引用本文： 徐源, 梁乃新, 劉洪生, 李力, 黃誠, 秦應之, 邴鐘興, 彭佳茜, 李文哲, 楊延蓮, 胡志遠, 李單青. 納米磁珠技術檢測肺癌循環腫瘤細胞效果的中試研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(8): 691-695. doi: 10.7507/1007-4848.201708052 復制
循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指進入人體外周血的腫瘤細胞。CTCs 最早于 1869 年在 1 例轉移癌患者外周血中發現[1]，近年來，其作為“液體活檢”對腫瘤的早期發現、疾病進展、復發轉移及預后進行監測的作用日益受到重視。大量研究表明，CTCs 在乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌等腫瘤的發生、進展和轉移中起重要作用。在非小細胞肺癌中的研究也表明[2]，更高的 CTCs 計數與肺癌更差的預后有關。
2014 年，我們團隊報道了一種新的 CTCs 分離方法[3]。該法利用可特異性識別并結合上皮細胞黏附分子（EpCAM）的納米微珠，在乳腺癌、前列腺癌和肝癌細胞系及患者中的回收率達 90%、純度達 93%。本研究中，我們將這一技術應用于肺癌細胞系和患者中，探索該技術能否用于肺癌的診治。
1 資料與方法
1.1 細胞系和儀器
癌細胞系：人肺癌細胞系 A549、人肺腺癌細胞系 NCI-H1975（中國醫學科學院國家實驗細胞資源共享服務平臺）。
主要試劑：RPMI-1640 培養液（美國 HyClone 公司）、Hoechst.33342 熒光染料（美國 Sigma-Aldrich 公司）、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗 EpCAM 抗體和 FITC 標記的鼠 IgG2b k（美國 BioLegend 公司）、重組人 EpCAM/trop-1 Fc 嵌合體（美國 Minneapolis 公司）、FITC 標記的抗人 CD45 抗體（中國義翹神州公司）、別藻藍素標記的抗人 CK 抗體（中國亞諾法公司）、MNPs（200 nm，法國 Ademtech 公司）。
主要儀器：FACS Calibur 流式細胞儀（美國 BD 公司）、NanoZS Zetasizer 電位儀（英國 Worcestershire 公司）、Infinite-M200 酶標儀（瑞士 Mannedorf 公司）、PlexArray HT 高通量化合物篩選系統（美國 Plexera 公司）、IX71 顯微鏡（日本 Olympus 公司）。
1.2 細胞培養及流式細胞計數
細胞培養：將人肺癌細胞系 A549 置含 10% 小牛血清、1% 青霉素的 RPMI-1640 培養液中培養，5%CO2 37℃ 孵箱中培養，每 3 d 傳代一次至融合度 80%～90%。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 2 次后，用 1 ml 0.25 w/v% 胰蛋白酶和 2.5 g/L EDTA 的混合溶液在 37 ℃ 下處理 5 min。采集細胞，加入 5 ml RPMI-1640 培養液中和胰蛋白酶，1 000 rpm 室溫離心 5 min，棄去上清，重懸細胞后計數。同法處理人肺腺癌細胞系 NCI-H1975。
流式細胞計數：將約 105個腫瘤細胞與 15 μl FITC 標記的識別肽 Pep（陰性對照組為 FITC 標記的鼠 IgG2b k，陽性對照組為 FITC 標記的抗 EpCAM 抗體）混合，4℃ 下孵育 30 min。洗去未結合成分，用流式細胞儀分析計數，計算腫瘤細胞與識別肽 Pep 的結合率（FITC 標記的腫瘤細胞數/加入的腫瘤細胞總數）。同法處理人肺腺癌細胞系 NCI-H1975。
