隨著分子和細胞心臟病學知識的進展，基因治療在心臟疾病治療中的應用已經成為研究的熱點和方向，很多預臨床試驗都已經取得了一定成功，而且規定了超聲介導基因轉染（ultrasound-mediated gene delivery，UMGD）的基本原則。但是，其應用在人體疾病治療中存在多重障礙。隨著微泡技術的發展和轉染多種基因能力的增強，UMGD 在未來可能成為心血管疾病基因治療的一種有效的非侵入性技術。本文就超聲介導基因轉染在心血管疾病治療應用中的基本原則、應用和對未來的展望與不足作一綜述。
引用本文： 覃雄海, 康凱, 孫露, 田海, 蔣樹林. 超聲微泡介導基因轉染在心血管疾病治療中的研究現狀及展望. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(3): 256-261. doi: 10.7507/1007-4848.201612044 復制
隨著經濟的快速發展和生活方式的改變，全球心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的發病率和死亡率逐年增加。盡管預防措施、診斷實驗、藥物治療、介入治療和外科手術治療已經取得了實質性的進展，在北美洲和全世界范圍內，CVD 仍然是疾病發病率和死亡率的主要因素，每年大概有 17.3 百萬人死于心血管疾病，而這個數字至 2030 年將會迅速增長至 26.3 百萬人[1-2]。近年來，中國心血管疾病的發病率也在持續增加。因此，我們需要在傳統治療方法的基礎上克服當前 CVD 治療措施的局限性。
基因治療是指將外源性正常基因導入靶細胞，以糾正或者補償因基因缺陷和異常引起的疾病，從而達到治療目的。基因治療不僅能夠在分子水平上改變細胞的結構和功能，還能夠直接靶向干預細胞內信號通路，從分子水平調整細胞功能，這使其成為 CVD 的治療和預防的一個極具前景的有力措施，因而受到廣泛關注[3-5]。其中，超聲介導基因轉染（ultrasound-mediated gene delivery，UMGD）因其非侵入性，精確的靶向性，良好的安全性以及能夠按需轉染多基因和多重基因等優勢而備受矚目。本文將就 UMGD 在 CVD 治療中的基本原則、應用和對未來的展望與不足做一綜述。
1 超聲靶向微泡破壞是超聲介導基因轉染的基本機制
超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是指利用超聲波和攜帶靶基因的微泡來實現靶向基因的轉染，目前已經成為 UMGD 的熱點技術。第一次引入超聲波能量來促進基因在體內轉染的試驗是在 19 世紀 20 年代末。最近，新型超聲微泡造影劑的出現進一步提高了空化效應和在體外裸 DNA 轉染轉基因的表達。在 2000 年，Shohet 等[6]第一次展示了 UTMD 用于基因轉染的研究。此后，越來越多的研究傾向于研究 UTMD 的基本機制和探索其在體內試驗中轉染的最優化方法。近年來，隨著超聲靶向微泡破壞造影劑和攜帶核酸基因的微泡等技術的發展，很多 CVD 的預臨床模型已經開始利用攜帶治療基因的微泡完成基因和藥物轉染[7-11]。
1.1 超聲靶向微泡破壞概念的回顧
UTMD 攜帶藥物或基因的超聲微泡造影劑到達靶向組織時，利用高機械指數的超聲輻照破壞微泡，使微泡攜帶的藥物或治療基因在靶向組織中釋放，從而達到對疾病病變部位的靶向治療。在 CVD 的基因治療中，經直接的心肌內注射轉染用藥僅僅在注射部位的局部小區域有效，而經冠狀動脈內或動脈內轉染時就會受到等離子體脫氧核糖核酸酶（DNA 酶）的快速清除。所以當前基因治療的研究主要是集中在開展能提高轉染有效性和達到持續的轉基因表達，且以一種最佳、最安全的方式靶向轉導治療基因。選擇 UTMD 的微泡元素主要考慮通過提高空化效應來提高超聲波的生物學效應和增加基因轉染的有效率，且通過內源性 DNA 核酸內切酶來防止基因的退化和延長其循環半衰期。通過超聲聯合微泡造影劑介導基因轉移能夠提高靶向性，從而顯著提高目的基因的轉染率和表達，同時，也增加了其靶向器官的高特異性和脫靶副作用的安全性。
1.1.1 超聲空化效應的概念
