引用本文： 尹力, 陳文, 何帥, 邱志兵. 中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）信號通路在豬靜脈橋血管早期再狹窄模型中的表達及作用. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(5): 427-433. doi: 10.7507/1007-4848.201704029 復制
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）是一種血管炎性與復雜的多因素疾病病理生理參與的常見病[1]。隨著社會的發展與人們生活水平的提高，CHD 在人群中的發病率逐年增加。冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）已成為心臟外科治療 CHD 的常規手術之一，然而 CABG 術后橋血管通暢率不高[2]、橋血管再狹窄等術后并發癥大大降低了手術效果，也給手術患者帶來很大的困擾與痛苦。因此，CABG 術后橋血管的再狹窄機制成為當前研究的熱點，目前認為血管再狹窄可能與細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）的降解、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖遷移和不良的血管重塑（vascular remodeling，VR）等因素有關[3]。中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associatedlipocalin，NGAL）作為 lipocalin 家族中的一員更多作為一種致炎因子用于急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）等的研究[4]，但近些年有研究表明NGAL 在動脈粥樣硬化、血管狹窄的形成中有特殊意義[5-6]，最近有大量的臨床研究表明，NGAL 與 CHD、心肌梗死的發生與預后有重要的聯系[7-9]。但 NGAL 在心血管中，特別是在 CABG 術后，導致血管狹窄、致炎、血管損傷等方面作用機制還未被闡明。本文通過建立動物模型，模擬一種與人 CABG 術后橋靜脈再狹窄相關的病理過程，探討 NGAL 及其下游的作用因子在靜脈橋血管中表達，從而探索 NGAL 信號通路在動脈粥樣硬化、血管狹窄的形成中可能的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和試劑
健康的普通長白豬 18 只，雌雄不拘，體重 25～30 kg。超薄切片機（RM213 型，Leica 公司，德國），光學顯微鏡（ⅣC TK-870E，Olympus 公司，日本），高清晰度數碼顯微圖像分析系統（Axioplan 2 imaging，Zeiss 公司，德國）；NGAL（AntibodyShop 公司，丹麥）；基質金屬蛋白酶（MMP）9、MMP2、組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）1（Abcam 公司，美國）。
1.2 豬靜脈橋再狹窄模型的建立
根據萬松等[10-11]實驗方式建立豬靜脈橋模型，將實驗對象用鹽酸氯胺酮（20 mg/kg）、阿托品（1 mg）肌肉注射基礎麻醉后，行氣管插管并接麻醉機輔助通氣，再以氯胺酮和苯巴比妥鈉靜脈維持麻醉。局部消毒鋪巾后，取后腿外側切口，長約 8～10 cm，采用“no-touch”技術剝離大隱靜脈，分支以 3-0 絲線結扎，游離其主干長約 10 cm ，離斷后置于合肝素和硝酸甘油的常溫生理鹽水中沖洗并保存備用。然后頸部兩側氣管旁 8～10 cm 距離縱切口，逐層分離頸部肌群，于兩側氣管食管溝內解剖出兩側頸總動脈。離斷動脈前給予肝素鈉 1 mg/kg 靜脈注射，全身肝素化后用 Bulldog 鉗阻斷動脈兩端，預留動脈段約 3 cm，從動脈段中間切斷，斷端一側剪開并斜剪為 45 度，大隱靜脈等分為兩段同樣剪為 45 度，倒轉，然后用 7-0 Prolene 線與兩側頸總動脈進行端端吻合，吻合方式同血管吻合，完畢后開放阻斷鉗，靜脈橋充盈，觸之有搏動，切口常規逐層縫合。復蘇后常規飼養，未使用抗生素和抗凝藥。
