引用本文： 王曉進, 李曉劍, 程華, 李巍, 鐘宏城, 鐘北龍, 曹慶東. Periostin 在小細胞肺癌中的表達及其對化療耐藥性的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(6): 516-521. doi: 10.7507/1007-4848.201706035 復制
目前統計發現，小細胞肺癌（SCLC）約占原發性肺癌的 15%，惡性程度高，病情進展迅速，易發生遠處轉移，預后不良[1-2]。由于 SCLC 對化療、放療敏感，臨床上放化療是其主要治療手段，但化療后發生繼發性多藥耐藥頗為常見。目前國際指南推薦的標準一線化療方案：依托泊苷加鉑類有效率在 61%～80%左右，但治療后復發率高，遠期生存時間短[3]，約 70%～80%局限期患者及所有廣泛期患者在治療后數月內即發生疾病進展或復發[4]，SCLC 患者 5 年生存率大致為局限期約 19.9%，廣泛期僅約 2.8%[5]。到目前為止，并未找到理想的 SCLC 診治方法，治療后期 SCLC 對化療出現多重耐藥，仍是未解決的醫學難題。Periostin 為分泌性糖蛋白，相對分子量為 93×103[6]。Periostin 在多種實體瘤組織中高表達，如肺癌、食管癌、胃癌、結腸癌等[7-8]。在非小細胞肺癌中，Periostin 廣泛表達且參與腫瘤微環境的形成，增強癌細胞的侵襲性[9-10]。在胰腺癌，Periostin 可降低腫瘤細胞對化療的敏感性[11]。但 Periostin 對 SCLC 化療耐藥性的影響，暫未見文獻報道。本研究通過觀察 Periostin 在兩種小細胞肺癌株及臨床組織標本中的表達差異及通過重組質粒上調其表達，檢測癌細胞在一定濃度梯度的化療藥物作用下的生存率，探討其對化療耐藥性的影響，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 細胞株與主要試劑、儀器
SCLC 細胞株 H69 和 H69AR 購自美國 ATCC 公司。主要試劑包括 PCR Master Mix（Promega 公司，美國），Trizol RNA 試劑盒，Periostin 人 cDNA 克隆（OriGene Technologies公司，美國），瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、產物純化試劑盒、大腸桿菌 DH5α 感受態細胞、質粒提取試劑盒（Invitrogene 公司，美國），真核表達載體 pcDNA3.1（+）、T4DNA 連接酶、限制性核酸內切酶 HindⅢ、Xho Ⅰ（New England Biolabs公司，美國），兔抗人 Periostin 多克隆抗體（Abeam plc公司，英國）和凱基全蛋白提取試劑盒，Amersham ECL Plus 蛋白質印跡法檢測試劑（Life Sciences，GE Healthcare公司，美國）。主要儀器包括流式細胞儀（Beckman Coulter 公司，美國），PTC-200 梯度基因擴增儀（Bio-Rad 公司，美國），聚合酶鏈式反應（PCR）引物由上海基康生物技術有限公司合成。
1.2 細胞培養和傳代
細胞擴增培養采用 RPMI1640 培養液，其中 H69 株培養液中加入 15% 胎牛血清，H69AR 株培養液加入 20% 胎牛血清，在 37℃，5% CO2 細胞培養箱內進行。實驗均采用對數生長期擴增細胞。
1.3 檢測敏感株 H69 和耐藥細胞株 H69AR 中 Periostin 表達情況