基因轉染的前提是能夠改變細胞膜的通透性，超聲產生的空化效應（cavitation effect）和機械效應通過改變細胞膜的通透性來增加基因的轉染。Bazan-Peregrino 等[12]的研究表明空化效應通過增加毛細血管內皮細胞間隙的寬度和細胞膜的通透性來使微泡或基因能夠進入血管壁及組織間隙，進而發揮靶向治療作用。空化效應是一種物理學效應，是一種物理現象，是指液體中的微小氣泡在超聲波的作用下向血管壁移動，先后在超聲作用下發生震蕩、膨脹、收縮及內爆等的動力學過程，伴瞬間釋放出瞬態高壓、高溫、放電等氣泡內的多種能量的行為[13-14]。其分為穩態空化和瞬態空化[15]。前者指超聲微泡在低聲壓下產生壓縮和膨脹的時候不發生破裂，而是通過做非線性振蕩活動的振動過程引發的輻射壓力和微射流而影響周圍細胞等產生的生物學效應。后者是一種強烈的生物學效應，指的是超聲微泡在高聲壓下發生急劇膨脹和收縮后出現微泡破裂，瞬間釋放出聲能，同時產生巨大的瞬時壓力和強烈的沖擊波及微射流會在周圍空間內形成高溫、高壓環境，造成細胞結構和功能的改變的同時會出現微生物和機體的損傷和破壞[16]，但在增強基因轉染時亦會引起細胞死亡、凋亡等不良后果。
1.1.2 超聲空化效應的影響因素
超聲波超聲空化效應的強弱與聲學參數以及液體的物理化學性質有關，超聲轉染效率受超聲頻率、聲壓、聲功率、輻照時間、占空比、微泡的量等多種因素協同作用影響[17]。（1）隨著超聲波頻率的降低，微泡在液體中的空化效應增大，反之隨著頻率的升高，會使產生超聲空化效應所需要的聲強就會越大，空化效應越難以發生。（2）占空比是是指整個脈沖信號一個周期之內所占的時間比率。占空比越高，空化行為越劇烈，明顯影響空化效應[18]。（3）有研究表明聲壓幅值越大、空化泡數量越多，空化效應越高。總的來說，各因素之間是互相聯系的。控制不一樣的變量會得出不一致的結果。劉珊[19]的研究表明了當總輻照劑量和聲功率相同時，占空比的大小能明顯影響空化效應強度；當總輻照劑量和輻照時間相同時，聲功率的高低可影響空化效應強度。通過調節高強度聚集超聲（HIFU）占空比和聲功率，改變靶區空化效應強度，從而影響組織損傷體積。由此可見，影響空化效應的各個因素之間是互相影響卻又不可分離的重要組成部分。
1.2 微泡造影劑
靶向超聲造影劑是由具有生物兼容性的高分子材料包裹微泡而成的，通過連接微泡表面的特異性配體或抗體，與靶組織或靶器官相應的受體相結合而實現靶向特異性的超聲造影劑[20]。靶向超聲造影劑使超聲醫學由器官組織的解剖學成像逐步深入到功能性成像，具有廣闊的應用前景。UTMD 的微泡有很多相似的商業化可利用的超聲增強造影劑，這些造影劑主要用于超聲心動圖和醫學超聲成像[21]。1968 年，Gramiak等[22]首次報道了注射鹽水溶液后能增強人體心室與動脈的超聲回波信號，從此超聲造影劑逐漸應用于臨床實踐中。目前超聲造影劑有 Definity（2001）、Sonovue（2001）、Luminty（2006）、Sonazoid（2007）、Lumason（2014）。微泡的主要組成是微氣泡，主要以氟化碳或者六氟化硫等惰性高分子質量氣體填充滿全。因為這些惰性高分子氣體在血液中具有低溶解性和高保留性，這使微泡具有高的穩定性和維持體循環系統中的持久性[21]。微泡的直徑大小比紅細胞的直徑小，使其在靜脈注射后能夠暢通無阻地穿過微血管結構達到循環系統。很多臨床試驗證實微泡沒有肝毒性或者腎毒性，有時僅有少量的、輕度短暫的不良反應，因此安全性良好。所以，超聲微泡造影劑在靶向血栓和藥物或基因轉染治療應用中的潛能是一個令人激動的領域。
目前，特異性配體與靶向超聲造影劑外殼包膜連接的的方法主要有以下兩種：（1）生物素-親和素法，也就是非吸附性非共價鍵結合的免疫化學固定方法，在不改變生物活性和生理特征的同時能夠將其生物化，比較適用在基礎性實驗研究中。（2）直接化學連接法，能夠得到具有穩定粘附配體的造影劑，適用于比如藥物、基因或多肽等小分子配體。靶向造影劑不僅能夠對靶點的特異性顯影來精確定位病灶，而且降低了其毒性等不良反應、提高對疾病的早期診斷和實現基因在體內無創性靶向運輸、定點釋放以及基因的轉染[23-25]。
1.3 超聲靶向微泡破壞的基因或核酸載體
UTMD 的基因或核酸載體分為病毒性和非病毒性載體。Shohet 等[26]第一次報道了關于 UTMD 的病毒載體在體內基因治療的試驗，該實驗利用一個載有 β-半乳糖苷酶基因的腺病毒載體成功地完成 UTMD 在心肌中的基因轉染。與全身系統性的腺病毒載體轉導相比，UTMD 既能夠通過靶向超聲轉染提供更好的定位特異性，也可通過提高細胞膜的通透性以穿過內皮細胞的屏障。
與病毒載體相比，非病毒載體有以下優點，如低免疫原性、低費用和低系統毒性。反義寡脫氧核糖核苷酸類（ODNs）等非病毒性載體已經被用在 UTMD 中，通過靶向基因提高在心血管疾病 mRNA 水平的治療效果，提高了心肌缺血和再灌注中的腫瘤壞死因子 α 的水平。微泡造影劑作為一種無創性載體攜帶質粒，克服了 ODNs 的轉染僅僅在短時間封鎖的轉錄水平才有效的局限性和 siRNAs 存在短期阻塞的缺點，在超聲介導下可顯著提高細胞基因轉染率和細胞生存率。質粒 DNA 的高特異性、高敏感性、瞬時表達水平、低耗費和低免疫原性等特性使其成為 UTMD 研究的首選載體。但是質粒載體在體內存活時間相對較短，且只有適度的轉染效率，因此研究者們開始研究探索沒有傳統的質粒中經常發現細菌的支柱和耐藥性元素[27]的微環載體。