1.3 術后分組及標本制備
將動物標本隨機分為建模后 7 d、14 d 和 30 d 共 3 組，每組 6 只，分別于建模后不同時間點，將豬麻醉后，經原頸部切口于氣管食管溝內找到靜脈橋，切斷靜脈橋遠端吻合口動脈端，可見血液噴出，證實靜脈橋通暢，保留兩端動脈約 1 cm，完整取下靜脈橋，10% 中性甲醛固定，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等程序制成蠟塊，切片厚度 5 μm，以未移植前大隱靜脈為對照。
1.4 實驗方法
1.4.1 蘇木素-伊紅（HE）染色與 Masson 染色
通過 HE 染色，石蠟切片脫蠟水化，蘇木素染色 5 min，流水沖洗 10 min，1% 氯化氫脫色，流水沖洗 10 min，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。蘇木素染液為堿性，使細胞核著紫藍色；伊紅為酸性，使細胞質著紅色，通過 Masson 染色法將膠原纖維染成綠色，平滑肌纖維呈紅色。用光鏡觀察靜脈橋內膜、中膜、外膜的變化，以及各層膜中膠原變化和 VSMC 增殖、遷移情況，拍照以做記錄。
1.4.2 免疫組織化學染色
石蠟切片脫蠟水化，過氧化氫消耗過氧化氫酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗 5 min，3 次，枸櫞酸緩沖液水煮抗原修復，山羊血清工作液封閉，分別加入一抗 NGAL、MMP9、MMP2、TIMP1，滴加一抗稀釋液作為陰性參照組，4℃ 孵育過夜，室溫復溫 1 h，PBS 浸洗 5 min，4 次，分別滴加二抗，室溫孵育 15 min，顯微鏡下 DAB 液染色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。染色結果判定標準多參照 Fromowitz 等半定量分級法方法，在高倍鏡下對細胞核內反應作如下評分：① 無著色為 0 分，淡黃色為 1 分，棕黃色為 2 分，棕褐色為 3 分；② 陽性范圍：<5% 為 0 分，5%～25% 為 1 分，26%～50% 為 2 分，51%～75% 為 3 分，>75% 為 4 分。兩項結果相加<2 分為陰性（–），2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為中度陽性（++），6～7 分為強陽性（+++），其中（–）～（+）視為低表達，（++）～（+++）視為過表達。
1.5 統計學分析
所有數據均應用 SPSS11.0 統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（
）表示，組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 HE 染色與 Masson 染色結果
HE 染色，光鏡下觀察，細胞核呈藍色，膠原纖維呈淡粉紅色，肌纖維呈亮粉紅色，與對照組相比，實驗組中靜脈橋血管中膜層膠原基質降解，中膜層肌纖維增生，并向內膜層遷移，建模 14 d 與 7 d 相比，中膜層肌纖維染色明顯，并且向內膜層遷移，建模 30 d 肌纖維層明顯向內膜層遷移，并且中膜層膠原基質降解，彈力纖維層甚至出現斷裂、紊亂現象，由此不難看出，橋血管的狹窄，與中膜層膠原基質降解，肌纖維增生并向內膜遷移有著密切的聯系，膠原基質降解，彈力纖維層被破壞，肌纖維增厚向內膜遷移，從而導致橋血管的再狹窄（圖 1a）。Masson 染色，細胞質、肌纖維和紅細胞呈紅色，細胞核呈藍褐色。建模 14 d 藍色的膠原纖維逐漸被紅色的肌纖維取代，30 d 時紅色肌纖維增多并向內膜層延伸，并且中膜、內膜層細胞排列紊亂，失去原來的血管結構（圖 1b），這與 HE 染色的結果一致。提示本實驗建立橋血管狹窄模型成功。