用 Trizol RNA 試劑盒，按照操作說明書進行測量 H69、H69AR 細胞株總 RNA 濃度。先取 1 μg RNA，逆轉錄合成 cDNA，Periostin 引物序列：F 5'-GACGAAGCTTACCATGATTCCCTTTTTACCC-3' R 5'-GACGCTCGAGTCACTGAGAACGACCTF C-3'。內參照用磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為引物，序列為 F5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，R 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'，均由上海基康生物技術公司合成。然后以 cDNA 為模板，PCR 儀中擴增提取 H69、H69AR 細胞中的 RNA 進行逆轉錄，采用 SYBR Green 染料法行即時熒光定量 PCR。逆轉錄及 PCR 擴增參照試劑盒說明進行。PCR 條件：95℃ 預變性 30 s，95℃ 變性 5 s，60℃ 退火 30 s，40 個循環。1% 瓊脂糖凝膠電泳，100 V，20 min，電泳后 0.5 mg/L EB 染色 45 min，凝膠成像系統掃描每個目的條帶的紫外光光密度。計算每個標本擴增的目的條帶與相應內參照基因條帶的光密度比值，為 Periostin mRNA 的相對表達量。
蛋白定量檢測采用二喹啉甲酸（BCA）法，每孔中加樣 50 μg，經 10% 十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用 5% 脫脂奶粉及 TBST 封閉液室溫下封閉 2 h，TBST 滌洗 3 次，加入兔抗人 Periostin 單克隆（1∶200）孵育 4℃ 過夜，加辣根過氧化物酶（HRP）標記單抗兔 IgG（1∶5 000）孵育溫度 37℃，45 min，加入顯色液顯影。
1.4 PCR 擴增人 Periostin 基因片段
根據人 Periostin 基因設計引物，Periostin 引物序列：F 5'-GACGAAGCTTACCATGATTCCCTT TTTACC C-3'，R 5'-GACGCTCGAGTCACTGAGAACGACCTT C-3'。以 Periostin 人 cDNA 克隆為模板擴增 Periostin 基因片段。在正義引物中采用 HindⅢ酶切位點，反義引物中采用 Xho Ⅰ酶切位點。PCR 反應條件：95℃ 預變性 4.5 min，95℃ 變性 5 s，50℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 2.5 min，30 個循環。純化回收 PCR 擴增產物。
1.5 Periostin 基因片段與 pcDNA3.1（+）質粒的連接
將 PCR 擴增的 Periostin 基因片段和 pcDNA3.1（+）質粒分別以 HindⅢ、Xho Ⅰ雙酶切，37℃ 酶切 6 h 后，純化回收酶切產物，將目的片段與載體混合，T4 DNA 連接酶 25℃ 連接過夜，形成重組質粒。
1.6 重組質粒的鑒定
將重組質粒轉化入大腸桿菌 DH5α 感受態細胞，篩選、擴增氨芐青霉素抗性克隆，提取質粒。再通過 HindⅢ、Xho Ⅰ雙酶切擴增的克隆質粒，酶切產物含目的基因片段則為最終陽性重組質粒，經合作基因公司測序證實序列正確后，再用于后續實驗。
1.7 重組質粒轉染 H69 細胞
胰酶消化對數生長期 H69 細胞，按 2×105/孔接種于 6 孔板，培養 24 h 后細胞密度約為 90%。按轉染試劑說明書進行操作，將重組質粒轉染入 H69 細胞株，對照組采用轉染空載體的 H69 細胞。轉染細胞培養、傳代。轉染 2 d 后行 G418 篩選、擴增，得到穩定轉染細胞株。細胞板放于 37℃，5%CO2 培養箱中培養，每 6 h 換新鮮培養液 1 次，共 4 次，轉染后 24 h 提取 Periostin 總蛋白，應用 BCA 法進行蛋白定量檢測，利用 Western blot 檢測穩定轉染組和空載轉染組中的 Periostin 蛋白表達量。Periostin 蛋白相對表達量以其電泳條帶與 GAPDH 條帶灰度值的比值表示。