1.4 最優化超聲靶向破壞微泡實現轉染
最優化參數研究因素包括超聲波能量、機械指數、聲壓峰值、超聲轉染脈沖或觸發間隔、超聲頻率和微泡類型等。2003 年，Bekeredjian 等[28]的研究系統說明了最優化 UTMD 的效率時，既要考慮相關的超聲參數，也要考慮非超聲參數，比如微泡組成和基因載體的連接方式。存在很多影響 UTMD 最優間隔的因素，包括 DNA 劑量、微泡濃度、靶向組織類型、注射方式（經靜脈內注射和動脈內注射）。另外，超聲束的寬度也是影響靶向轉染效率的參數之一，決定著 UTMD 的靶向區域。
2 超聲介導基因轉染在心血管疾病治療的應用
2.1 超聲介導基因轉染在缺血性心肌病治療的應用
2.1.1 通過增加血管密度治療缺血性心肌病
UMGD 在 CVD 臨床前模型的治療中取得了較理想的結果。目前，在大部分心肌缺血或者心肌梗死模型的研究中證實，UMGD 通過靶向基因轉染促進了新生血管生成。2004 年，Kondo 等[29]最早開展了通過超聲介導的基因轉染到心肌內的功能基因治療。此研究通過 UMGD 攜帶編碼人類肝細胞生長因子基因的質粒，對在 2 h 內進行冠狀動脈結扎的急性心肌梗死模型進行轉染。結果表明，肝細胞生長因子基因療法增加了梗死區域動脈和毛細血管密度，減小了疤痕面積和間質性纖維化，預防了心肌梗死后不良的左室重塑。2009 年，Fujii 等[30]研究了 UMGD 編碼干細胞因子和血管內皮生長因子的質粒在小鼠的心肌梗死模型上的影響。說明了血管內皮生長因子和干細胞因子的基因治療均能增加缺血性心肌病的血管內皮生長因子受體 2 和酪氨酸激酶受體（c-kit）陽性祖細胞群的數量，增加了小動脈與毛細血管的密度和心肌灌注量。2011 年，同一個研究隊伍驗證了重復使用（1 次、3 次或者 6 次）基質細胞衍生因子基因在一個大鼠心肌梗死模型中的治療效果[31]。結果表明重復 UMGD 能夠很大程度增加了血管密度，減少了梗死面積，改善左室收縮功能和提高治療效果，說明了 UTMD 的重復暴露增加了大鼠梗死心肌的血管生成，但沒有引起心肌損害，表明質粒 DNA 能夠通過 UMGD 的可重復性來延長了基因表達的壽命。曹治寰等[32]構建心肌梗死模型后使用免疫組織化學檢測心肌血管新生效應來檢測比較陽離子微泡與聲諾維微泡在體外的基因攜帶效率。他們的研究結果表明超聲靶向破壞陽離子微泡介導基因轉染能夠提高體內和體外的基因轉染效率，通過提高梗死心肌的新生血管密度來改善心臟功能。崔晶晶等[33]為了探索能夠改善基因轉染效率的方法，通過超聲靶向微泡破壞微泡介導由 UTMD 和核定位信號（nuclear localization signal，NLS）聯合構建的親核型基因載體至 48 只雄性成年雜種犬中，進而觀察轉染效率。他們發現了 UTMD 與 NLS 肽構建的親核型基因載體有效提高了轉染效率，同時能夠增加新生毛細血管的密度，降低了心肌梗死后瘢痕組織的面積和纖維化程度，從而改善心功能。國內外的這些研究提示了從增加新生毛細血管密度的方向來治療缺血性心臟病，是缺血性心臟病的基因治療的又一突破。
2.1.2 通過誘導干細胞心肌的歸巢治療缺血性心臟病
鄧傾的研究[34]使用陽離子微泡為載體和相對優化的超聲福照參數來進行基質衍生因子 1（SDF-1a）基因轉染治療心肌梗死。結果發現超聲和微泡聯合后基因傳遞的效率比單純超聲的基因傳遞顯著增高，表明超聲介導基因轉染的安全性和有效性。同時也發現了聯合核定位基序的基因轉染效率顯著高于無核定位基序的基因轉染效率，促進基因轉染治療心肌梗死。Cui 等[35]和 Kokhuis 等[36]的研究也表明微泡可以協同增加心肌細胞的歸巢，增加了心肌缺血后心肌數目，促進心肌梗死后損傷血管的修復及再生。李露的研究[37]表明了超聲微泡可以上調 SDF-1/CXC 趨化因子受體 4（CXCR4），促進骨髓間充質干細胞（MSCs）遷移歸巢到缺血心肌中，提高了血管內皮生長因子（VEGF）和肝細胞生長因子（HGF）的表達，通過提高新生血管的密度來修復缺血心肌和改善心功能。由此可見，干細胞能夠修復心肌和改善心功能的主要機制是心肌血管的新生；超聲靶向微泡介導基因轉染確能顯著提高基因轉染的效率，增加基因表達的釋放和誘導干細胞心肌的歸巢，是一條可以通過內源性干細胞治療心肌梗死安全有效的新途徑。
2.2 超聲介導基因轉染在治療阿霉素性心肌病的應用