1.3 研究對象
招募 2016 年 8 月 1～20 日于中國醫學科學院北京協和醫院就診的 34 例疑診肺癌患者，其中男 17例（50.0%）、女 17 例（50.0%），年齡 45～74（59.1±7.5）歲。另納入 10 名健康受試者，男女各 5 名，平均年齡（60.1±5.8）歲。疑診肺癌患者與健康受試者的性別、年齡差異無統計學意義。收集臨床資料后，所有受試者均于清晨空腹采集 2 ml 靜脈血用于檢測 CTC，此后肺癌患者行手術治療（臨床分期 Ⅰ～Ⅲ 期）或活檢（臨床分期Ⅳ）明確病理診斷。該試驗涉及的標本收集均通過中國醫學科學院北京協和醫院倫理委員會審核同意，并簽署知情同意書。
納入標準：經 CT 和 PET/CT 檢查后疑診肺癌患者；術前未行手術治療、放療、化療或靶向治療；于北京協和醫院胸外科行手術治療，并獲取病理資料；臨床資料完整。
排除標準：影像學或臨床表現考慮良性、暫不需手術干預的患者。
1.4 CTC 的分離和鑒定
Pep10@MNPs 的制備：將 10 mg Fe/ml MNPs 與 1 mg/ml 生物素結合的 Pep10 以 1∶2 在 pH 7.2 的 PBS 中室溫孵育 30～40 min，得到結合物 Pep10@MNPs。116 mT 磁場中 PBS 洗滌 5 次，滴定至 10 mg Fe/ml。同法用生物素結合的抗 EpCAM 抗體制備抗 EpCAM@MNPs 制備對照試劑。
細胞系中腫瘤細胞的分離和鑒定：將人肺癌細胞系 A549 用 Hoechst.33342 染色，PBS 洗滌 3 次。取約 50 個染色細胞混合至 1 ml EDTA 抗凝的健康人全血中。加入 10 μl Pep10@MNPs，37℃ 下孵育 30 min，116 mT 磁場中用 PBS 洗滌 5 次。在熒光顯微鏡下計數，計算腫瘤細胞回收率（鑒定的腫瘤細胞數/加入的已染色腫瘤細胞總數）。同法處理人肺腺癌細胞系 NCI-H1975。
受試者 CTC 的分離和鑒定：受試者于術前清晨空腹采血，棄掉前 2 ml 血液后，使用 EDTA 抗凝的采血管從肘靜脈采集 2 ml 血液，采集的血液標本在室溫避光保存不超過 24 h。血液標本中加入 10 μl Pep10@MNPs，37℃ 下孵育 30 min，116 mT 磁場中用 PBS 洗滌 5 次。采用三色免疫熒光染色法鑒定，將分離的 CTC 用 4% 多聚甲醛室溫固定 4 h。加入 DAPI（標記細胞核）、FITC 標記的抗 CK19 抗體、藻紅蛋白標記的抗 CD45 抗體。在熒光顯微鏡下觀察，DAPI+/CK+/CD45-鑒定為 CTC。
1.5 統計學分析
用 SPSS21.0 軟件統計分析。用多因素方差分析比較不同臨床特征肺癌患者 CTC 檢出率的組間差異。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 細胞系中腫瘤細胞的結合率與回收率
細胞系中腫瘤細胞與識別肽 Pep 的結合率可由 FITC 標記的腫瘤細胞數/加入的腫瘤細胞總數表示。Pep 與 A549 細胞、H1975 細胞的結合率分別為 80.0%±6.0%、70.1%±4.8%，這與陽性對照組（抗 EpCAM 抗體）中的結合率（A549 細胞為 90.6%±4.9%、H1975 細胞為 67.2%±3.0%）相近。陰性對照組（鼠 IgG2b k）中的結合率分別為 0.9%±0.3% 和 1.1%±0.9%；見圖 1。
圖1
Pep10、IgG、抗 EpCAM 抗體與 A549 細胞、H1975 細胞的結合率