1.8 細胞增殖檢測試劑盒（CCK8）法檢測藥物敏感性
將對數生長期的細胞按 5×103/孔種于 96 孔培養板中，設空白對照孔，培養 24 h 后，將化療藥物加入培養液中并進行稀釋，按不同濃度分別加入指定的孔中（順鉑根據 IC50 值分別設 0、5、10、20、40 μg/ml 5 個藥物濃度，依托泊苷根據 IC50 值分別設 0、10、20、40、80 μg/ml 5 個藥物濃度），每個藥物濃度，空白對照，陽性對照，每組共 5 個復孔，各組細胞培養 24 h 后，加入 CCK8 反應液，在 37℃，5% CO2 培養箱中再培養 2 h 后，經流式細胞儀檢測樣本 450 nm 吸光度值。（每組藥物組吸光度值的平均值–空白組平均值）/陽性對照組平均值，即為每個藥物濃度下的細胞存活率。重復實驗 3 次，由不同藥物濃度細胞存活率平均值進行作圖。
1.9 免疫組織化學檢測臨床標本
采用鏈霉菌親和素-過氧化物酶（SP）法對 2013 年 1 月至 2016 年 6 月中山大學附屬第五醫院病理確診的 43 例 SCLC 患者組織標本蠟塊進行處理（表 1），具體步驟如下：石蠟標本切片，脫蠟處理，進行水化，再高溫高壓抗原修復，加 3% 過氧化氫溶液在室溫下孵育 10 min，可以阻斷內源性過氧化物酶，加入 Perisotin 兔抗人單克隆抗體。室溫下孵育 60 min，加入 DAB 顯色液后用中性樹脂封住載玻片，設陽性對照組，用 PBS 緩沖液代替一抗做陰性對照組。顯微鏡下觀察，陽性細胞為棕黃色，2 名病理科主治醫師對免疫組化結果進行半定量核實判定。按顯色的陽性細胞占比分為：無陽性細胞，0 分；≤10% 陽性細胞，1 分，11%～25% 陽性細胞，2 分；26%～50% 陽性細胞，3 分；>50% 的陽性細胞，4 分。按著色深度分為：無色為 0 分，淺黃色為 1 分，棕黃色為 2 分。將二者積分相加，作為結果判斷標準，陰性≤3 分，陽性≥4 分。
1.10 統計學分析
采用 IBM SPSS19.0 統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（
）表示，采用 t 檢驗或重復測量的多因素方差分析，計數資料采用 χ2 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 在 SCLC 多藥耐藥細胞株 H69AR 和敏感株 H69 中的表達
Periostin 在 H69AR 內的 mRNA 表達水平顯著高于 H69（1.49±0.21 vs. 0.81±0.11，t=5.03，P<0.05）。Western blot 示：Periostin 在 H69AR 內的表達含量顯著高于 H69（3.29±0.41vs. 1.34±0.20，t=7.42，P<0.05）；見圖 1。
圖1
Periostin mRNA 在 H69 及 H69AR 中的表達
2.2 Periostin 穩轉組和空載組中的蛋白質表達
Periostin 在 H69 穩轉組內的表達水平（2.08±0.25）顯著高于 H69 空載組（1.22±0.1）及 H69 未轉染組（1.28±0.14），差異有統計學意義；見圖 2。
圖2
Periostin 蛋白在穩轉組與 H69 組、空載組的表達
2.3 不同藥物濃度（順鉑，依托泊苷）下重組質粒轉染
H69 細胞存活率曲線見圖 3、圖 4。存在重組質粒處理主效應和藥物濃度效應的交互作用，采用重復測量多因素方差分析，組間主效應差異有統計學意義（P 順鉑=0.035，P 依托泊苷=0.029），濃度主效應差異有統計學意義（ P<0.01），重組轉染組與其他比較，差異有統計學意義。
圖3
重組質粒轉染 H69 細胞在不同濃度的順鉑中存活率曲線
圖4
重組質粒轉染 H69 細胞在不同濃度的依托泊苷中存活率曲線
2.4 Periostin 在 SCLC 組織中的表達
表1