UMGD 不僅能夠轉染到血管內皮細胞，也能夠靶向其他細胞類型。Sun 等[38]將攜帶 AKT 基因的自制陽離子微泡應用在治療急性心肌梗死大鼠中，發現其在增加血管密度、減小梗死面積、減少細胞凋亡及改善心臟功能方面明顯優于 Definity 微泡組。近些年來，由于抗生素的過度應用和泛濫，阿霉素性心肌病患者越來越多。Lee 等[39]利用阿霉素介導轉染的大鼠心肌病模型，在心肌病誘導 3 個星期后，通過 UMGD 傳遞攜帶抗凋亡基因生存素的質粒。結果顯示在心肌細胞和內皮細胞中同樣可以成功轉染，這說明 UMGD 的生存素基因療法會減弱左室收縮功能障礙和減少間質纖維化，減少肌細胞凋亡和防止適應不良的左室重構。此研究說明 UMGD 轉染靶細胞的廣泛性，并顯示了 UMGD 治療缺血性心肌病的潛能。Chen 等[40]在一個非缺血性阿霉素性心肌病的大鼠模型中，使用 UMGD 編碼 GLP-1 基因背負式運輸轉座子質粒進行轉染，發現 UMGD-GLP-1 基因治療能恢復左室功能，使左室收縮功能參數和左室后壁直徑恢復接近于正常值，也發現與刺激心肌再生的標記物相關，因此得出了心肌內 GLP-1 基因的轉染能夠通過刺激心肌細胞再生逆轉治療阿霉素性心肌病的結論。目前很多研究都提示心肌病是一種多基因疾病，我們需要增加 UMGD 治療阿霉素性心臟病的研究，因為基因治療是治療心肌病的根本方法，除此之外，我們還應該減少抗生素的不必要應用，從源頭降低阿霉素性心肌病的發生率，預防與治療結合為一體。
2.3 超聲介導基因轉染在治療動脈粥樣硬化性心臟病的應用
冠狀動脈微栓塞是急性冠狀動脈綜合征等血栓習慣疾病治療過程中發生的因粥樣硬化性板塊脫落引起的常見棘手的并發癥，常常出現遠期預后不良和心臟不良事件，是臨床急需解決的難題之一，受到了臨床醫生的廣泛關注。經皮冠狀動脈介入治療過程中由于粥樣硬化斑塊碎屑的脫落引起的遠端微血管栓塞很棘手[41-42]。Wang 等[43]的研究表明了組織因子途徑抑制物 2（TFPI-2）在抑制血管栓塞和動脈硬化方面發揮著重要作用。他們的研究表明 UTMD 能夠轉染 TFPI-2 基因至靶器官，且腺病毒基因轉染有更高的基因轉染效率，同時對血管壁造成的損傷更小。蘇強的研究[44]發現超聲微泡靶向轉染技術能夠成功轉染 microRNA-21 至心肌細胞中，實現轉染基因的有效表達，通過抑制 PDCD4/NF-KB/TNF-a 信號轉導通路和減少心肌炎癥反應來改善心臟功能。
最近有研究表明 UMGD 的 mi RNA-21 質粒在豬冠狀動脈微栓塞的模型已經被完成[41]，顯著地降低了凋亡相關蛋白 4 抗體的表達與核轉錄因子-kappaB 的活性，提高了心臟功能。他們發現在適當的條件下，UMGD 都能夠有效地提高基因在豬心臟的表達。
目前藥物治療動脈粥樣硬化性心臟病已經成為一種常見的治療方案，關于基因治療動脈粥樣硬化性心臟病的應用依舊較少，但超聲微泡介導基因轉染是治療動脈粥樣硬化性心臟病的無創、有效、高效、安全的方法。
2.4 與心血管疾病治療相關的超聲介導基因轉染的其他應用
UMGD 除了應用在心肌缺血或者心肌梗死等心血管疾病的治療外，也應用于與 CVD 相關的其他疾病的治療中。其中的兩個主要領域是在治療糖尿病和血脂異常的臨床應用，因為糖尿病和血脂異常是 CVD 患者中動脈粥樣硬化發生和發展的兩個非常重要的危險因素。Dr. Paul Grayburn 和他的團隊[45-49]、Castle 等[50]的研究分別表明了 UMGD 在兩個領域的應用。目前超聲微泡介導基因轉染治療心血管疾病的研究開展還是相對比較少，找到一種有效、安全的基因治療方法綜合治療與心血管疾病相關的其他疾病對于治療心血管疾病很重要。
3 展望和不足
UMGD 能夠應用在 CVD 的基因治療領域的獨特性包括：（1）非侵入性技術-隨著技術的進展，允許重復基因的轉染和可以利用多種不同的基因；（2）靶向血管轉染-這種轉染會成為內皮靶向基因治療的優勢，比如血管生成的基因治療；（3）超聲波透射區域以外的最低限度甚至無轉染，特別是用非病毒性載體。基于上述特性，UMGD 能夠被動靶向釋放基因到靶向組織，結合微泡的主動靶向，實現雙重靶向，提高了基因治療的精準性和有效性，為臨床應用提供了一條新路徑。但是也存在不足和相應的措施：（1）適度的轉染效率—通過更多有效的非病毒載體和重復轉染來克服；（2）適度轉染到如心肌細胞樣沒有血管的結構—通過用長時間間隔和重復轉染有可能使部分轉染得到增強；（3）轉染基因載體到靶向組織依賴于局部組織的血運灌注—會限制缺血組織的轉染和治療效果，但 UMGD 能轉染基因到梗死灶周圍的區域從而實現治療。