2.2 免疫組織化學染色結果
2.2.1 NGAL 在橋血管中的表達
正常靜脈中，血管內膜、中膜和外膜 NAGL 表達均呈陰性或弱陽性（圖 2a）；建模 7 d 與正常靜脈相似，無明顯表達；建模后 14 d 與正常靜脈相比，中膜層明顯出現 NGAL 表達（P<0.05），內膜、外膜層未見明顯表達，建模后 30 d 與正常靜脈相比，中膜層 NGAL 的表達量增加（P<0.05），并且有向內膜層遷移的趨勢，而與建模后 14 d 相比，表達量增加不明顯（圖 2b）。由此可以看出，NGAL 參與到血管再狹窄的過程中，最初主要作用于血管中膜層，在建模后 14 d開始出現一個表達高峰，并一直持續到建模后 30 d，并且隨著時間的推移，內膜層也逐漸出現 NGAL 的表達。
2.2.2 MMP9、MMP2 在橋血管中的表達
正常大隱靜脈中 MMP9 幾乎不表達（圖 3a），建模后 7 d 中膜層 MMP9 開始出現陽性表達（P<0.05），與正常靜脈相比，術后 14 d 中膜層陽性表達顯著（P<0.05），并且內膜層也出現陽性表達，建模后 30 d 中膜 MMP9 表達明顯減少。MMP2 也出現類似 MMP9 的表達趨勢，只是表達量相對于 MMP9 較少（圖 3b）。由此可以看出，MMP9 和 MMP2 在建模后 7d 出現明顯表達，在 14 d 后出現表達高峰，此后逐漸減少，30 d 時 MMP9 和 MMP2 表達量已經明顯下降，與正常大隱靜脈無明顯差異。
2.2.3 TIMP1 在橋血管中的表達
本實驗同時檢測不同建模時間后 TIMP1 的表達（圖 4a），可以看出建模后 14 d 的表達量明顯增加，與正常靜脈相比，差異有統計學意義（P<0.05），與 MMP9、MMP2 相比，TIMP1 的表達有相對滯后的趨勢（圖 4b），并且表達量與 MMP9、MMP2 相比也相對較低，考慮可能與 TIMP1 的負性調節有關。
3 討論
有研究[12]表明，基質的降解和 VSMC 的增殖活性改變等血管重塑的發生，參與并促進了血管橋再狹窄的發生過程。本研究發現建模后 7 d 靜脈橋血管中膜層膠原基質開始出現降解，中膜層肌纖維逐漸增生，建模 14 d 后，中膜層肌纖維增生明顯，并且向內膜層遷移，建模 30 d 中膜層膠原基質降解，甚至出現斷裂現象，并且肌纖維層明顯向內膜層遷移，直觀地展現了橋血管發生狹窄的病理過程。
NGAL 最早用于研究急、慢性腎損傷等的病理過程，在腎臟疾病中作為一種是新型標志物運用到臨床中，并且有研究表明 NGAL 在抑制腫瘤細胞粘附、轉移、血管生成等方面具有應用價值[13-14]。近些年 NGAL 逐漸應用到心臟疾病中去，Kafkas 等[5]報道 CHD 患者血清 NGAL 水平與C反應蛋白（CRP）、白細胞數顯著正相關，提示血清中 NGAL 可反映冠狀動脈綜合征患者的炎癥水平，有研究表明，在 CHD 患者血清中 NGAL 的表達量明顯高于正常人，并且 NGAL 在不同冠狀動脈狹窄程度時表達有明顯差異，說明 NGAL 在 CHD 的形成、血管狹窄中發揮作用，NGAL 存在于中性粒細胞中的過氧化物酶陰性顆粒中[15]，NF-κB 的活化能夠促進 NGAL 的表達[16]。各種危險因素、環境、應激的因素，可通過白介素（IL）1、IL6、腫瘤壞死因子（TNF）-α 等炎癥因子的表達，促進核因子-κB（NF-κB）的表達增加，可促使 NGAL 在轉錄水平、蛋白水平升高。本研究顯示，在正常靜脈中 NAGL 無明顯表達；在建立豬狹窄靜脈橋模型后，隨著時間的推移 NGAL 的表達量出現明顯變化，特別是在中膜層，14 d 表達量明顯增加，30 d 后達到一個表達高峰，并有向內膜層遷移的趨勢。此實驗可以直觀看到在橋血管狹窄的急性期 NGAL 的主要作用靶點，并且可以看到在整個急性期內 NGAL 表達趨勢的變化，不難看出，NGAL 在整個橋血管狹窄的發生過程中起促進作用。