患者的一般情況資料（例/
）
圖5
SCLC 免疫組織化學 Periostin 陽性（×400 倍）
Periostin 在 43 例小細胞肺癌患者組織中 29 例為陽性表達，其陽性表達率為 67.44%（29/43），其中化療敏感組中的陽性率為 47.05%（13/24），而化療耐藥組中的陽性率為 84.21%（16/19），差異有統計學意義（χ2=4.359，r=0.318，P=0.037）；見圖 5。
3 討論
近 20 年 SCLC 的治療方案相比非小細胞肺癌，無明顯進展，5 年生存率仍維持在較低水平[12-13]。腫瘤對化療藥物敏感性是影響 SCLC 治療效果的重要因素，SCLC 一線化療后期普遍出現化療耐藥導致病情進展，是化療失敗的主要原因之一[3, 14]。Periostin 作為一種分泌性糖蛋白，文獻顯示其在多種實體腫瘤中均有表達，具有促進癌細胞增殖和降低化療敏感性的作用[11]。本研究觀察了 Periostin 在 SCLC 細胞株及臨床標本中的表達情況，實驗 Q-PCR 和 Western blot 結果顯示在人 SCLC 敏感株 H69 和耐藥株 H69AR 中，從 mRNA 及蛋白兩個水平比較，Periostin 在 H69 細胞的表達均低于耐藥細胞 H69AR，差異有統計學意義。應用免疫組織化學檢測臨床 SCLC 患者的組織標本，Periostin 在化療耐藥組中的陽性率為 84.21%，高于敏感組中的 47.05%。上述現象具有一致性，這提示 Periostin 與 SCLC 的化療耐藥可能存在一定的相關性。
為進一步探索 Periostin 的表達狀況與 SCLC 細胞耐藥的關系，我們采用 pcDNA3.1（+）質粒-Periostin 重組質粒轉染 H69 細胞，并穩定表達。實驗結果顯示：上調 H69 細胞的 Periostin 蛋白表達水平，細胞生存率較對照組增高，這提示 Periostin 參與小細胞肺癌化療耐藥，其過表達增強細胞對化療藥物順鉑及依托泊苷的抗性。Erkan 等[15]研究表明 Periostin 在胰腺癌中能促進腫瘤微環境形成，降低腫瘤細胞對放化療的敏感性，增強癌細胞的侵襲性，再次支持 Periostin 參與多種腫瘤的化療耐藥，但機制是否相同有待進一步探究。
Hong 等[16]報道在非小細胞肺癌中，Periostin 高表達的患者預后不良，二者有明顯相關性。本研究根據患者臨床資料特征，將 SCLC 組織標本分為化療敏感組和化療耐藥組，通過免疫組化分析發現，總體 Periostin 陽性表達率為 67.44%，其中化療耐藥組明顯高于化療敏感組（84.21% vs. 47.05%），提示 Periostin 的高表達與 SCLC 化療耐藥有一定的相關性（r=0.318）。Periostin 的表達差異是化療耐藥的結果還是耐藥的原因，需進一步對 SCLC 患者化療耐藥前后的組織再次活檢配對分析。Periostin 在 SCLC 中的信號通路機制如何有待進一步深入研究，目前關于 Periostin 蛋白在腫瘤中的信號通路，Bao 等研究發現在結腸癌中，Periostin 蛋白與整合素 αvβ3 受體結合，進一步激活 Akt/PKB 通路，促進癌細胞增殖、降低彈力纖維合成和粘著斑形成，癌細胞呈現間質細胞特性，遷移能力增強[17]。另有 Xiao 等[18]提出可以通過 PI3K/Akt /survivin 通路促進腫瘤細胞化療耐藥導致腫瘤進展，為探索 Periostin 在 SCLC 耐藥治療中是否具有潛在的作用靶點提供理論支持。
綜上所述，本研究顯示 Periostin 在 SCLC 細胞敏感株 H69 中的表達明顯低于耐藥株 H69AR，在臨床 SCLC 標本中 Periostin 的高表達與 SCLC 化療耐藥性有一定的相關性。 Periostin 高表達可增加 SCLC 對化療耐藥的能力，作用機制需進一步闡明。研究不足之處在于缺乏下調 Periostin 表達的實驗，觀察耐藥癌細胞株對化療藥物敏感性的變化。Periostin 能否作為潛在靶點，需要更多的實驗依據，繼續推動改變 SCLC 的治療進展。