雖然目前基因治療在 CVD、心力衰竭的臨床前試驗模型的治療取得了較好的結果，但是尚未應用在人類的 CVD 中。隨著超聲微泡構建技術等醫學技術的研究發展，我們有理由相信，UMGD 在 CVD 的基因治療應用的時代即將到來。只要我們提高克服關于 CVD 的基因治療的臨床試驗困難的能力，克服臨床轉染的物質障礙，包括需要更多的能夠給予合適的轉染有效性的載體，最優化轉染參數，減少生物學副反應，UMGD 在人類 CVD 的臨床試驗和基因治療擁有更加廣闊的發展前景。
隨著經濟的快速發展和生活方式的改變，全球心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的發病率和死亡率逐年增加。盡管預防措施、診斷實驗、藥物治療、介入治療和外科手術治療已經取得了實質性的進展，在北美洲和全世界范圍內，CVD 仍然是疾病發病率和死亡率的主要因素，每年大概有 17.3 百萬人死于心血管疾病，而這個數字至 2030 年將會迅速增長至 26.3 百萬人[1-2]。近年來，中國心血管疾病的發病率也在持續增加。因此，我們需要在傳統治療方法的基礎上克服當前 CVD 治療措施的局限性。
基因治療是指將外源性正常基因導入靶細胞，以糾正或者補償因基因缺陷和異常引起的疾病，從而達到治療目的。基因治療不僅能夠在分子水平上改變細胞的結構和功能，還能夠直接靶向干預細胞內信號通路，從分子水平調整細胞功能，這使其成為 CVD 的治療和預防的一個極具前景的有力措施，因而受到廣泛關注[3-5]。其中，超聲介導基因轉染（ultrasound-mediated gene delivery，UMGD）因其非侵入性，精確的靶向性，良好的安全性以及能夠按需轉染多基因和多重基因等優勢而備受矚目。本文將就 UMGD 在 CVD 治療中的基本原則、應用和對未來的展望與不足做一綜述。
1 超聲靶向微泡破壞是超聲介導基因轉染的基本機制
超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是指利用超聲波和攜帶靶基因的微泡來實現靶向基因的轉染，目前已經成為 UMGD 的熱點技術。第一次引入超聲波能量來促進基因在體內轉染的試驗是在 19 世紀 20 年代末。最近，新型超聲微泡造影劑的出現進一步提高了空化效應和在體外裸 DNA 轉染轉基因的表達。在 2000 年，Shohet 等[6]第一次展示了 UTMD 用于基因轉染的研究。此后，越來越多的研究傾向于研究 UTMD 的基本機制和探索其在體內試驗中轉染的最優化方法。近年來，隨著超聲靶向微泡破壞造影劑和攜帶核酸基因的微泡等技術的發展，很多 CVD 的預臨床模型已經開始利用攜帶治療基因的微泡完成基因和藥物轉染[7-11]。
1.1 超聲靶向微泡破壞概念的回顧
UTMD 攜帶藥物或基因的超聲微泡造影劑到達靶向組織時，利用高機械指數的超聲輻照破壞微泡，使微泡攜帶的藥物或治療基因在靶向組織中釋放，從而達到對疾病病變部位的靶向治療。在 CVD 的基因治療中，經直接的心肌內注射轉染用藥僅僅在注射部位的局部小區域有效，而經冠狀動脈內或動脈內轉染時就會受到等離子體脫氧核糖核酸酶（DNA 酶）的快速清除。所以當前基因治療的研究主要是集中在開展能提高轉染有效性和達到持續的轉基因表達，且以一種最佳、最安全的方式靶向轉導治療基因。選擇 UTMD 的微泡元素主要考慮通過提高空化效應來提高超聲波的生物學效應和增加基因轉染的有效率，且通過內源性 DNA 核酸內切酶來防止基因的退化和延長其循環半衰期。通過超聲聯合微泡造影劑介導基因轉移能夠提高靶向性，從而顯著提高目的基因的轉染率和表達，同時，也增加了其靶向器官的高特異性和脫靶副作用的安全性。
1.1.1 超聲空化效應的概念
基因轉染的前提是能夠改變細胞膜的通透性，超聲產生的空化效應（cavitation effect）和機械效應通過改變細胞膜的通透性來增加基因的轉染。Bazan-Peregrino 等[12]的研究表明空化效應通過增加毛細血管內皮細胞間隙的寬度和細胞膜的通透性來使微泡或基因能夠進入血管壁及組織間隙，進而發揮靶向治療作用。空化效應是一種物理學效應，是一種物理現象，是指液體中的微小氣泡在超聲波的作用下向血管壁移動，先后在超聲作用下發生震蕩、膨脹、收縮及內爆等的動力學過程，伴瞬間釋放出瞬態高壓、高溫、放電等氣泡內的多種能量的行為[13-14]。其分為穩態空化和瞬態空化[15]。前者指超聲微泡在低聲壓下產生壓縮和膨脹的時候不發生破裂，而是通過做非線性振蕩活動的振動過程引發的輻射壓力和微射流而影響周圍細胞等產生的生物學效應。后者是一種強烈的生物學效應，指的是超聲微泡在高聲壓下發生急劇膨脹和收縮后出現微泡破裂，瞬間釋放出聲能，同時產生巨大的瞬時壓力和強烈的沖擊波及微射流會在周圍空間內形成高溫、高壓環境，造成細胞結構和功能的改變的同時會出現微生物和機體的損傷和破壞[16]，但在增強基因轉染時亦會引起細胞死亡、凋亡等不良后果。