本研究采用 CK19 標記腫瘤細胞，CD45 標記白細胞，DAPI 是一種可與 DNA 強力結合的熒光染料，本研究中用以標記細胞核。腫瘤細胞在三色免疫熒光下表現為 DAPI 陽性、CK19 陽性、CD45 陰性。納米磁珠法捕獲腫瘤細胞的回收率可由鑒定出的腫瘤細胞數/加入的腫瘤細胞總數表示，分別為 57.3%±7.0%（A549 細胞）和 37.3%±6.1% （H1975 細胞）；見圖 2。
圖2
捕獲的 A549、H1975 細胞免疫熒光染色結果
2.2 受試者
所有 34 例疑診肺癌患者均行手術治療并獲得病理資料，其中 32 例患者經病理證實為肺癌，根據國際肺癌協會（IASLC）第八版分期，肺癌患者Ⅰ～Ⅳ期分別為 23 例、4 例、4 例和 1 例；2 例患者病理證實為肺良性疾病（包括 1 例肺感染性疾病、1 例肺隔離癥）。此外本研究納入 10 名健康受試者。所有 44 例受試者均行 CTC 計數檢測。
2.3 CTC 在不同受試者中的檢出率
不同受試者 CTC 的檢出率見表 1，肺癌患者 CTC 檢出率高達 71.9%，高于肺良性疾病患者（0.0%）和健康受試者（20.0%）。可得納米磁珠法檢測肺癌 CTC 的敏感性為 71.9%，特異性 83.3%，準確性 75.0%，陽性預測值 92.0%，陰性預測值 52.6%。對其進行受試者工作特征（ROC）曲線分析，曲線下面積為 0.792（P=0.003），提示 CTC 可作為肺癌的診斷指標。
表1
不同受試者中 CTC 的檢出率
2.4 CTC 計數與臨床特征的相關性
不同臨床特征肺癌患者的 CTC 陽性率見表 2，顯著性由多因素方差分析計算所得。不同病理分期方面，可見 CTC 檢出率由 Ⅰ 期至 Ⅳ 期有增加趨勢，但差異沒有統計學意義。鱗癌患者的 CTC 檢出率（85.7%）高于腺癌患者（68.0%），但差異沒有統計學意義。CTC 檢出率與患者性別、病灶數目亦無顯著關系。
表2
不同臨床特征肺癌患者 CTC 的檢出率
3 討論
近年來隨著細胞分離技術和測序技術的發展，液體活檢在腫瘤的診治中日益重要。越來越多的文獻表明，檢測 CTC 有助于早期發現肺癌微轉移、重新確定臨床分期、實時監測抗腫瘤治療療效、評估預后、制定個體化的治療策略、闡明腫瘤的生物學進程及轉移機制。本中試研究表明納米磁珠法可良好檢測肺癌 CTC，且測得的 CTC 有望成為肺癌的篩查和良惡性鑒別指標。
CTC 在外周血的含量通常<1 個/108個細胞，需要通過富集提高檢測靈敏度。目前 CTC 的富集鑒定方法主要有三種：（1）基于 RT-PCR 的方法直接檢測上皮標志物如 CK18、CK19、E-cadherin 等的表達；（2）基于細胞大小差異分離 CTC；（3）利用免疫吸附原理分離 CTC。其中免疫吸附法應用最為廣泛，主要分為正向分選和負向分選兩種，正向分選利用上皮分子 EpCAM 作為標志，通過抗原抗體特異性結合捕獲 CTC，代表性技術有 CellSearch、CTC chip、CTC-iCHIP、HB-chip、AdnaTest、Isoflux、MagSweeper 等，其中 CellSearch 目前已被 FDA 批準應用于乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌中，但其對肺癌 CTC 的回收率僅約 20%～40%[4-5]。負向分選利用 CD45 抗體特異性吸附血源性細胞后，對剩余的細胞進一步利用上皮標志物及血源性細胞標志物聯合鑒定 CTC，代表性技術上皮腫瘤細胞大小分離法（ISET）在非小細胞肺癌中的回收率可達 50%[6]。