目前統計發現，小細胞肺癌（SCLC）約占原發性肺癌的 15%，惡性程度高，病情進展迅速，易發生遠處轉移，預后不良[1-2]。由于 SCLC 對化療、放療敏感，臨床上放化療是其主要治療手段，但化療后發生繼發性多藥耐藥頗為常見。目前國際指南推薦的標準一線化療方案：依托泊苷加鉑類有效率在 61%～80%左右，但治療后復發率高，遠期生存時間短[3]，約 70%～80%局限期患者及所有廣泛期患者在治療后數月內即發生疾病進展或復發[4]，SCLC 患者 5 年生存率大致為局限期約 19.9%，廣泛期僅約 2.8%[5]。到目前為止，并未找到理想的 SCLC 診治方法，治療后期 SCLC 對化療出現多重耐藥，仍是未解決的醫學難題。Periostin 為分泌性糖蛋白，相對分子量為 93×103[6]。Periostin 在多種實體瘤組織中高表達，如肺癌、食管癌、胃癌、結腸癌等[7-8]。在非小細胞肺癌中，Periostin 廣泛表達且參與腫瘤微環境的形成，增強癌細胞的侵襲性[9-10]。在胰腺癌，Periostin 可降低腫瘤細胞對化療的敏感性[11]。但 Periostin 對 SCLC 化療耐藥性的影響，暫未見文獻報道。本研究通過觀察 Periostin 在兩種小細胞肺癌株及臨床組織標本中的表達差異及通過重組質粒上調其表達，檢測癌細胞在一定濃度梯度的化療藥物作用下的生存率，探討其對化療耐藥性的影響，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 細胞株與主要試劑、儀器
SCLC 細胞株 H69 和 H69AR 購自美國 ATCC 公司。主要試劑包括 PCR Master Mix（Promega 公司，美國），Trizol RNA 試劑盒，Periostin 人 cDNA 克隆（OriGene Technologies公司，美國），瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、產物純化試劑盒、大腸桿菌 DH5α 感受態細胞、質粒提取試劑盒（Invitrogene 公司，美國），真核表達載體 pcDNA3.1（+）、T4DNA 連接酶、限制性核酸內切酶 HindⅢ、Xho Ⅰ（New England Biolabs公司，美國），兔抗人 Periostin 多克隆抗體（Abeam plc公司，英國）和凱基全蛋白提取試劑盒，Amersham ECL Plus 蛋白質印跡法檢測試劑（Life Sciences，GE Healthcare公司，美國）。主要儀器包括流式細胞儀（Beckman Coulter 公司，美國），PTC-200 梯度基因擴增儀（Bio-Rad 公司，美國），聚合酶鏈式反應（PCR）引物由上海基康生物技術有限公司合成。
1.2 細胞培養和傳代
細胞擴增培養采用 RPMI1640 培養液，其中 H69 株培養液中加入 15% 胎牛血清，H69AR 株培養液加入 20% 胎牛血清，在 37℃，5% CO2 細胞培養箱內進行。實驗均采用對數生長期擴增細胞。
1.3 檢測敏感株 H69 和耐藥細胞株 H69AR 中 Periostin 表達情況
