引用本文： 周新剛, 倪立新, 遲超, 劉宏宇, 姚野. 乳鼠心肌細胞下腔靜脈壁移植模型的建立. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(3): 233-236. doi: 10.7507/1007-4848.201612050 復制
急性心肌梗死、心肌病、風濕性心臟病等都會導致心肌損傷，使其具有完整舒縮功能的心肌細胞數量相對或絕對減少，而成熟個體的心肌細胞屬于終末分化細胞，其增殖能力極其低下，一旦損傷只能由疤痕組織代替，未受損的心肌細胞肥大以部分代償失去的心肌功能，最終將發展成充血性心力衰竭，嚴重威脅著人類生存和生活質量。
因此，增加具有完整收縮功能的心肌細胞數目，是有效治療心肌損傷的關鍵。采用細胞移植改善心臟結構和功能的研究已成為研究熱點[1-8]。
移植到心臟內的細胞成熟和分化受機械性刺激、神經因子和激素作用以及周圍心肌細胞的影響。將未成熟心肌細胞移植于心臟外的部位可以獲得心肌細胞在心臟以外環境生長、分化情況。以往的動物實驗研究中，心肌細胞被移植到耳部[9]、骨骼肌[10]、皮下結締組織、眼內及心臟等部位[11]，最近國外學者研究表明將乳鼠心肌細胞移植于正常的動、靜脈壁[12-14]。但關于非成熟心肌細胞移植到心臟外血管后的生長、成熟和收縮等的資料很少，此類研究國內尚未見報道。因此，我們首先建立了乳鼠心肌細胞下腔靜脈壁移植的模型并進行相關的研究。
1 材料與方法
1.1 動物和分組
采用健康、雌性、近交系 F344 大鼠 12 只（150±20）g 和生后 2 d 乳鼠。種鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司并由哈爾濱醫科大學附屬第一醫院動物實驗中心協助飼養、繁殖。將雌性大鼠隨機分為 A、B 兩組，每組各 6 只。A 組為乳鼠心肌細胞移植組；B 組為注射細胞培養液的對照組。凡因手術死亡或發生感染等并發癥者均排除在此次實驗分組以外。
1.2 動物模型的建立
按照 Dai 等[13]實驗方法建立乳鼠心肌細胞下腔靜脈壁移植的模型。
1.2.1 心肌細胞的分離和培養
在無菌的條件下，將獲取的出生后 2 d 的 F344 乳鼠心臟去除大血管和結締組織后剪成 1 mm3的小塊，加入 0.25 mg/ml 的胰酶中消化。分離獲得的細胞在 37℃、體積分數 5%CO2 的培養箱中孵育 1 h 差速貼壁純化后，輕輕吸出細胞懸液以 4×105/ml 的密度接種于 100 mm 培養皿中，置 37℃、體積分數 5%CO2 及 95% 空氣的培養箱中培養 1～2 d。
1.2.2 乳鼠心肌細胞下腔靜脈壁移植的手術過程
將成年雌性 F344 大鼠稱重后用 10% 的水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉生效后置仰臥位。腹部刮毛并常規消毒、鋪孔巾。腹部正中切口切開，將小腸塞到腹腔右側后顯露下腔靜脈。選取腎靜脈匯入處以下 3 mm 處為注射點，游離該處靜脈周圍的筋膜，然后將不含或含乳鼠心肌細胞（5×106細胞/只）的細胞培養液按下述方法分別注射至 A、B 兩組大鼠（n=6）的下腔靜脈壁。
在解剖顯微鏡下，用 28 號針頭的胰島素注射器，將大約 150 μl 的含有或不含心肌細胞的帶有甲基纖維素基質的 Iscove’s Modified Dulbecco’s Media（Stemcell Technologies Inc）直接注射到下腔靜脈的外壁，在下腔靜脈周圍形成長約 2～3 mm、高約 2 mm 的均勻、一致的環。注射完成后逐層縫合腹部切口，無菌輔料覆蓋。
1.3 移植心肌細胞收縮性評估和組織標本的獲取和組織學檢測