1.1.2 超聲空化效應的影響因素
超聲波超聲空化效應的強弱與聲學參數以及液體的物理化學性質有關，超聲轉染效率受超聲頻率、聲壓、聲功率、輻照時間、占空比、微泡的量等多種因素協同作用影響[17]。（1）隨著超聲波頻率的降低，微泡在液體中的空化效應增大，反之隨著頻率的升高，會使產生超聲空化效應所需要的聲強就會越大，空化效應越難以發生。（2）占空比是是指整個脈沖信號一個周期之內所占的時間比率。占空比越高，空化行為越劇烈，明顯影響空化效應[18]。（3）有研究表明聲壓幅值越大、空化泡數量越多，空化效應越高。總的來說，各因素之間是互相聯系的。控制不一樣的變量會得出不一致的結果。劉珊[19]的研究表明了當總輻照劑量和聲功率相同時，占空比的大小能明顯影響空化效應強度；當總輻照劑量和輻照時間相同時，聲功率的高低可影響空化效應強度。通過調節高強度聚集超聲（HIFU）占空比和聲功率，改變靶區空化效應強度，從而影響組織損傷體積。由此可見，影響空化效應的各個因素之間是互相影響卻又不可分離的重要組成部分。
1.2 微泡造影劑
靶向超聲造影劑是由具有生物兼容性的高分子材料包裹微泡而成的，通過連接微泡表面的特異性配體或抗體，與靶組織或靶器官相應的受體相結合而實現靶向特異性的超聲造影劑[20]。靶向超聲造影劑使超聲醫學由器官組織的解剖學成像逐步深入到功能性成像，具有廣闊的應用前景。UTMD 的微泡有很多相似的商業化可利用的超聲增強造影劑，這些造影劑主要用于超聲心動圖和醫學超聲成像[21]。1968 年，Gramiak等[22]首次報道了注射鹽水溶液后能增強人體心室與動脈的超聲回波信號，從此超聲造影劑逐漸應用于臨床實踐中。目前超聲造影劑有 Definity（2001）、Sonovue（2001）、Luminty（2006）、Sonazoid（2007）、Lumason（2014）。微泡的主要組成是微氣泡，主要以氟化碳或者六氟化硫等惰性高分子質量氣體填充滿全。因為這些惰性高分子氣體在血液中具有低溶解性和高保留性，這使微泡具有高的穩定性和維持體循環系統中的持久性[21]。微泡的直徑大小比紅細胞的直徑小，使其在靜脈注射后能夠暢通無阻地穿過微血管結構達到循環系統。很多臨床試驗證實微泡沒有肝毒性或者腎毒性，有時僅有少量的、輕度短暫的不良反應，因此安全性良好。所以，超聲微泡造影劑在靶向血栓和藥物或基因轉染治療應用中的潛能是一個令人激動的領域。
目前，特異性配體與靶向超聲造影劑外殼包膜連接的的方法主要有以下兩種：（1）生物素-親和素法，也就是非吸附性非共價鍵結合的免疫化學固定方法，在不改變生物活性和生理特征的同時能夠將其生物化，比較適用在基礎性實驗研究中。（2）直接化學連接法，能夠得到具有穩定粘附配體的造影劑，適用于比如藥物、基因或多肽等小分子配體。靶向造影劑不僅能夠對靶點的特異性顯影來精確定位病灶，而且降低了其毒性等不良反應、提高對疾病的早期診斷和實現基因在體內無創性靶向運輸、定點釋放以及基因的轉染[23-25]。
1.3 超聲靶向微泡破壞的基因或核酸載體
UTMD 的基因或核酸載體分為病毒性和非病毒性載體。Shohet 等[26]第一次報道了關于 UTMD 的病毒載體在體內基因治療的試驗，該實驗利用一個載有 β-半乳糖苷酶基因的腺病毒載體成功地完成 UTMD 在心肌中的基因轉染。與全身系統性的腺病毒載體轉導相比，UTMD 既能夠通過靶向超聲轉染提供更好的定位特異性，也可通過提高細胞膜的通透性以穿過內皮細胞的屏障。
與病毒載體相比，非病毒載體有以下優點，如低免疫原性、低費用和低系統毒性。反義寡脫氧核糖核苷酸類（ODNs）等非病毒性載體已經被用在 UTMD 中，通過靶向基因提高在心血管疾病 mRNA 水平的治療效果，提高了心肌缺血和再灌注中的腫瘤壞死因子 α 的水平。微泡造影劑作為一種無創性載體攜帶質粒，克服了 ODNs 的轉染僅僅在短時間封鎖的轉錄水平才有效的局限性和 siRNAs 存在短期阻塞的缺點，在超聲介導下可顯著提高細胞基因轉染率和細胞生存率。質粒 DNA 的高特異性、高敏感性、瞬時表達水平、低耗費和低免疫原性等特性使其成為 UTMD 研究的首選載體。但是質粒載體在體內存活時間相對較短，且只有適度的轉染效率，因此研究者們開始研究探索沒有傳統的質粒中經常發現細菌的支柱和耐藥性元素[27]的微環載體。
1.4 最優化超聲靶向破壞微泡實現轉染