用 Trizol RNA 試劑盒，按照操作說明書進行測量 H69、H69AR 細胞株總 RNA 濃度。先取 1 μg RNA，逆轉錄合成 cDNA，Periostin 引物序列：F 5'-GACGAAGCTTACCATGATTCCCTTTTTACCC-3' R 5'-GACGCTCGAGTCACTGAGAACGACCTF C-3'。內參照用磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為引物，序列為 F5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，R 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'，均由上海基康生物技術公司合成。然后以 cDNA 為模板，PCR 儀中擴增提取 H69、H69AR 細胞中的 RNA 進行逆轉錄，采用 SYBR Green 染料法行即時熒光定量 PCR。逆轉錄及 PCR 擴增參照試劑盒說明進行。PCR 條件：95℃ 預變性 30 s，95℃ 變性 5 s，60℃ 退火 30 s，40 個循環。1% 瓊脂糖凝膠電泳，100 V，20 min，電泳后 0.5 mg/L EB 染色 45 min，凝膠成像系統掃描每個目的條帶的紫外光光密度。計算每個標本擴增的目的條帶與相應內參照基因條帶的光密度比值，為 Periostin mRNA 的相對表達量。
蛋白定量檢測采用二喹啉甲酸（BCA）法，每孔中加樣 50 μg，經 10% 十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用 5% 脫脂奶粉及 TBST 封閉液室溫下封閉 2 h，TBST 滌洗 3 次，加入兔抗人 Periostin 單克隆（1∶200）孵育 4℃ 過夜，加辣根過氧化物酶（HRP）標記單抗兔 IgG（1∶5 000）孵育溫度 37℃，45 min，加入顯色液顯影。
1.4 PCR 擴增人 Periostin 基因片段
根據人 Periostin 基因設計引物，Periostin 引物序列：F 5'-GACGAAGCTTACCATGATTCCCTT TTTACC C-3'，R 5'-GACGCTCGAGTCACTGAGAACGACCTT C-3'。以 Periostin 人 cDNA 克隆為模板擴增 Periostin 基因片段。在正義引物中采用 HindⅢ酶切位點，反義引物中采用 Xho Ⅰ酶切位點。PCR 反應條件：95℃ 預變性 4.5 min，95℃ 變性 5 s，50℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 2.5 min，30 個循環。純化回收 PCR 擴增產物。
1.5 Periostin 基因片段與 pcDNA3.1（+）質粒的連接
將 PCR 擴增的 Periostin 基因片段和 pcDNA3.1（+）質粒分別以 HindⅢ、Xho Ⅰ雙酶切，37℃ 酶切 6 h 后，純化回收酶切產物，將目的片段與載體混合，T4 DNA 連接酶 25℃ 連接過夜，形成重組質粒。
1.6 重組質粒的鑒定
將重組質粒轉化入大腸桿菌 DH5α 感受態細胞，篩選、擴增氨芐青霉素抗性克隆，提取質粒。再通過 HindⅢ、Xho Ⅰ雙酶切擴增的克隆質粒，酶切產物含目的基因片段則為最終陽性重組質粒，經合作基因公司測序證實序列正確后，再用于后續實驗。
1.7 重組質粒轉染 H69 細胞
胰酶消化對數生長期 H69 細胞，按 2×105/孔接種于 6 孔板，培養 24 h 后細胞密度約為 90%。按轉染試劑說明書進行操作，將重組質粒轉染入 H69 細胞株，對照組采用轉染空載體的 H69 細胞。轉染細胞培養、傳代。轉染 2 d 后行 G418 篩選、擴增，得到穩定轉染細胞株。細胞板放于 37℃，5%CO2 培養箱中培養，每 6 h 換新鮮培養液 1 次，共 4 次，轉染后 24 h 提取 Periostin 總蛋白，應用 BCA 法進行蛋白定量檢測，利用 Western blot 檢測穩定轉染組和空載轉染組中的 Periostin 蛋白表達量。Periostin 蛋白相對表達量以其電泳條帶與 GAPDH 條帶灰度值的比值表示。
1.8 細胞增殖檢測試劑盒（CCK8）法檢測藥物敏感性