在術后第 21 d，水合氯醛麻醉生效后經腹部切口重新顯露下腔靜脈并仔細游離心肌細胞或培養液植入的部位。經靜脈注射肝素（300 U/kg）后，對移植到靜脈壁的心肌細胞在受體大鼠主動脈夾閉前后的自主搏動情況進行檢測并錄像記錄，記數移植心肌的自主搏動率（次/分）。
對收縮性進行評估后，然后獲取心肌細胞移植段的下腔靜脈和對照組下腔靜脈標本，生理鹽水沖洗后用 40 g/L 多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成 5 μm 切片，常規脫蠟至水，行 HE 染色，光鏡下觀察移植后的心肌細胞和下腔靜脈外膜的組織形態學變化。
1.4 統計學分析
所有結果用均數±標準差（
）表示，所有資料采用 t 檢驗，并進行 Spearman 相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 移植心肌細胞的收縮性
在水合氯醛麻醉后，通過主動脈的搏動來記數受體大鼠的心率（a）為（172±21）次/分。下腔靜脈細胞移植處節律性搏動（b）明顯，為（141±47）次/分，與a的差異有統計學意義（P=0.03）。下腔靜脈在主動脈夾閉后 1～3 min 仍能自主地節律性搏動，搏動節律（c）為（88±44）次/分，與主動脈夾閉前搏動節律的差異有統計學意義（P=0.000 5）。三者之間成正相關（表 1）。
表1
大鼠的心率（a）、節律性搏動（b）和搏動節律（c）的相關性分析
2.2 組織學檢查
HE 染色顯示術后 3 周時 6 只接受心肌細胞移植的大鼠下腔靜脈壁周圍可見心肌組織（圖 1箭頭所示），而 6 只只注射了培養液的對照組大鼠下腔靜脈壁周圍卻沒有（圖 2）。移植的乳鼠心肌細胞在受體內行形成致密的沿血管長軸方向排列的心肌束，這些心肌束呈環形平行于靜脈壁。所有樣本移植部位的靜脈壁均正常。
圖1
光學顯微鏡下接受心肌細胞注射的實驗組大鼠的下腔靜脈 ×4
圖中黑色箭頭指示為下腔靜脈周圍的心肌細胞層
圖2
光學顯微鏡下只接受培養液注射的對照組大鼠的下腔靜脈 ×4
3 討論
將乳鼠心肌細胞移植到受體大鼠心臟以外的組織中可以更好地了解心肌細胞在不受心臟機械性刺激、神經因子和激素作用以及周圍心肌細胞影響的情況下心肌細胞的生長、成熟和收縮情況，為在體外利用組織工程技術構建心肌組織提供有用的經驗。
2007 年 Dai 等[12]首次成功將乳鼠心肌細胞被移植到 Wister 大鼠的下腔靜脈壁并對移植后的心肌細胞的生長及收縮進行相關研究。而本研究為國內首次完成將乳鼠心肌細胞移植到受體大鼠的下腔靜脈壁，并證實乳鼠心肌細胞在該處能夠很好地生長、成熟，形成致密的沿血管長軸方向排列的心肌束，這些心肌束呈環形平行于靜脈壁，具有自主的節律性收縮功能。與 Dai 等[13]的研究結果相同。2016 年 Biermann 等[14]為改善單心室患者術后的遠期效果而進行的將新鮮分離的乳鼠心肌細胞移植到成年雄性 Wister 大鼠的上腔靜脈周圍的研究得到類似的結果。此外罕見類似的研究報道。
在本研究中，我們發現移植心肌細胞在主動脈夾閉前、后的自主搏動與受體大鼠的心率成正相關，表明移植心肌細胞的搏動在一定程度上受受體大鼠的體內環境因素影響，為我們以后將組織工程構建的心肌組織移植到受體并為受體提供盡可能接近同步于受體心率的心臟外血液驅動力提供了依據。
另外，由于下腔靜脈周圍為疏松結締組織，其周圍空間可經后腹膜向腹腔擴展，在該處心肌細胞移植的成功為以后將體外構建的組織工程心肌植入體內以及在體內利用組織工程技術構建心肌組織并進行相關在體研究提供了一種新的選擇。