NGAL 是在研究 MMP9 時發現的 MMPs 作為 NGAL 的下游因子已被證明是斑塊不穩定的關鍵因素[17-18]，血管斑塊的不穩定性是造成血管粥樣硬化性狹窄的原因之一，研究表明 MMPs 在細胞遷移和基質重塑中發揮作用[19]。
MMP9 主要由中性粒細胞和巨噬細胞合成與分泌，降解血管基膜，促進病理性血管重塑，有研究表明血清 MMP9 的濃度與冠狀動脈狹窄嚴重程度之間有相關性[20]，Kalela 等[21]通過研究糖尿病、高脂血癥等 CHD 的危險因素與 MMP9 的關系，發現 MMP9 與白細胞計數呈顯著正相關，說明 MMP9 作為致炎因子參與血管狹窄的發生。大部分情況下 MMP9 以前體形式（pro-MMP9）分泌，而 NGAL 可與之以二硫鍵為基礎形成異源二聚體 NGAL/pro-MMP9 共同發揮作用[22]。本實驗顯示 MMP9 在建模后也出現類似 NGAL 的表達，建模后 7 d 表達量明顯增加，表達的高峰期出現在建模后 14 d，而建模后 30 d 表達量已經明顯下降，MMP2 與 MMP9 有相似的表達。但是 MMPs 的表達與 NGAL 并不完全同步，考慮可能與 TIMP1 負性調節有關。
有研究[23]表明，TIMP1 的表達沒有對血管的狹窄起直接的作用，而是因為血管壁中 MMPs 的升高所產生的代償反應，所以 TIMP1 相當于一個負性調節因子，在通路中起平衡作用，研究[24]發現 TIMP2 具有類似的特性，TIMPs 的作用機制阻止平滑肌細胞向合成型轉變，抑制基質的合成和 VSMC 的遷移。基質的合成降解以及平滑肌的遷移增生取決于 MMPs 和 TIMPs 之間的動態平衡[25]。通常情況下，TIMP1、TIMP2 作為 MMP9 內源性抑制因子可負性調節 MMP9 的活性，本實驗可以看出，TIMP1 在建模后 14 d 出現一個明顯的表達峰值，我們可以推測，正是 MMPs 在建模后第 7～14 d 的表達增殖，觸發了 TIMP1 的反饋抑制，但其反饋抑制能力相對較弱，并不能逆轉只能相對延緩橋靜脈狹窄的過程。
因此，通過本實驗，我們可以初步論證 NGAL 信號通路在靜脈橋血管再狹窄中的作用及機制。一些損傷、應激、缺氧等刺激，導致機體內 IL1、IL6、TNF-α 等炎癥因子表達增加，從而通過 NF-κB 促使 NGAL 的表達量增加，進而增加 NGAL 下游 MMP2、MMP9 等蛋白的表達，增強其蛋白水解活性，從而促進降解細胞外基質的降解，基膜中細胞外基質降解，彈力纖維完整性遭到破壞，平滑肌細胞向內膜遷移，造成靜脈橋血管的狹窄，整個過程受到 TIMP1、TIMP2 的反饋抑制（圖 5）。綜上所述，本文通過研究 NGAL 等因子在橋血管早期再狹窄中的作用，初步明確一條可能的信號通道，從而對橋靜脈的早期再狹窄過程有了新的認識，并希望能為臨床抑制或者延緩橋血管再狹窄提供一個新的思路。
圖1
HE 與 Masson 染色中術前與術后不同時間膠原纖維與肌纖維的分布情況
a：將標本切片進行 HE 染色，細胞核呈藍色，膠原纖維呈淡粉紅色，肌纖維呈亮粉紅色（×100）；b：Masson 染色時膠原纖維呈藍綠色，細胞質、肌纖維和紅細胞呈紅色，細胞核呈藍褐色（×100）；NC：術前對照組靜脈
圖2
NGAL 在狹窄橋血管中的表達情況
a：免疫組織化學染色中，NGAL 在術前與術后 7 d、14 d、30 d 不同時間段的表達變化，棕褐色顆粒為 NGAL 表達；b：建模后中膜層與正常靜脈 NGAL 的表達量比較；*：建模后 14 d 中膜層與正常靜脈 NGAL 的表達量比較，
圖3
MMP2、MMP9 在狹窄橋血管中的表達情況
a：免疫組織化學染色中，MMP2、MMP9 在術前與術后 7 d、14 d、30 d 不同時間段的表達變化；b：建模后與正常靜脈表達量比較，*：建模后 7 d 與正常靜脈表達量比較，
圖4
TIMP1 在狹窄橋血管中的表達情況
