因屬于 stomatin 基因超家族中的一員，研究發現 SLP-2 在子宮內膜癌[4]、喉鱗癌[5]、肺鱗癌[6]、上皮性卵巢癌[10]、宮頸癌[11]、甲狀腺乳頭狀癌[12]、胃腺癌[13]等人類多種惡性腫瘤中表達升高，參與腫瘤的分期，SLP-2 高表達者腫瘤無進展生存期及總生存期均明顯縮短。正常食管黏膜中 SLP-2 呈陰性表達，在腫瘤從輕度不典型增生發展到鱗癌的過程中，其表達水平逐漸升高[14]，提示 SLP-2 過表達是食管鱗癌發生、發展過程中的早期事件。SLP-2 表達水平還與食管鱗癌的浸潤深度相關[15]，降低 SLP-2 表達后食管鱗癌細胞出現了生長速度受抑制、克隆形成率降低和粘附能力下降的表現[3, 14]。此外，降低 SLP-2 表達還可以增加腫瘤細胞對化療藥物的反應[16]。
本實驗在前期研究的基礎上，選用 SLP-2 高表達的食管鱗癌細胞株 KYSE30，轉染 pLVX-Luciferase 質粒使其穩定表達熒光素酶，并采用 RNA 干擾技術對 SLP-2 mRNA 進行降解降低其表達水平，觀察 SLP-2 表達降低對裸鼠原位移植瘤生長的影響，在體內環境中進一步驗證 SLP-2 蛋白在食管鱗癌發生發展中的作用。與常用的皮下移植瘤模型比較，原位移植瘤模型的腫瘤與人食管鱗癌的生長環境更為接近，且不容易形成壞死后液化，結果更有說服力。既往觀察腫瘤生長多通過比較不同處理組間腫瘤的大小作為量化方法，但隨著腫瘤的快速生長，腫瘤容易因血供不足導致壞死。本研究采用活體成像技術，通過檢測腫瘤細胞的 ROI 值反映細胞的數量、腫瘤的大小和腫瘤轉移位置，在測量腫瘤大小方面更為精確。我們的結果顯示，SLP-2 表達降低的兩種 KYSE30 細胞株形成的原位腫瘤 ROI 值明顯下降，表明 SLP-2 蛋白表達下降后腫瘤細胞生長明顯減慢，提示降低 SLP-2 表達可以抑制食管鱗癌的生長，證實 SLP-2 參與食管鱗癌的發生、發展過程。
我們對 SLP-2 低表達組和對照組的原位生長腫瘤均作了病理學檢查，盡管既往研究顯示 SLP-2 的高表達與食管鱗癌的浸潤深度相關，且體外研究顯示降低 SLP-2 表達后食管鱗癌細胞的侵襲能力下降[15]，但在我們的研究中，SLP-2 正常表達組及表達下降組均發生了腫瘤的浸潤性生長，其浸潤深度亦無明顯差別，提示除了 SLP-2 基因外，可能還有其他基因（包括 SLP-2 下游信號通路基因）參與調控癌細胞的生長，惡性腫瘤的侵襲除了細胞增殖（生長）外，尚有更為復雜的調控因素。此外我們的研究在其中 1 只原位移植瘤裸鼠出現體重減輕、活動能力差時作為實驗的時間終點，與上述研究中的觀察對象為臨床食管癌患者仍有一定的區別。總之，SLP-2 的表達水平與食管鱗癌的生長密切相關，除 SLP-2 外還有哪些分子機制參與食管鱗癌侵襲轉移還有待進一步研究。
Stomatin 樣蛋白 2（stomatin-like protein 2，SLP-2）是 stomatin 超家族成員，作為外周膜蛋白穩定存在于紅細胞中，在 2000 年由 Wang 等[1]首次報道。Da Cruz 等[2]認為 SLP-2 也是一種線粒體蛋白，同時存在于質膜及線粒體內膜，與線粒體呼吸鏈功能有關，能夠增加細胞抗凋亡能力。最近研究表明，SLP-2 在多種人類惡性腫瘤組織如食管鱗狀細胞癌（鱗癌）[3]、子宮內膜癌[4]、喉鱗癌[5]、肺鱗癌[6]等高表達，提示其可能是一個新的癌癥相關基因，參與腫瘤的發生、發展和轉歸。
我們前期對 SLP-2 在食管鱗癌中的作用進行了系列研究，發現 SLP-2 在食管鱗癌中差異性高表達[7]。利用 siRNA 抑制 SLP-2 表達能降低食管鱗癌細胞侵襲能力[8]。上述研究表明，SLP-2 表達上調可能參與食管鱗癌細胞的惡性行為。但目前這些研究均停留在體外細胞水平，SLP-2 對活體動物食管鱗癌的作用究竟如何尚不得而知。我們最近建立了一種新的食管鱗癌原位移植動物模型，可以半定量評估活體動物的腫瘤生長能力[9]。本研究采用 RNA 干擾技術，建立特異性抑制目的基因 SLP-2 表達的食管鱗癌細胞株，利用裸鼠食管鱗癌原位移植動物模型和活體成像技術，觀察 SLP-2 表達降低后裸鼠體內原位移植腫瘤的生長變化，在活體動物模型中進一步研究 SLP-2 蛋白在食管鱗癌發生、發展中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 細胞培養