將對數生長期的細胞按 5×103/孔種于 96 孔培養板中，設空白對照孔，培養 24 h 后，將化療藥物加入培養液中并進行稀釋，按不同濃度分別加入指定的孔中（順鉑根據 IC50 值分別設 0、5、10、20、40 μg/ml 5 個藥物濃度，依托泊苷根據 IC50 值分別設 0、10、20、40、80 μg/ml 5 個藥物濃度），每個藥物濃度，空白對照，陽性對照，每組共 5 個復孔，各組細胞培養 24 h 后，加入 CCK8 反應液，在 37℃，5% CO2 培養箱中再培養 2 h 后，經流式細胞儀檢測樣本 450 nm 吸光度值。（每組藥物組吸光度值的平均值–空白組平均值）/陽性對照組平均值，即為每個藥物濃度下的細胞存活率。重復實驗 3 次，由不同藥物濃度細胞存活率平均值進行作圖。
1.9 免疫組織化學檢測臨床標本
采用鏈霉菌親和素-過氧化物酶（SP）法對 2013 年 1 月至 2016 年 6 月中山大學附屬第五醫院病理確診的 43 例 SCLC 患者組織標本蠟塊進行處理（表 1），具體步驟如下：石蠟標本切片，脫蠟處理，進行水化，再高溫高壓抗原修復，加 3% 過氧化氫溶液在室溫下孵育 10 min，可以阻斷內源性過氧化物酶，加入 Perisotin 兔抗人單克隆抗體。室溫下孵育 60 min，加入 DAB 顯色液后用中性樹脂封住載玻片，設陽性對照組，用 PBS 緩沖液代替一抗做陰性對照組。顯微鏡下觀察，陽性細胞為棕黃色，2 名病理科主治醫師對免疫組化結果進行半定量核實判定。按顯色的陽性細胞占比分為：無陽性細胞，0 分；≤10% 陽性細胞，1 分，11%～25% 陽性細胞，2 分；26%～50% 陽性細胞，3 分；>50% 的陽性細胞，4 分。按著色深度分為：無色為 0 分，淺黃色為 1 分，棕黃色為 2 分。將二者積分相加，作為結果判斷標準，陰性≤3 分，陽性≥4 分。
1.10 統計學分析
采用 IBM SPSS19.0 統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（
）表示，采用 t 檢驗或重復測量的多因素方差分析，計數資料采用 χ2 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 在 SCLC 多藥耐藥細胞株 H69AR 和敏感株 H69 中的表達
Periostin 在 H69AR 內的 mRNA 表達水平顯著高于 H69（1.49±0.21 vs. 0.81±0.11，t=5.03，P<0.05）。Western blot 示：Periostin 在 H69AR 內的表達含量顯著高于 H69（3.29±0.41vs. 1.34±0.20，t=7.42，P<0.05）；見圖 1。
圖1
Periostin mRNA 在 H69 及 H69AR 中的表達
2.2 Periostin 穩轉組和空載組中的蛋白質表達
Periostin 在 H69 穩轉組內的表達水平（2.08±0.25）顯著高于 H69 空載組（1.22±0.1）及 H69 未轉染組（1.28±0.14），差異有統計學意義；見圖 2。
圖2
Periostin 蛋白在穩轉組與 H69 組、空載組的表達
2.3 不同藥物濃度（順鉑，依托泊苷）下重組質粒轉染
H69 細胞存活率曲線見圖 3、圖 4。存在重組質粒處理主效應和藥物濃度效應的交互作用，采用重復測量多因素方差分析，組間主效應差異有統計學意義（P 順鉑=0.035，P 依托泊苷=0.029），濃度主效應差異有統計學意義（ P<0.01），重組轉染組與其他比較，差異有統計學意義。
圖3
重組質粒轉染 H69 細胞在不同濃度的順鉑中存活率曲線
圖4
重組質粒轉染 H69 細胞在不同濃度的依托泊苷中存活率曲線
2.4 Periostin 在 SCLC 組織中的表達
表1
患者的一般情況資料（例/
）
圖5
SCLC 免疫組織化學 Periostin 陽性（×400 倍）