本研究中的納米磁珠法采用了正向分選，通過特異性識別并結合 EpCAM 實現 CTC 的分離和富集，在先前研究中，我們證明納米磁珠法可與腫瘤細胞良好結合（與 MCF-7、SK-BR-3、PC3、Hep G2 細胞的結合率分別為 88.5%、90.7%、95.8% 和 89.6%）。本研究中，其對 A549 細胞和 H1975 細胞的結合率亦高達 80.0%（A549 細胞）和 70.1%（H1975 細胞），接近陽性對照組（抗 EpCAM 抗體）的 90.6% 和 67.2%，且陰性對照組（鼠 IgG2b k）中的結合率分別為 0.9%±0.3% 和 1.1%±0.9%，表明納米磁珠法可特異性識別并結合肺癌細胞。三色免疫熒光染色法表明 A549 細胞和 H1975 細胞的回收率分別為 57.3%±7.0% 和 37.3%±6.1%，證明納米磁珠法可作為可靠的肺癌 CTC 富集方法。但值得注意的是，此方法將漏過上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的細胞或未分化出上皮表型的腫瘤干細胞。上皮間質轉化指細胞失去上皮表型，轉化為具有較高侵襲轉移和降解細胞外基質能力的間質表型，從而大大提升了腫瘤細胞侵襲轉移的能力。發生上皮間質轉化的細胞，其表面 EpCAM 的表達下降。Lecharpentier 等[7]證實非小細胞肺癌患者體內存在上皮與間質表型嵌合的 CTC。國外報道中基于 EpCAM 識別的肺癌 CTC 檢測的敏感性通常不超過 50%。De Wit 等[8]用 CellSearch 反復檢測 28 例肺癌患者的全血標本，發現 EpCAM 陽性率約為 75%。Pak 等[9]報道 EpCAM 的過表達存在于 39% 的肺腺癌和 85.9% 的肺鱗癌患者中。目前尚未發現其他公認的可用于區分 CTC 和普通上皮細胞的表面標志物[10]。近年來葉酸受體作為肺癌 CTC 的檢測靶點受到了關注，國內文獻報道基于葉酸受體靶向 PCR CTC 檢測方法的診斷肺癌的敏感性高達 80%，特異性為 88%，其中對 Ⅰ 期非小細胞肺癌患者的診斷敏感性達 67.2%[11]。
本研究采用三色免疫熒光染色法鑒定 CTC，分別為 DAPI（標記細胞核）、FITC 標記的抗 CK19 抗體和藻紅蛋白標記的抗 CD45 抗體。這與 CellSearch 技術采用的 CK8、CK18、CK19、CD45 相似，均依賴于細胞表達的上皮表型。
本研究中 CTC 在肺癌患者中的總體檢出率為 71.9%，特異性高達 83.3%，ROC 曲線下面積為 0.792（P=0.003）。值得注意的是，在 Ⅰ 期肺癌患者中，CTC 陽性率仍高達 65.2%，表明納米磁珠法檢測 CTC 有望成為肺癌篩查指標。在類似研究中，Tanaka 等[4]采用 CellSearch 技術對 150 例疑診肺癌患者檢測 CTC，結果表明 38 例（30.6%）肺癌患者及 3 例（12.0%）非肺癌患者可檢出 CTC，ROC 曲線下面積為 0.598（P=0.122）。Fiorelli 等[12]采用 ISET 技術檢測了 60 例肺癌及 17 例肺良性結節患者的 CTC，表明 CTC 計數>25 可作為鑒別肺結節良惡性的可靠指標。
本研究中 CTC 計數隨著肺癌的病理分期的進展而增加，但這一現象差異無統計學意義（P=0.096）。國外報道中，CTC 計數與病理分期的關系與采用的檢測技術有關，采用 CellSearch 技術的研究多認為 CTC 計數與病理分期有關[13]。而 Hofman 等[6]用 ISET 技術檢測了 208 例非小細胞肺癌，發現 CTC 陽性率 50%，且 CTC 計數與病理分期無關。此外，本中試研究未觀察到 CTC 計數與腫瘤病理學類型的關系，這與國外報道一致。一項納入了 20 項研究、1 576 例非小細胞肺癌患者的 Meta 分析表明，肺鱗癌與肺腺癌患者 CTC 計數無顯著差異[14]。
總之，本研究證實我們建立的納米磁珠富集和鑒定肺癌患者 CTC 的方法具有較好的靈敏度和特異性，有望用于肺癌的篩查，為肺癌的早診早治提供有效的臨床指導。檢索 ClinicalTrials.gov，目前在試的有關 CTC 和肺癌的研究已有近 400 項。隨著更多關于納米磁珠法檢測肺癌患者的疾病監測、評估治療反應、評估預后研究的開展，CTC 在肺癌診治中的應用將有更加廣闊的前景。