人食管鱗癌細胞系 KYSE30 細胞株由日本 Kyoto University 的 Shamida 博士惠贈。采用 LipofectamineTM 2000（Invitrogen 公司）試劑盒將 pLVX-Luciferase 質粒轉染 KYSE30 細胞，形成穩定表達熒光素酶的 KYSE30-Luc 細胞株[9]，用于活體成像檢查，并用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養液于 37℃、5% CO2 恒溫培養箱中培養。
1.1.2 實驗動物
健康雌性裸鼠 40 只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，8 周大小，體重 19～22 g，在無特定病原體（SPF）級環境飼養。我們的實驗所有操作均符合國家及中國醫學科學院腫瘤醫院關于實驗動物應用及管理的相關規定，并獲得中國醫學科學院腫瘤醫院動物實驗中心的批準。
1.1.3 引物的設計與合成
SLP-2 基因敲降序列由 Invitrogen 公司合成，選取 5 個 shRNA Target 序列；見表 1。對應引物序列見表 2。
表1
shRNATarget 序列
表2
合成的 SLP-2 基因敲降序列
1.2 實驗方法
1.2.1 shRNA 表達載體的構建和鑒定
將合成的 SLP-2 基因敲降序列按照退火、連接、轉化的步驟制作重組質粒，應用 Plus Minipreps DMA Purification System 試劑盒的操作說明提取和純化質粒。將純化后的質粒測序，選擇序列正確的質粒用 HEK293T 細胞進行慢病毒包裝，形成病毒質粒后轉染穩定表達熒光素酶的 KYSE30-Luc 細胞株，應用嘌呤霉素篩選轉染成功的細胞株。Western blotting 實驗檢測轉染細胞的 SLP-2 蛋白表達水平，選擇穩定降低 SLP-2 表達的細胞株用于進一步動物實驗。
1.2.2 裸鼠原位移植瘤模型的建立
將經鑒定低表達 SLP-2 的細胞進行培養，取對數生長期細胞，用胰酶消化后計數，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS 液）稀釋成 1×107/L 濃度，用 1 ml 注射器在裸鼠右側下腹部皮下建立皮下移植瘤模型，每只裸鼠注射 100 μl。待皮下移植的腫瘤生長到 0.5～0.8 cm 大小后，將皮下移植瘤裸鼠用 3% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，切除皮下腫瘤。用我們前期研究的方法建立裸鼠原位移植瘤模型[9]，隔日觀察裸鼠的體重和生存情況。當某一只裸鼠開始出現體重減輕，一般情況差后，處死所有裸鼠。
1.2.3 活體成像檢查
在處死原位移植瘤裸鼠前用活體成像儀（IVIS Lumina，Caliper Life Science，Hopkinton，MA，USA）檢測腫瘤的熒光素酶值（ROI），其高低能反映腫瘤生長情況，從而比較 SLP-2 表達降低對原位移植腫瘤生長的影響。
1.2.4 病理學檢查
處死動物后，將原發腫瘤切除送病理學檢查。標本組織經 4% 多聚甲醛固定，常規脫水透明、浸蠟、石蠟包埋，切成厚度為 4 μm 的切片，烤片器 60℃ 烘烤 4 h，用于標準 HE 染色。病理標本由兩位資深病理醫師單獨在顯微鏡下進行觀察，判斷腫瘤的浸潤情況。
1.3 統計學分析
所有計量資料以均數±標準差（
）表示，是否符合正態分布采用 Kolmogorov-Smirnov 檢驗，符合正態分布者比較用 t 檢驗，非正態分布者比較用非參數檢驗。所有數據均采用 SPSS13.0 統計軟件進行統計處理。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Western blotting 檢測敲漿 SLP-2 表達的結果
雙酶切鑒定電泳位置正確的質粒測序結果提示 SLP-2-1、SLP-2-2、SLP-2-3 和 SLP-2-5 四條構建質粒序列正常。將上述四種質粒用慢病毒包裝成病毒顆粒后感染 KYSE30-Luc 細胞。將經過嘌呤霉素選擇得到的克隆擴增培養后，提取總蛋白行 Western blotting 檢測。結果顯示，與未做處理的親本 KYSE30-Luc 細胞比較，SLP-2-1 質粒和 SLP-2-2 質粒感染的細胞 SLP-2 表達水平明顯降低，而空載質粒（SHGFP）感染的細胞 SLP-2 表達水平無明顯變化（圖 1），表明低表達 SLP-2 的 KYSE30-Luc 細胞系構建成功。分別選取 SLP-2-1 質粒、SLP-2-2 質粒和 SHGFP 感染的細胞建立裸鼠原位移植瘤模型。