當然，由于類似的研究資料還很少，我們還需要進一步研究以提高心肌種子細胞的存活率，并對移植后的心肌細胞對受體心臟的電生理影響及整個機體的病理生理影響等方面進一步研究，使其能夠在對嚴重威脅著人類生存和生活質量的心臟疾病治療中發揮更大的作用。
急性心肌梗死、心肌病、風濕性心臟病等都會導致心肌損傷，使其具有完整舒縮功能的心肌細胞數量相對或絕對減少，而成熟個體的心肌細胞屬于終末分化細胞，其增殖能力極其低下，一旦損傷只能由疤痕組織代替，未受損的心肌細胞肥大以部分代償失去的心肌功能，最終將發展成充血性心力衰竭，嚴重威脅著人類生存和生活質量。
因此，增加具有完整收縮功能的心肌細胞數目，是有效治療心肌損傷的關鍵。采用細胞移植改善心臟結構和功能的研究已成為研究熱點[1-8]。
移植到心臟內的細胞成熟和分化受機械性刺激、神經因子和激素作用以及周圍心肌細胞的影響。將未成熟心肌細胞移植于心臟外的部位可以獲得心肌細胞在心臟以外環境生長、分化情況。以往的動物實驗研究中，心肌細胞被移植到耳部[9]、骨骼肌[10]、皮下結締組織、眼內及心臟等部位[11]，最近國外學者研究表明將乳鼠心肌細胞移植于正常的動、靜脈壁[12-14]。但關于非成熟心肌細胞移植到心臟外血管后的生長、成熟和收縮等的資料很少，此類研究國內尚未見報道。因此，我們首先建立了乳鼠心肌細胞下腔靜脈壁移植的模型并進行相關的研究。
1 材料與方法
1.1 動物和分組
采用健康、雌性、近交系 F344 大鼠 12 只（150±20）g 和生后 2 d 乳鼠。種鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司并由哈爾濱醫科大學附屬第一醫院動物實驗中心協助飼養、繁殖。將雌性大鼠隨機分為 A、B 兩組，每組各 6 只。A 組為乳鼠心肌細胞移植組；B 組為注射細胞培養液的對照組。凡因手術死亡或發生感染等并發癥者均排除在此次實驗分組以外。
1.2 動物模型的建立
按照 Dai 等[13]實驗方法建立乳鼠心肌細胞下腔靜脈壁移植的模型。
1.2.1 心肌細胞的分離和培養
在無菌的條件下，將獲取的出生后 2 d 的 F344 乳鼠心臟去除大血管和結締組織后剪成 1 mm3的小塊，加入 0.25 mg/ml 的胰酶中消化。分離獲得的細胞在 37℃、體積分數 5%CO2 的培養箱中孵育 1 h 差速貼壁純化后，輕輕吸出細胞懸液以 4×105/ml 的密度接種于 100 mm 培養皿中，置 37℃、體積分數 5%CO2 及 95% 空氣的培養箱中培養 1～2 d。
1.2.2 乳鼠心肌細胞下腔靜脈壁移植的手術過程
將成年雌性 F344 大鼠稱重后用 10% 的水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉生效后置仰臥位。腹部刮毛并常規消毒、鋪孔巾。腹部正中切口切開，將小腸塞到腹腔右側后顯露下腔靜脈。選取腎靜脈匯入處以下 3 mm 處為注射點，游離該處靜脈周圍的筋膜，然后將不含或含乳鼠心肌細胞（5×106細胞/只）的細胞培養液按下述方法分別注射至 A、B 兩組大鼠（n=6）的下腔靜脈壁。
在解剖顯微鏡下，用 28 號針頭的胰島素注射器，將大約 150 μl 的含有或不含心肌細胞的帶有甲基纖維素基質的 Iscove’s Modified Dulbecco’s Media（Stemcell Technologies Inc）直接注射到下腔靜脈的外壁，在下腔靜脈周圍形成長約 2～3 mm、高約 2 mm 的均勻、一致的環。注射完成后逐層縫合腹部切口，無菌輔料覆蓋。
1.3 移植心肌細胞收縮性評估和組織標本的獲取和組織學檢測
在術后第 21 d，水合氯醛麻醉生效后經腹部切口重新顯露下腔靜脈并仔細游離心肌細胞或培養液植入的部位。經靜脈注射肝素（300 U/kg）后，對移植到靜脈壁的心肌細胞在受體大鼠主動脈夾閉前后的自主搏動情況進行檢測并錄像記錄，記數移植心肌的自主搏動率（次/分）。