循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指進入人體外周血的腫瘤細胞。CTCs 最早于 1869 年在 1 例轉移癌患者外周血中發現[1]，近年來，其作為“液體活檢”對腫瘤的早期發現、疾病進展、復發轉移及預后進行監測的作用日益受到重視。大量研究表明，CTCs 在乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌等腫瘤的發生、進展和轉移中起重要作用。在非小細胞肺癌中的研究也表明[2]，更高的 CTCs 計數與肺癌更差的預后有關。
2014 年，我們團隊報道了一種新的 CTCs 分離方法[3]。該法利用可特異性識別并結合上皮細胞黏附分子（EpCAM）的納米微珠，在乳腺癌、前列腺癌和肝癌細胞系及患者中的回收率達 90%、純度達 93%。本研究中，我們將這一技術應用于肺癌細胞系和患者中，探索該技術能否用于肺癌的診治。
1 資料與方法
1.1 細胞系和儀器
癌細胞系：人肺癌細胞系 A549、人肺腺癌細胞系 NCI-H1975（中國醫學科學院國家實驗細胞資源共享服務平臺）。
主要試劑：RPMI-1640 培養液（美國 HyClone 公司）、Hoechst.33342 熒光染料（美國 Sigma-Aldrich 公司）、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗 EpCAM 抗體和 FITC 標記的鼠 IgG2b k（美國 BioLegend 公司）、重組人 EpCAM/trop-1 Fc 嵌合體（美國 Minneapolis 公司）、FITC 標記的抗人 CD45 抗體（中國義翹神州公司）、別藻藍素標記的抗人 CK 抗體（中國亞諾法公司）、MNPs（200 nm，法國 Ademtech 公司）。
主要儀器：FACS Calibur 流式細胞儀（美國 BD 公司）、NanoZS Zetasizer 電位儀（英國 Worcestershire 公司）、Infinite-M200 酶標儀（瑞士 Mannedorf 公司）、PlexArray HT 高通量化合物篩選系統（美國 Plexera 公司）、IX71 顯微鏡（日本 Olympus 公司）。
1.2 細胞培養及流式細胞計數
細胞培養：將人肺癌細胞系 A549 置含 10% 小牛血清、1% 青霉素的 RPMI-1640 培養液中培養，5%CO2 37℃ 孵箱中培養，每 3 d 傳代一次至融合度 80%～90%。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 2 次后，用 1 ml 0.25 w/v% 胰蛋白酶和 2.5 g/L EDTA 的混合溶液在 37 ℃ 下處理 5 min。采集細胞，加入 5 ml RPMI-1640 培養液中和胰蛋白酶，1 000 rpm 室溫離心 5 min，棄去上清，重懸細胞后計數。同法處理人肺腺癌細胞系 NCI-H1975。
流式細胞計數：將約 105個腫瘤細胞與 15 μl FITC 標記的識別肽 Pep（陰性對照組為 FITC 標記的鼠 IgG2b k，陽性對照組為 FITC 標記的抗 EpCAM 抗體）混合，4℃ 下孵育 30 min。洗去未結合成分，用流式細胞儀分析計數，計算腫瘤細胞與識別肽 Pep 的結合率（FITC 標記的腫瘤細胞數/加入的腫瘤細胞總數）。同法處理人肺腺癌細胞系 NCI-H1975。
1.3 研究對象