圖1
Western blotting 檢測 SLP-2 蛋白表達
2.2 活體成像檢測原位移植腫瘤的結果
將裸鼠原位移植瘤模型分為 3 組，組 1 為 SLP-2-1 質粒感染的細胞，組 2 為 SLP-2-2 質粒感染的細胞，組 3 為 SHGFP 感染的細胞。每組 12 只裸鼠，6 只用于建立皮下移植瘤，另 6 只用于建立原位移植瘤模型。實驗動物中 1 只裸鼠在術后第 6 周出現體重減輕、活動能力差，因此實驗的時間終點為第 6 周。處死動物前行活體成像檢測原位移植腫瘤 ROI（表 3）。結果顯示，組 1 與組 2 的 ROI 差異無統計學意義（P=0.943），表明兩組腫瘤的生長無明顯差異。但組 1 和組 2 的 ROI 均明顯低于組 3（P=0.002、0.000），提示 SLP-2 表達水平降低后，原位移植腫瘤的生長明顯下降。
表3
活體成像檢測結果（
）
2.3 病理學檢查
處死動物后將原位移植腫瘤送病理學檢查。結果顯示，組 1（圖 2a）、組 2（圖 2b）和組 3（圖 2c）移植腫瘤均有侵襲浸潤至食管肌層的表現。
圖2
病理切片顯示移植腫瘤均有侵襲浸潤至食管肌層的表現（×400）
a：組 1；b：組 2；c：組 3
3 討論
惡性腫瘤的發生、發展是多階段的漸進過程，眾多基因參與其中。SLP-2 基因屬于 stomatin 基因超家族中的一員，研究發現 SLP-2 在子宮內膜癌[4]、喉鱗癌[5]、肺鱗癌[6]、上皮性卵巢癌[10]、宮頸癌[11]、甲狀腺乳頭狀癌[12]、胃腺癌[13]等人類多種惡性腫瘤中表達升高，參與腫瘤的分期，SLP-2 高表達者腫瘤無進展生存期及總生存期均明顯縮短。正常食管黏膜中 SLP-2 呈陰性表達，在腫瘤從輕度不典型增生發展到鱗癌的過程中，其表達水平逐漸升高[14]，提示 SLP-2 過表達是食管鱗癌發生、發展過程中的早期事件。SLP-2 表達水平還與食管鱗癌的浸潤深度相關[15]，降低 SLP-2 表達后食管鱗癌細胞出現了生長速度受抑制、克隆形成率降低和粘附能力下降的表現[3, 14]。此外，降低 SLP-2 表達還可以增加腫瘤細胞對化療藥物的反應[16]。
本實驗在前期研究的基礎上，選用 SLP-2 高表達的食管鱗癌細胞株 KYSE30，轉染 pLVX-Luciferase 質粒使其穩定表達熒光素酶，并采用 RNA 干擾技術對 SLP-2 mRNA 進行降解降低其表達水平，觀察 SLP-2 表達降低對裸鼠原位移植瘤生長的影響，在體內環境中進一步驗證 SLP-2 蛋白在食管鱗癌發生發展中的作用。與常用的皮下移植瘤模型比較，原位移植瘤模型的腫瘤與人食管鱗癌的生長環境更為接近，且不容易形成壞死后液化，結果更有說服力。既往觀察腫瘤生長多通過比較不同處理組間腫瘤的大小作為量化方法，但隨著腫瘤的快速生長，腫瘤容易因血供不足導致壞死。本研究采用活體成像技術，通過檢測腫瘤細胞的 ROI 值反映細胞的數量、腫瘤的大小和腫瘤轉移位置，在測量腫瘤大小方面更為精確。我們的結果顯示，SLP-2 表達降低的兩種 KYSE30 細胞株形成的原位腫瘤 ROI 值明顯下降，表明 SLP-2 蛋白表達下降后腫瘤細胞生長明顯減慢，提示降低 SLP-2 表達可以抑制食管鱗癌的生長，證實 SLP-2 參與食管鱗癌的發生、發展過程。
我們對 SLP-2 低表達組和對照組的原位生長腫瘤均作了病理學檢查，盡管既往研究顯示 SLP-2 的高表達與食管鱗癌的浸潤深度相關，且體外研究顯示降低 SLP-2 表達后食管鱗癌細胞的侵襲能力下降[15]，但在我們的研究中，SLP-2 正常表達組及表達下降組均發生了腫瘤的浸潤性生長，其浸潤深度亦無明顯差別，提示除了 SLP-2 基因外，可能還有其他基因（包括 SLP-2 下游信號通路基因）參與調控癌細胞的生長，惡性腫瘤的侵襲除了細胞增殖（生長）外，尚有更為復雜的調控因素。此外我們的研究在其中 1 只原位移植瘤裸鼠出現體重減輕、活動能力差時作為實驗的時間終點，與上述研究中的觀察對象為臨床食管癌患者仍有一定的區別。總之，SLP-2 的表達水平與食管鱗癌的生長密切相關，除 SLP-2 外還有哪些分子機制參與食管鱗癌侵襲轉移還有待進一步研究。