Periostin 在 43 例小細胞肺癌患者組織中 29 例為陽性表達，其陽性表達率為 67.44%（29/43），其中化療敏感組中的陽性率為 47.05%（13/24），而化療耐藥組中的陽性率為 84.21%（16/19），差異有統計學意義（χ2=4.359，r=0.318，P=0.037）；見圖 5。
3 討論
近 20 年 SCLC 的治療方案相比非小細胞肺癌，無明顯進展，5 年生存率仍維持在較低水平[12-13]。腫瘤對化療藥物敏感性是影響 SCLC 治療效果的重要因素，SCLC 一線化療后期普遍出現化療耐藥導致病情進展，是化療失敗的主要原因之一[3, 14]。Periostin 作為一種分泌性糖蛋白，文獻顯示其在多種實體腫瘤中均有表達，具有促進癌細胞增殖和降低化療敏感性的作用[11]。本研究觀察了 Periostin 在 SCLC 細胞株及臨床標本中的表達情況，實驗 Q-PCR 和 Western blot 結果顯示在人 SCLC 敏感株 H69 和耐藥株 H69AR 中，從 mRNA 及蛋白兩個水平比較，Periostin 在 H69 細胞的表達均低于耐藥細胞 H69AR，差異有統計學意義。應用免疫組織化學檢測臨床 SCLC 患者的組織標本，Periostin 在化療耐藥組中的陽性率為 84.21%，高于敏感組中的 47.05%。上述現象具有一致性，這提示 Periostin 與 SCLC 的化療耐藥可能存在一定的相關性。
為進一步探索 Periostin 的表達狀況與 SCLC 細胞耐藥的關系，我們采用 pcDNA3.1（+）質粒-Periostin 重組質粒轉染 H69 細胞，并穩定表達。實驗結果顯示：上調 H69 細胞的 Periostin 蛋白表達水平，細胞生存率較對照組增高，這提示 Periostin 參與小細胞肺癌化療耐藥，其過表達增強細胞對化療藥物順鉑及依托泊苷的抗性。Erkan 等[15]研究表明 Periostin 在胰腺癌中能促進腫瘤微環境形成，降低腫瘤細胞對放化療的敏感性，增強癌細胞的侵襲性，再次支持 Periostin 參與多種腫瘤的化療耐藥，但機制是否相同有待進一步探究。
Hong 等[16]報道在非小細胞肺癌中，Periostin 高表達的患者預后不良，二者有明顯相關性。本研究根據患者臨床資料特征，將 SCLC 組織標本分為化療敏感組和化療耐藥組，通過免疫組化分析發現，總體 Periostin 陽性表達率為 67.44%，其中化療耐藥組明顯高于化療敏感組（84.21% vs. 47.05%），提示 Periostin 的高表達與 SCLC 化療耐藥有一定的相關性（r=0.318）。Periostin 的表達差異是化療耐藥的結果還是耐藥的原因，需進一步對 SCLC 患者化療耐藥前后的組織再次活檢配對分析。Periostin 在 SCLC 中的信號通路機制如何有待進一步深入研究，目前關于 Periostin 蛋白在腫瘤中的信號通路，Bao 等研究發現在結腸癌中，Periostin 蛋白與整合素 αvβ3 受體結合，進一步激活 Akt/PKB 通路，促進癌細胞增殖、降低彈力纖維合成和粘著斑形成，癌細胞呈現間質細胞特性，遷移能力增強[17]。另有 Xiao 等[18]提出可以通過 PI3K/Akt /survivin 通路促進腫瘤細胞化療耐藥導致腫瘤進展，為探索 Periostin 在 SCLC 耐藥治療中是否具有潛在的作用靶點提供理論支持。
綜上所述，本研究顯示 Periostin 在 SCLC 細胞敏感株 H69 中的表達明顯低于耐藥株 H69AR，在臨床 SCLC 標本中 Periostin 的高表達與 SCLC 化療耐藥性有一定的相關性。 Periostin 高表達可增加 SCLC 對化療耐藥的能力，作用機制需進一步闡明。研究不足之處在于缺乏下調 Periostin 表達的實驗，觀察耐藥癌細胞株對化療藥物敏感性的變化。Periostin 能否作為潛在靶點，需要更多的實驗依據，繼續推動改變 SCLC 的治療進展。