招募 2016 年 8 月 1～20 日于中國醫學科學院北京協和醫院就診的 34 例疑診肺癌患者，其中男 17例（50.0%）、女 17 例（50.0%），年齡 45～74（59.1±7.5）歲。另納入 10 名健康受試者，男女各 5 名，平均年齡（60.1±5.8）歲。疑診肺癌患者與健康受試者的性別、年齡差異無統計學意義。收集臨床資料后，所有受試者均于清晨空腹采集 2 ml 靜脈血用于檢測 CTC，此后肺癌患者行手術治療（臨床分期 Ⅰ～Ⅲ 期）或活檢（臨床分期Ⅳ）明確病理診斷。該試驗涉及的標本收集均通過中國醫學科學院北京協和醫院倫理委員會審核同意，并簽署知情同意書。
納入標準：經 CT 和 PET/CT 檢查后疑診肺癌患者；術前未行手術治療、放療、化療或靶向治療；于北京協和醫院胸外科行手術治療，并獲取病理資料；臨床資料完整。
排除標準：影像學或臨床表現考慮良性、暫不需手術干預的患者。
1.4 CTC 的分離和鑒定
Pep10@MNPs 的制備：將 10 mg Fe/ml MNPs 與 1 mg/ml 生物素結合的 Pep10 以 1∶2 在 pH 7.2 的 PBS 中室溫孵育 30～40 min，得到結合物 Pep10@MNPs。116 mT 磁場中 PBS 洗滌 5 次，滴定至 10 mg Fe/ml。同法用生物素結合的抗 EpCAM 抗體制備抗 EpCAM@MNPs 制備對照試劑。
細胞系中腫瘤細胞的分離和鑒定：將人肺癌細胞系 A549 用 Hoechst.33342 染色，PBS 洗滌 3 次。取約 50 個染色細胞混合至 1 ml EDTA 抗凝的健康人全血中。加入 10 μl Pep10@MNPs，37℃ 下孵育 30 min，116 mT 磁場中用 PBS 洗滌 5 次。在熒光顯微鏡下計數，計算腫瘤細胞回收率（鑒定的腫瘤細胞數/加入的已染色腫瘤細胞總數）。同法處理人肺腺癌細胞系 NCI-H1975。
受試者 CTC 的分離和鑒定：受試者于術前清晨空腹采血，棄掉前 2 ml 血液后，使用 EDTA 抗凝的采血管從肘靜脈采集 2 ml 血液，采集的血液標本在室溫避光保存不超過 24 h。血液標本中加入 10 μl Pep10@MNPs，37℃ 下孵育 30 min，116 mT 磁場中用 PBS 洗滌 5 次。采用三色免疫熒光染色法鑒定，將分離的 CTC 用 4% 多聚甲醛室溫固定 4 h。加入 DAPI（標記細胞核）、FITC 標記的抗 CK19 抗體、藻紅蛋白標記的抗 CD45 抗體。在熒光顯微鏡下觀察，DAPI+/CK+/CD45-鑒定為 CTC。
1.5 統計學分析
用 SPSS21.0 軟件統計分析。用多因素方差分析比較不同臨床特征肺癌患者 CTC 檢出率的組間差異。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 細胞系中腫瘤細胞的結合率與回收率
細胞系中腫瘤細胞與識別肽 Pep 的結合率可由 FITC 標記的腫瘤細胞數/加入的腫瘤細胞總數表示。Pep 與 A549 細胞、H1975 細胞的結合率分別為 80.0%±6.0%、70.1%±4.8%，這與陽性對照組（抗 EpCAM 抗體）中的結合率（A549 細胞為 90.6%±4.9%、H1975 細胞為 67.2%±3.0%）相近。陰性對照組（鼠 IgG2b k）中的結合率分別為 0.9%±0.3% 和 1.1%±0.9%；見圖 1。
圖1
Pep10、IgG、抗 EpCAM 抗體與 A549 細胞、H1975 細胞的結合率
本研究采用 CK19 標記腫瘤細胞，CD45 標記白細胞，DAPI 是一種可與 DNA 強力結合的熒光染料，本研究中用以標記細胞核。腫瘤細胞在三色免疫熒光下表現為 DAPI 陽性、CK19 陽性、CD45 陰性。納米磁珠法捕獲腫瘤細胞的回收率可由鑒定出的腫瘤細胞數/加入的腫瘤細胞總數表示，分別為 57.3%±7.0%（A549 細胞）和 37.3%±6.1% （H1975 細胞）；見圖 2。