a：免疫組織化學染色中，TIMP1 在術前與術后 7 d、14 d、30 d 不同時間段的表達變化；b：建模后 14 d 與正常靜脈表達量比較，*：建模后 14 d 與正常靜脈表達量比較，
圖5
NGAL 信號通路模式圖
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）是一種血管炎性與復雜的多因素疾病病理生理參與的常見病[1]。隨著社會的發展與人們生活水平的提高，CHD 在人群中的發病率逐年增加。冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）已成為心臟外科治療 CHD 的常規手術之一，然而 CABG 術后橋血管通暢率不高[2]、橋血管再狹窄等術后并發癥大大降低了手術效果，也給手術患者帶來很大的困擾與痛苦。因此，CABG 術后橋血管的再狹窄機制成為當前研究的熱點，目前認為血管再狹窄可能與細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）的降解、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖遷移和不良的血管重塑（vascular remodeling，VR）等因素有關[3]。中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associatedlipocalin，NGAL）作為 lipocalin 家族中的一員更多作為一種致炎因子用于急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）等的研究[4]，但近些年有研究表明NGAL 在動脈粥樣硬化、血管狹窄的形成中有特殊意義[5-6]，最近有大量的臨床研究表明，NGAL 與 CHD、心肌梗死的發生與預后有重要的聯系[7-9]。但 NGAL 在心血管中，特別是在 CABG 術后，導致血管狹窄、致炎、血管損傷等方面作用機制還未被闡明。本文通過建立動物模型，模擬一種與人 CABG 術后橋靜脈再狹窄相關的病理過程，探討 NGAL 及其下游的作用因子在靜脈橋血管中表達，從而探索 NGAL 信號通路在動脈粥樣硬化、血管狹窄的形成中可能的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和試劑
健康的普通長白豬 18 只，雌雄不拘，體重 25～30 kg。超薄切片機（RM213 型，Leica 公司，德國），光學顯微鏡（ⅣC TK-870E，Olympus 公司，日本），高清晰度數碼顯微圖像分析系統（Axioplan 2 imaging，Zeiss 公司，德國）；NGAL（AntibodyShop 公司，丹麥）；基質金屬蛋白酶（MMP）9、MMP2、組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）1（Abcam 公司，美國）。
1.2 豬靜脈橋再狹窄模型的建立
根據萬松等[10-11]實驗方式建立豬靜脈橋模型，將實驗對象用鹽酸氯胺酮（20 mg/kg）、阿托品（1 mg）肌肉注射基礎麻醉后，行氣管插管并接麻醉機輔助通氣，再以氯胺酮和苯巴比妥鈉靜脈維持麻醉。局部消毒鋪巾后，取后腿外側切口，長約 8～10 cm，采用“no-touch”技術剝離大隱靜脈，分支以 3-0 絲線結扎，游離其主干長約 10 cm ，離斷后置于合肝素和硝酸甘油的常溫生理鹽水中沖洗并保存備用。然后頸部兩側氣管旁 8～10 cm 距離縱切口，逐層分離頸部肌群，于兩側氣管食管溝內解剖出兩側頸總動脈。離斷動脈前給予肝素鈉 1 mg/kg 靜脈注射，全身肝素化后用 Bulldog 鉗阻斷動脈兩端，預留動脈段約 3 cm，從動脈段中間切斷，斷端一側剪開并斜剪為 45 度，大隱靜脈等分為兩段同樣剪為 45 度，倒轉，然后用 7-0 Prolene 線與兩側頸總動脈進行端端吻合，吻合方式同血管吻合，完畢后開放阻斷鉗，靜脈橋充盈，觸之有搏動，切口常規逐層縫合。復蘇后常規飼養，未使用抗生素和抗凝藥。