最優化參數研究因素包括超聲波能量、機械指數、聲壓峰值、超聲轉染脈沖或觸發間隔、超聲頻率和微泡類型等。2003 年，Bekeredjian 等[28]的研究系統說明了最優化 UTMD 的效率時，既要考慮相關的超聲參數，也要考慮非超聲參數，比如微泡組成和基因載體的連接方式。存在很多影響 UTMD 最優間隔的因素，包括 DNA 劑量、微泡濃度、靶向組織類型、注射方式（經靜脈內注射和動脈內注射）。另外，超聲束的寬度也是影響靶向轉染效率的參數之一，決定著 UTMD 的靶向區域。
2 超聲介導基因轉染在心血管疾病治療的應用
2.1 超聲介導基因轉染在缺血性心肌病治療的應用
2.1.1 通過增加血管密度治療缺血性心肌病
UMGD 在 CVD 臨床前模型的治療中取得了較理想的結果。目前，在大部分心肌缺血或者心肌梗死模型的研究中證實，UMGD 通過靶向基因轉染促進了新生血管生成。2004 年，Kondo 等[29]最早開展了通過超聲介導的基因轉染到心肌內的功能基因治療。此研究通過 UMGD 攜帶編碼人類肝細胞生長因子基因的質粒，對在 2 h 內進行冠狀動脈結扎的急性心肌梗死模型進行轉染。結果表明，肝細胞生長因子基因療法增加了梗死區域動脈和毛細血管密度，減小了疤痕面積和間質性纖維化，預防了心肌梗死后不良的左室重塑。2009 年，Fujii 等[30]研究了 UMGD 編碼干細胞因子和血管內皮生長因子的質粒在小鼠的心肌梗死模型上的影響。說明了血管內皮生長因子和干細胞因子的基因治療均能增加缺血性心肌病的血管內皮生長因子受體 2 和酪氨酸激酶受體（c-kit）陽性祖細胞群的數量，增加了小動脈與毛細血管的密度和心肌灌注量。2011 年，同一個研究隊伍驗證了重復使用（1 次、3 次或者 6 次）基質細胞衍生因子基因在一個大鼠心肌梗死模型中的治療效果[31]。結果表明重復 UMGD 能夠很大程度增加了血管密度，減少了梗死面積，改善左室收縮功能和提高治療效果，說明了 UTMD 的重復暴露增加了大鼠梗死心肌的血管生成，但沒有引起心肌損害，表明質粒 DNA 能夠通過 UMGD 的可重復性來延長了基因表達的壽命。曹治寰等[32]構建心肌梗死模型后使用免疫組織化學檢測心肌血管新生效應來檢測比較陽離子微泡與聲諾維微泡在體外的基因攜帶效率。他們的研究結果表明超聲靶向破壞陽離子微泡介導基因轉染能夠提高體內和體外的基因轉染效率，通過提高梗死心肌的新生血管密度來改善心臟功能。崔晶晶等[33]為了探索能夠改善基因轉染效率的方法，通過超聲靶向微泡破壞微泡介導由 UTMD 和核定位信號（nuclear localization signal，NLS）聯合構建的親核型基因載體至 48 只雄性成年雜種犬中，進而觀察轉染效率。他們發現了 UTMD 與 NLS 肽構建的親核型基因載體有效提高了轉染效率，同時能夠增加新生毛細血管的密度，降低了心肌梗死后瘢痕組織的面積和纖維化程度，從而改善心功能。國內外的這些研究提示了從增加新生毛細血管密度的方向來治療缺血性心臟病，是缺血性心臟病的基因治療的又一突破。
2.1.2 通過誘導干細胞心肌的歸巢治療缺血性心臟病
鄧傾的研究[34]使用陽離子微泡為載體和相對優化的超聲福照參數來進行基質衍生因子 1（SDF-1a）基因轉染治療心肌梗死。結果發現超聲和微泡聯合后基因傳遞的效率比單純超聲的基因傳遞顯著增高，表明超聲介導基因轉染的安全性和有效性。同時也發現了聯合核定位基序的基因轉染效率顯著高于無核定位基序的基因轉染效率，促進基因轉染治療心肌梗死。Cui 等[35]和 Kokhuis 等[36]的研究也表明微泡可以協同增加心肌細胞的歸巢，增加了心肌缺血后心肌數目，促進心肌梗死后損傷血管的修復及再生。李露的研究[37]表明了超聲微泡可以上調 SDF-1/CXC 趨化因子受體 4（CXCR4），促進骨髓間充質干細胞（MSCs）遷移歸巢到缺血心肌中，提高了血管內皮生長因子（VEGF）和肝細胞生長因子（HGF）的表達，通過提高新生血管的密度來修復缺血心肌和改善心功能。由此可見，干細胞能夠修復心肌和改善心功能的主要機制是心肌血管的新生；超聲靶向微泡介導基因轉染確能顯著提高基因轉染的效率，增加基因表達的釋放和誘導干細胞心肌的歸巢，是一條可以通過內源性干細胞治療心肌梗死安全有效的新途徑。
2.2 超聲介導基因轉染在治療阿霉素性心肌病的應用