圖2
捕獲的 A549、H1975 細胞免疫熒光染色結果
2.2 受試者
所有 34 例疑診肺癌患者均行手術治療并獲得病理資料，其中 32 例患者經病理證實為肺癌，根據國際肺癌協會（IASLC）第八版分期，肺癌患者Ⅰ～Ⅳ期分別為 23 例、4 例、4 例和 1 例；2 例患者病理證實為肺良性疾病（包括 1 例肺感染性疾病、1 例肺隔離癥）。此外本研究納入 10 名健康受試者。所有 44 例受試者均行 CTC 計數檢測。
2.3 CTC 在不同受試者中的檢出率
不同受試者 CTC 的檢出率見表 1，肺癌患者 CTC 檢出率高達 71.9%，高于肺良性疾病患者（0.0%）和健康受試者（20.0%）。可得納米磁珠法檢測肺癌 CTC 的敏感性為 71.9%，特異性 83.3%，準確性 75.0%，陽性預測值 92.0%，陰性預測值 52.6%。對其進行受試者工作特征（ROC）曲線分析，曲線下面積為 0.792（P=0.003），提示 CTC 可作為肺癌的診斷指標。
表1
不同受試者中 CTC 的檢出率
2.4 CTC 計數與臨床特征的相關性
不同臨床特征肺癌患者的 CTC 陽性率見表 2，顯著性由多因素方差分析計算所得。不同病理分期方面，可見 CTC 檢出率由 Ⅰ 期至 Ⅳ 期有增加趨勢，但差異沒有統計學意義。鱗癌患者的 CTC 檢出率（85.7%）高于腺癌患者（68.0%），但差異沒有統計學意義。CTC 檢出率與患者性別、病灶數目亦無顯著關系。
表2
不同臨床特征肺癌患者 CTC 的檢出率
3 討論
近年來隨著細胞分離技術和測序技術的發展，液體活檢在腫瘤的診治中日益重要。越來越多的文獻表明，檢測 CTC 有助于早期發現肺癌微轉移、重新確定臨床分期、實時監測抗腫瘤治療療效、評估預后、制定個體化的治療策略、闡明腫瘤的生物學進程及轉移機制。本中試研究表明納米磁珠法可良好檢測肺癌 CTC，且測得的 CTC 有望成為肺癌的篩查和良惡性鑒別指標。
CTC 在外周血的含量通常<1 個/108個細胞，需要通過富集提高檢測靈敏度。目前 CTC 的富集鑒定方法主要有三種：（1）基于 RT-PCR 的方法直接檢測上皮標志物如 CK18、CK19、E-cadherin 等的表達；（2）基于細胞大小差異分離 CTC；（3）利用免疫吸附原理分離 CTC。其中免疫吸附法應用最為廣泛，主要分為正向分選和負向分選兩種，正向分選利用上皮分子 EpCAM 作為標志，通過抗原抗體特異性結合捕獲 CTC，代表性技術有 CellSearch、CTC chip、CTC-iCHIP、HB-chip、AdnaTest、Isoflux、MagSweeper 等，其中 CellSearch 目前已被 FDA 批準應用于乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌中，但其對肺癌 CTC 的回收率僅約 20%～40%[4-5]。負向分選利用 CD45 抗體特異性吸附血源性細胞后，對剩余的細胞進一步利用上皮標志物及血源性細胞標志物聯合鑒定 CTC，代表性技術上皮腫瘤細胞大小分離法（ISET）在非小細胞肺癌中的回收率可達 50%[6]。
本研究中的納米磁珠法采用了正向分選，通過特異性識別并結合 EpCAM 實現 CTC 的分離和富集，在先前研究中，我們證明納米磁珠法可與腫瘤細胞良好結合（與 MCF-7、SK-BR-3、PC3、Hep G2 細胞的結合率分別為 88.5%、90.7%、95.8% 和 89.6%）。本研究中，其對 A549 細胞和 H1975 細胞的結合率亦高達 80.0%（A549 細胞）和 70.1%（H1975 細胞），接近陽性對照組（抗 EpCAM 抗體）的 90.6% 和 67.2%，且陰性對照組（鼠 IgG2b k）中的結合率分別為 0.9%±0.3% 和 1.1%±0.9%，表明納米磁珠法可特異性識別并結合肺癌細胞。