1.3 術后分組及標本制備
將動物標本隨機分為建模后 7 d、14 d 和 30 d 共 3 組，每組 6 只，分別于建模后不同時間點，將豬麻醉后，經原頸部切口于氣管食管溝內找到靜脈橋，切斷靜脈橋遠端吻合口動脈端，可見血液噴出，證實靜脈橋通暢，保留兩端動脈約 1 cm，完整取下靜脈橋，10% 中性甲醛固定，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等程序制成蠟塊，切片厚度 5 μm，以未移植前大隱靜脈為對照。
1.4 實驗方法
1.4.1 蘇木素-伊紅（HE）染色與 Masson 染色
通過 HE 染色，石蠟切片脫蠟水化，蘇木素染色 5 min，流水沖洗 10 min，1% 氯化氫脫色，流水沖洗 10 min，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。蘇木素染液為堿性，使細胞核著紫藍色；伊紅為酸性，使細胞質著紅色，通過 Masson 染色法將膠原纖維染成綠色，平滑肌纖維呈紅色。用光鏡觀察靜脈橋內膜、中膜、外膜的變化，以及各層膜中膠原變化和 VSMC 增殖、遷移情況，拍照以做記錄。
1.4.2 免疫組織化學染色
石蠟切片脫蠟水化，過氧化氫消耗過氧化氫酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗 5 min，3 次，枸櫞酸緩沖液水煮抗原修復，山羊血清工作液封閉，分別加入一抗 NGAL、MMP9、MMP2、TIMP1，滴加一抗稀釋液作為陰性參照組，4℃ 孵育過夜，室溫復溫 1 h，PBS 浸洗 5 min，4 次，分別滴加二抗，室溫孵育 15 min，顯微鏡下 DAB 液染色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。染色結果判定標準多參照 Fromowitz 等半定量分級法方法，在高倍鏡下對細胞核內反應作如下評分：① 無著色為 0 分，淡黃色為 1 分，棕黃色為 2 分，棕褐色為 3 分；② 陽性范圍：<5% 為 0 分，5%～25% 為 1 分，26%～50% 為 2 分，51%～75% 為 3 分，>75% 為 4 分。兩項結果相加<2 分為陰性（–），2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為中度陽性（++），6～7 分為強陽性（+++），其中（–）～（+）視為低表達，（++）～（+++）視為過表達。
1.5 統計學分析
所有數據均應用 SPSS11.0 統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（
）表示，組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 HE 染色與 Masson 染色結果
HE 染色，光鏡下觀察，細胞核呈藍色，膠原纖維呈淡粉紅色，肌纖維呈亮粉紅色，與對照組相比，實驗組中靜脈橋血管中膜層膠原基質降解，中膜層肌纖維增生，并向內膜層遷移，建模 14 d 與 7 d 相比，中膜層肌纖維染色明顯，并且向內膜層遷移，建模 30 d 肌纖維層明顯向內膜層遷移，并且中膜層膠原基質降解，彈力纖維層甚至出現斷裂、紊亂現象，由此不難看出，橋血管的狹窄，與中膜層膠原基質降解，肌纖維增生并向內膜遷移有著密切的聯系，膠原基質降解，彈力纖維層被破壞，肌纖維增厚向內膜遷移，從而導致橋血管的再狹窄（圖 1a）。Masson 染色，細胞質、肌纖維和紅細胞呈紅色，細胞核呈藍褐色。建模 14 d 藍色的膠原纖維逐漸被紅色的肌纖維取代，30 d 時紅色肌纖維增多并向內膜層延伸，并且中膜、內膜層細胞排列紊亂，失去原來的血管結構（圖 1b），這與 HE 染色的結果一致。提示本實驗建立橋血管狹窄模型成功。
2.2 免疫組織化學染色結果