對收縮性進行評估后，然后獲取心肌細胞移植段的下腔靜脈和對照組下腔靜脈標本，生理鹽水沖洗后用 40 g/L 多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成 5 μm 切片，常規脫蠟至水，行 HE 染色，光鏡下觀察移植后的心肌細胞和下腔靜脈外膜的組織形態學變化。
1.4 統計學分析
所有結果用均數±標準差（
）表示，所有資料采用 t 檢驗，并進行 Spearman 相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 移植心肌細胞的收縮性
在水合氯醛麻醉后，通過主動脈的搏動來記數受體大鼠的心率（a）為（172±21）次/分。下腔靜脈細胞移植處節律性搏動（b）明顯，為（141±47）次/分，與a的差異有統計學意義（P=0.03）。下腔靜脈在主動脈夾閉后 1～3 min 仍能自主地節律性搏動，搏動節律（c）為（88±44）次/分，與主動脈夾閉前搏動節律的差異有統計學意義（P=0.000 5）。三者之間成正相關（表 1）。
表1
大鼠的心率（a）、節律性搏動（b）和搏動節律（c）的相關性分析
2.2 組織學檢查
HE 染色顯示術后 3 周時 6 只接受心肌細胞移植的大鼠下腔靜脈壁周圍可見心肌組織（圖 1箭頭所示），而 6 只只注射了培養液的對照組大鼠下腔靜脈壁周圍卻沒有（圖 2）。移植的乳鼠心肌細胞在受體內行形成致密的沿血管長軸方向排列的心肌束，這些心肌束呈環形平行于靜脈壁。所有樣本移植部位的靜脈壁均正常。
圖1
光學顯微鏡下接受心肌細胞注射的實驗組大鼠的下腔靜脈 ×4
圖中黑色箭頭指示為下腔靜脈周圍的心肌細胞層
圖2
光學顯微鏡下只接受培養液注射的對照組大鼠的下腔靜脈 ×4
3 討論
將乳鼠心肌細胞移植到受體大鼠心臟以外的組織中可以更好地了解心肌細胞在不受心臟機械性刺激、神經因子和激素作用以及周圍心肌細胞影響的情況下心肌細胞的生長、成熟和收縮情況，為在體外利用組織工程技術構建心肌組織提供有用的經驗。
2007 年 Dai 等[12]首次成功將乳鼠心肌細胞被移植到 Wister 大鼠的下腔靜脈壁并對移植后的心肌細胞的生長及收縮進行相關研究。而本研究為國內首次完成將乳鼠心肌細胞移植到受體大鼠的下腔靜脈壁，并證實乳鼠心肌細胞在該處能夠很好地生長、成熟，形成致密的沿血管長軸方向排列的心肌束，這些心肌束呈環形平行于靜脈壁，具有自主的節律性收縮功能。與 Dai 等[13]的研究結果相同。2016 年 Biermann 等[14]為改善單心室患者術后的遠期效果而進行的將新鮮分離的乳鼠心肌細胞移植到成年雄性 Wister 大鼠的上腔靜脈周圍的研究得到類似的結果。此外罕見類似的研究報道。
在本研究中，我們發現移植心肌細胞在主動脈夾閉前、后的自主搏動與受體大鼠的心率成正相關，表明移植心肌細胞的搏動在一定程度上受受體大鼠的體內環境因素影響，為我們以后將組織工程構建的心肌組織移植到受體并為受體提供盡可能接近同步于受體心率的心臟外血液驅動力提供了依據。
另外，由于下腔靜脈周圍為疏松結締組織，其周圍空間可經后腹膜向腹腔擴展，在該處心肌細胞移植的成功為以后將體外構建的組織工程心肌植入體內以及在體內利用組織工程技術構建心肌組織并進行相關在體研究提供了一種新的選擇。
當然，由于類似的研究資料還很少，我們還需要進一步研究以提高心肌種子細胞的存活率，并對移植后的心肌細胞對受體心臟的電生理影響及整個機體的病理生理影響等方面進一步研究，使其能夠在對嚴重威脅著人類生存和生活質量的心臟疾病治療中發揮更大的作用。