三色免疫熒光染色法表明 A549 細胞和 H1975 細胞的回收率分別為 57.3%±7.0% 和 37.3%±6.1%，證明納米磁珠法可作為可靠的肺癌 CTC 富集方法。但值得注意的是，此方法將漏過上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的細胞或未分化出上皮表型的腫瘤干細胞。上皮間質轉化指細胞失去上皮表型，轉化為具有較高侵襲轉移和降解細胞外基質能力的間質表型，從而大大提升了腫瘤細胞侵襲轉移的能力。發生上皮間質轉化的細胞，其表面 EpCAM 的表達下降。Lecharpentier 等[7]證實非小細胞肺癌患者體內存在上皮與間質表型嵌合的 CTC。國外報道中基于 EpCAM 識別的肺癌 CTC 檢測的敏感性通常不超過 50%。De Wit 等[8]用 CellSearch 反復檢測 28 例肺癌患者的全血標本，發現 EpCAM 陽性率約為 75%。Pak 等[9]報道 EpCAM 的過表達存在于 39% 的肺腺癌和 85.9% 的肺鱗癌患者中。目前尚未發現其他公認的可用于區分 CTC 和普通上皮細胞的表面標志物[10]。近年來葉酸受體作為肺癌 CTC 的檢測靶點受到了關注，國內文獻報道基于葉酸受體靶向 PCR CTC 檢測方法的診斷肺癌的敏感性高達 80%，特異性為 88%，其中對 Ⅰ 期非小細胞肺癌患者的診斷敏感性達 67.2%[11]。
本研究采用三色免疫熒光染色法鑒定 CTC，分別為 DAPI（標記細胞核）、FITC 標記的抗 CK19 抗體和藻紅蛋白標記的抗 CD45 抗體。這與 CellSearch 技術采用的 CK8、CK18、CK19、CD45 相似，均依賴于細胞表達的上皮表型。
本研究中 CTC 在肺癌患者中的總體檢出率為 71.9%，特異性高達 83.3%，ROC 曲線下面積為 0.792（P=0.003）。值得注意的是，在 Ⅰ 期肺癌患者中，CTC 陽性率仍高達 65.2%，表明納米磁珠法檢測 CTC 有望成為肺癌篩查指標。在類似研究中，Tanaka 等[4]采用 CellSearch 技術對 150 例疑診肺癌患者檢測 CTC，結果表明 38 例（30.6%）肺癌患者及 3 例（12.0%）非肺癌患者可檢出 CTC，ROC 曲線下面積為 0.598（P=0.122）。Fiorelli 等[12]采用 ISET 技術檢測了 60 例肺癌及 17 例肺良性結節患者的 CTC，表明 CTC 計數>25 可作為鑒別肺結節良惡性的可靠指標。
本研究中 CTC 計數隨著肺癌的病理分期的進展而增加，但這一現象差異無統計學意義（P=0.096）。國外報道中，CTC 計數與病理分期的關系與采用的檢測技術有關，采用 CellSearch 技術的研究多認為 CTC 計數與病理分期有關[13]。而 Hofman 等[6]用 ISET 技術檢測了 208 例非小細胞肺癌，發現 CTC 陽性率 50%，且 CTC 計數與病理分期無關。此外，本中試研究未觀察到 CTC 計數與腫瘤病理學類型的關系，這與國外報道一致。一項納入了 20 項研究、1 576 例非小細胞肺癌患者的 Meta 分析表明，肺鱗癌與肺腺癌患者 CTC 計數無顯著差異[14]。
總之，本研究證實我們建立的納米磁珠富集和鑒定肺癌患者 CTC 的方法具有較好的靈敏度和特異性，有望用于肺癌的篩查，為肺癌的早診早治提供有效的臨床指導。檢索 ClinicalTrials.gov，目前在試的有關 CTC 和肺癌的研究已有近 400 項。隨著更多關于納米磁珠法檢測肺癌患者的疾病監測、評估治療反應、評估預后研究的開展，CTC 在肺癌診治中的應用將有更加廣闊的前景。