2.2.1 NGAL 在橋血管中的表達
正常靜脈中，血管內膜、中膜和外膜 NAGL 表達均呈陰性或弱陽性（圖 2a）；建模 7 d 與正常靜脈相似，無明顯表達；建模后 14 d 與正常靜脈相比，中膜層明顯出現 NGAL 表達（P<0.05），內膜、外膜層未見明顯表達，建模后 30 d 與正常靜脈相比，中膜層 NGAL 的表達量增加（P<0.05），并且有向內膜層遷移的趨勢，而與建模后 14 d 相比，表達量增加不明顯（圖 2b）。由此可以看出，NGAL 參與到血管再狹窄的過程中，最初主要作用于血管中膜層，在建模后 14 d開始出現一個表達高峰，并一直持續到建模后 30 d，并且隨著時間的推移，內膜層也逐漸出現 NGAL 的表達。
2.2.2 MMP9、MMP2 在橋血管中的表達
正常大隱靜脈中 MMP9 幾乎不表達（圖 3a），建模后 7 d 中膜層 MMP9 開始出現陽性表達（P<0.05），與正常靜脈相比，術后 14 d 中膜層陽性表達顯著（P<0.05），并且內膜層也出現陽性表達，建模后 30 d 中膜 MMP9 表達明顯減少。MMP2 也出現類似 MMP9 的表達趨勢，只是表達量相對于 MMP9 較少（圖 3b）。由此可以看出，MMP9 和 MMP2 在建模后 7d 出現明顯表達，在 14 d 后出現表達高峰，此后逐漸減少，30 d 時 MMP9 和 MMP2 表達量已經明顯下降，與正常大隱靜脈無明顯差異。
2.2.3 TIMP1 在橋血管中的表達
本實驗同時檢測不同建模時間后 TIMP1 的表達（圖 4a），可以看出建模后 14 d 的表達量明顯增加，與正常靜脈相比，差異有統計學意義（P<0.05），與 MMP9、MMP2 相比，TIMP1 的表達有相對滯后的趨勢（圖 4b），并且表達量與 MMP9、MMP2 相比也相對較低，考慮可能與 TIMP1 的負性調節有關。
3 討論
有研究[12]表明，基質的降解和 VSMC 的增殖活性改變等血管重塑的發生，參與并促進了血管橋再狹窄的發生過程。本研究發現建模后 7 d 靜脈橋血管中膜層膠原基質開始出現降解，中膜層肌纖維逐漸增生，建模 14 d 后，中膜層肌纖維增生明顯，并且向內膜層遷移，建模 30 d 中膜層膠原基質降解，甚至出現斷裂現象，并且肌纖維層明顯向內膜層遷移，直觀地展現了橋血管發生狹窄的病理過程。
NGAL 最早用于研究急、慢性腎損傷等的病理過程，在腎臟疾病中作為一種是新型標志物運用到臨床中，并且有研究表明 NGAL 在抑制腫瘤細胞粘附、轉移、血管生成等方面具有應用價值[13-14]。近些年 NGAL 逐漸應用到心臟疾病中去，Kafkas 等[5]報道 CHD 患者血清 NGAL 水平與C反應蛋白（CRP）、白細胞數顯著正相關，提示血清中 NGAL 可反映冠狀動脈綜合征患者的炎癥水平，有研究表明，在 CHD 患者血清中 NGAL 的表達量明顯高于正常人，并且 NGAL 在不同冠狀動脈狹窄程度時表達有明顯差異，說明 NGAL 在 CHD 的形成、血管狹窄中發揮作用，NGAL 存在于中性粒細胞中的過氧化物酶陰性顆粒中[15]，NF-κB 的活化能夠促進 NGAL 的表達[16]。各種危險因素、環境、應激的因素，可通過白介素（IL）1、IL6、腫瘤壞死因子（TNF）-α 等炎癥因子的表達，促進核因子-κB（NF-κB）的表達增加，可促使 NGAL 在轉錄水平、蛋白水平升高。本研究顯示，在正常靜脈中 NAGL 無明顯表達；在建立豬狹窄靜脈橋模型后，隨著時間的推移 NGAL 的表達量出現明顯變化，特別是在中膜層，14 d 表達量明顯增加，30 d 后達到一個表達高峰，并有向內膜層遷移的趨勢。此實驗可以直觀看到在橋血管狹窄的急性期 NGAL 的主要作用靶點，并且可以看到在整個急性期內 NGAL 表達趨勢的變化，不難看出，NGAL 在整個橋血管狹窄的發生過程中起促進作用。
NGAL 是在研究 MMP9 時發現的 MMPs 作為 NGAL 的下游因子已被證明是斑塊不穩定的關鍵因素[17-18]，血管斑塊的不穩定性是造成血管粥樣硬化性狹窄的原因之一，研究表明 MMPs 在細胞遷移和基質重塑中發揮作用[19]。