UMGD 不僅能夠轉染到血管內皮細胞，也能夠靶向其他細胞類型。Sun 等[38]將攜帶 AKT 基因的自制陽離子微泡應用在治療急性心肌梗死大鼠中，發現其在增加血管密度、減小梗死面積、減少細胞凋亡及改善心臟功能方面明顯優于 Definity 微泡組。近些年來，由于抗生素的過度應用和泛濫，阿霉素性心肌病患者越來越多。Lee 等[39]利用阿霉素介導轉染的大鼠心肌病模型，在心肌病誘導 3 個星期后，通過 UMGD 傳遞攜帶抗凋亡基因生存素的質粒。結果顯示在心肌細胞和內皮細胞中同樣可以成功轉染，這說明 UMGD 的生存素基因療法會減弱左室收縮功能障礙和減少間質纖維化，減少肌細胞凋亡和防止適應不良的左室重構。此研究說明 UMGD 轉染靶細胞的廣泛性，并顯示了 UMGD 治療缺血性心肌病的潛能。Chen 等[40]在一個非缺血性阿霉素性心肌病的大鼠模型中，使用 UMGD 編碼 GLP-1 基因背負式運輸轉座子質粒進行轉染，發現 UMGD-GLP-1 基因治療能恢復左室功能，使左室收縮功能參數和左室后壁直徑恢復接近于正常值，也發現與刺激心肌再生的標記物相關，因此得出了心肌內 GLP-1 基因的轉染能夠通過刺激心肌細胞再生逆轉治療阿霉素性心肌病的結論。目前很多研究都提示心肌病是一種多基因疾病，我們需要增加 UMGD 治療阿霉素性心臟病的研究，因為基因治療是治療心肌病的根本方法，除此之外，我們還應該減少抗生素的不必要應用，從源頭降低阿霉素性心肌病的發生率，預防與治療結合為一體。
2.3 超聲介導基因轉染在治療動脈粥樣硬化性心臟病的應用
冠狀動脈微栓塞是急性冠狀動脈綜合征等血栓習慣疾病治療過程中發生的因粥樣硬化性板塊脫落引起的常見棘手的并發癥，常常出現遠期預后不良和心臟不良事件，是臨床急需解決的難題之一，受到了臨床醫生的廣泛關注。經皮冠狀動脈介入治療過程中由于粥樣硬化斑塊碎屑的脫落引起的遠端微血管栓塞很棘手[41-42]。Wang 等[43]的研究表明了組織因子途徑抑制物 2（TFPI-2）在抑制血管栓塞和動脈硬化方面發揮著重要作用。他們的研究表明 UTMD 能夠轉染 TFPI-2 基因至靶器官，且腺病毒基因轉染有更高的基因轉染效率，同時對血管壁造成的損傷更小。蘇強的研究[44]發現超聲微泡靶向轉染技術能夠成功轉染 microRNA-21 至心肌細胞中，實現轉染基因的有效表達，通過抑制 PDCD4/NF-KB/TNF-a 信號轉導通路和減少心肌炎癥反應來改善心臟功能。
最近有研究表明 UMGD 的 mi RNA-21 質粒在豬冠狀動脈微栓塞的模型已經被完成[41]，顯著地降低了凋亡相關蛋白 4 抗體的表達與核轉錄因子-kappaB 的活性，提高了心臟功能。他們發現在適當的條件下，UMGD 都能夠有效地提高基因在豬心臟的表達。
目前藥物治療動脈粥樣硬化性心臟病已經成為一種常見的治療方案，關于基因治療動脈粥樣硬化性心臟病的應用依舊較少，但超聲微泡介導基因轉染是治療動脈粥樣硬化性心臟病的無創、有效、高效、安全的方法。
2.4 與心血管疾病治療相關的超聲介導基因轉染的其他應用
UMGD 除了應用在心肌缺血或者心肌梗死等心血管疾病的治療外，也應用于與 CVD 相關的其他疾病的治療中。其中的兩個主要領域是在治療糖尿病和血脂異常的臨床應用，因為糖尿病和血脂異常是 CVD 患者中動脈粥樣硬化發生和發展的兩個非常重要的危險因素。Dr. Paul Grayburn 和他的團隊[45-49]、Castle 等[50]的研究分別表明了 UMGD 在兩個領域的應用。目前超聲微泡介導基因轉染治療心血管疾病的研究開展還是相對比較少，找到一種有效、安全的基因治療方法綜合治療與心血管疾病相關的其他疾病對于治療心血管疾病很重要。
3 展望和不足
UMGD 能夠應用在 CVD 的基因治療領域的獨特性包括：（1）非侵入性技術-隨著技術的進展，允許重復基因的轉染和可以利用多種不同的基因；（2）靶向血管轉染-這種轉染會成為內皮靶向基因治療的優勢，比如血管生成的基因治療；（3）超聲波透射區域以外的最低限度甚至無轉染，特別是用非病毒性載體。基于上述特性，UMGD 能夠被動靶向釋放基因到靶向組織，結合微泡的主動靶向，實現雙重靶向，提高了基因治療的精準性和有效性，為臨床應用提供了一條新路徑。但是也存在不足和相應的措施：（1）適度的轉染效率—通過更多有效的非病毒載體和重復轉染來克服；（2）適度轉染到如心肌細胞樣沒有血管的結構—通過用長時間間隔和重復轉染有可能使部分轉染得到增強；（3）轉染基因載體到靶向組織依賴于局部組織的血運灌注—會限制缺血組織的轉染和治療效果，但 UMGD 能轉染基因到梗死灶周圍的區域從而實現治療。
雖然目前基因治療在 CVD、心力衰竭的臨床前試驗模型的治療取得了較好的結果，但是尚未應用在人類的 CVD 中。隨著超聲微泡構建技術等醫學技術的研究發展，我們有理由相信，UMGD 在 CVD 的基因治療應用的時代即將到來。只要我們提高克服關于 CVD 的基因治療的臨床試驗困難的能力，克服臨床轉染的物質障礙，包括需要更多的能夠給予合適的轉染有效性的載體，最優化轉染參數，減少生物學副反應，UMGD 在人類 CVD 的臨床試驗和基因治療擁有更加廣闊的發展前景。