MMP9 主要由中性粒細胞和巨噬細胞合成與分泌，降解血管基膜，促進病理性血管重塑，有研究表明血清 MMP9 的濃度與冠狀動脈狹窄嚴重程度之間有相關性[20]，Kalela 等[21]通過研究糖尿病、高脂血癥等 CHD 的危險因素與 MMP9 的關系，發現 MMP9 與白細胞計數呈顯著正相關，說明 MMP9 作為致炎因子參與血管狹窄的發生。大部分情況下 MMP9 以前體形式（pro-MMP9）分泌，而 NGAL 可與之以二硫鍵為基礎形成異源二聚體 NGAL/pro-MMP9 共同發揮作用[22]。本實驗顯示 MMP9 在建模后也出現類似 NGAL 的表達，建模后 7 d 表達量明顯增加，表達的高峰期出現在建模后 14 d，而建模后 30 d 表達量已經明顯下降，MMP2 與 MMP9 有相似的表達。但是 MMPs 的表達與 NGAL 并不完全同步，考慮可能與 TIMP1 負性調節有關。
有研究[23]表明，TIMP1 的表達沒有對血管的狹窄起直接的作用，而是因為血管壁中 MMPs 的升高所產生的代償反應，所以 TIMP1 相當于一個負性調節因子，在通路中起平衡作用，研究[24]發現 TIMP2 具有類似的特性，TIMPs 的作用機制阻止平滑肌細胞向合成型轉變，抑制基質的合成和 VSMC 的遷移。基質的合成降解以及平滑肌的遷移增生取決于 MMPs 和 TIMPs 之間的動態平衡[25]。通常情況下，TIMP1、TIMP2 作為 MMP9 內源性抑制因子可負性調節 MMP9 的活性，本實驗可以看出，TIMP1 在建模后 14 d 出現一個明顯的表達峰值，我們可以推測，正是 MMPs 在建模后第 7～14 d 的表達增殖，觸發了 TIMP1 的反饋抑制，但其反饋抑制能力相對較弱，并不能逆轉只能相對延緩橋靜脈狹窄的過程。
因此，通過本實驗，我們可以初步論證 NGAL 信號通路在靜脈橋血管再狹窄中的作用及機制。一些損傷、應激、缺氧等刺激，導致機體內 IL1、IL6、TNF-α 等炎癥因子表達增加，從而通過 NF-κB 促使 NGAL 的表達量增加，進而增加 NGAL 下游 MMP2、MMP9 等蛋白的表達，增強其蛋白水解活性，從而促進降解細胞外基質的降解，基膜中細胞外基質降解，彈力纖維完整性遭到破壞，平滑肌細胞向內膜遷移，造成靜脈橋血管的狹窄，整個過程受到 TIMP1、TIMP2 的反饋抑制（圖 5）。綜上所述，本文通過研究 NGAL 等因子在橋血管早期再狹窄中的作用，初步明確一條可能的信號通道，從而對橋靜脈的早期再狹窄過程有了新的認識，并希望能為臨床抑制或者延緩橋血管再狹窄提供一個新的思路。
圖1
HE 與 Masson 染色中術前與術后不同時間膠原纖維與肌纖維的分布情況
a：將標本切片進行 HE 染色，細胞核呈藍色，膠原纖維呈淡粉紅色，肌纖維呈亮粉紅色（×100）；b：Masson 染色時膠原纖維呈藍綠色，細胞質、肌纖維和紅細胞呈紅色，細胞核呈藍褐色（×100）；NC：術前對照組靜脈
圖2
NGAL 在狹窄橋血管中的表達情況
a：免疫組織化學染色中，NGAL 在術前與術后 7 d、14 d、30 d 不同時間段的表達變化，棕褐色顆粒為 NGAL 表達；b：建模后中膜層與正常靜脈 NGAL 的表達量比較；*：建模后 14 d 中膜層與正常靜脈 NGAL 的表達量比較，
圖3
MMP2、MMP9 在狹窄橋血管中的表達情況
a：免疫組織化學染色中，MMP2、MMP9 在術前與術后 7 d、14 d、30 d 不同時間段的表達變化；b：建模后與正常靜脈表達量比較，*：建模后 7 d 與正常靜脈表達量比較，
圖4
TIMP1 在狹窄橋血管中的表達情況
a：免疫組織化學染色中，TIMP1 在術前與術后 7 d、14 d、30 d 不同時間段的表達變化；b：建模后 14 d 與正常靜脈表達量比較，*：建模后 14 d 與正常靜脈表達量比較，
圖5
NGAL 信號通路模式圖
