引用本文： 生偉, 王海桃, 池一凡, 孫龍, 牛兆倬, 林明山, 喬友進, 吳建濤. 血紅素加氧酶-1 對大鼠體外循環后肺組織抗細胞凋亡的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(5): 384-389. doi: 10.7507/1007-4848.201610033 復制
血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）作為一種內源性的保護基因[1]，在肺臟疾病的發生發展過程中，起到了重要的作用[2-3]。本實驗旨在研究 HO-1 在體外循環后（CPB）肺組織細胞凋亡中發揮的保護作用，并具體研究其發揮保護作用可能的機制。
1 資料與方法
1.1 實驗材料和分組
1.1.1 實驗材料 本實驗以 144 只雄性 Wistar 大鼠（體重 250～350 g）為研究對象，大鼠由青島市藥品檢驗所動物實驗中心提供。主要試劑HO-1多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體、SP免疫組化染色試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司。鈷原卟啉 (CoPP)、鋅原卟啉 (ZnPP)購自Sigma公司。TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.1.2 分組 將大鼠按照隨機原則分為 3 組，每組 48 只。A 組（對照組）：模型建立前 24 h 腹腔注射生理鹽水；B 組 [鈷原卟啉（CoPP）組]: 模型建立前 24 h 腹腔注射 CoPP（5 mg/kg）；C 組 [CoPP+鋅原卟啉（ZnPP）組]：模型建立前 24 h 腹腔注射 CoPP（5 mg/kg），同時注射 ZnPP（5 mg/kg）。
1.2 實驗方法
1.2.1 改良大鼠體外循環肺損傷模型的建立 采用復合誘導麻醉，通過右側頸內動脈和頸靜脈通路建立體外循環[4]。貯血器置于大鼠心臟平面以下 40 cm 左右，靜脈血經過變溫器變溫，膜肺氧合后通過蠕動泵灌注進入右側頸內動脈。CPB 開始前經股靜脈置管注入肝素（500 IU/kg），全血活化凝血時間（ACT）在 480 s 以上后才能開始轉流。胸骨正中切口，切開心包，分離主肺動脈，平均動脈壓在 CPB 過程中維持在 55～60 mm Hg。轉流漸趨平穩后，CPB 開始后 10 min，阻斷肺動脈，停止機械通氣，并行循環 50 min 后開放肺動脈，將頸靜脈插管退回至右心房內，恢復機械通氣，逐漸復溫，30 min 內肛溫達到 36.0℃ 左右停止體外循環。改良大鼠體外循環肺損傷模型模擬圖見圖 1。
圖1
改良大鼠體外循環肺損傷模擬圖
1.2.2 標本采集 建立改良大鼠 CPB 肺損傷模型后，采用斷頸法分別于 CPB 前（T0）、CPB 結束即刻（T1）、CPB 后 2 h（T2）、6 h（T3）、12 h（T4）、24 h（T5）各期將動物處死，每次 8 只。取肺組織作相應指標檢測。打開胸腔，取右肺組織，4% 的多聚甲醛固定部分肺組織，石蠟包埋，以備蘇木精-伊紅（HE）染色及各指標的免疫組織化學法測定。余肺組織置于液氮中凍存備用。
1.2.3 免疫組化法檢測肺組織 HO-1 和 Bcl-2 蛋白表達的位置及強度 采用免疫組化鏈霉素親合素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）法檢測。陽性表達為棕黃色顆粒。應用 Image-Pro Plus 6.0 病理圖文分析系統分析圖像，隨機選擇 5 個不同視野，測定陽性產物表達的平均光密度值（OD 值），HO-1 和 Bcl-2 蛋白陽性表達的強度用 5 個不同視野的 OD 值的均值來表示。
1.2.4 肺組織 HO-1 活力測定 根據 HO-1 降解血紅素生成一氧化碳和膽紅素的原理，計算肺組織中生成膽紅素的量評估肺組織 HO-1 的活性。選擇 464 nm 和 530 nm 雙波長分光光度法來測定肺組織勻漿中膽紅素生成量。膽紅素摩爾吸光系數為 40 nm/cm，其結果用 pmol/（mg·h） 表示。
1.2.5 TUNEL 法檢測細胞凋亡 TUNEL 標記的陽性細胞即為凋亡細胞，其細胞核呈棕黃色染色。肺組織細胞凋亡指數（AI）[5]：每張切片鏡檢，測定 5 個不同高倍視野下的凋亡細胞數，凋亡指數=TUNEL 陽性細胞數之和/細胞數總數之和×100%。
1.2.6 大鼠肺組織病理學觀察 通過 HE 染色，光鏡下觀察每組大鼠肺組織在不同時期的結構改變。
1.3 統計學分析
采用統計軟件 SPSS 16.0 進行數據分析。經方差分析進行正態性檢驗，計量資料為正態分布，采用均數±標準差（ ）表示。各組組間、組內數據的比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織 HO-1 的表達
肺組織中 HO-1 蛋白表達主要在細胞膜或細胞漿中，陽性細胞表現為棕黃色染色。采用免疫組化方法顯示肺組織細胞中 HO-1 蛋白陽性表達主要分布在細支氣管上皮細胞以及肺泡上皮細胞，在肺組織血管內皮也有少量表達。統計數據顯示 B 組肺組織 HO-1 蛋白表達在 CPB 前后各期均顯著強于 A 組和 C 組（P<0.05）。各組大鼠肺組織在經過 CPB 后 HO-1 蛋白表達增加，在 T2 點表達最多。免疫組化檢測的 HO-1 表達見表 1 及圖 2。
表1
各組大鼠不同時間點肺組織 HO-1 的表達比較（
）
圖2
各組大鼠肺組織 T2 期 HO-1 蛋白的表達 （SABC×200）A 組（2a）和C組（2c）肺組織中少數細胞胞漿可見棕黃色染色，B 組（2b）肺組織中許多細胞胞漿可見明顯棕黃色染色；圖 3 各組大鼠T0期肺組織Bcl-2蛋白表達 （SABC×400）A 組（3a）、B 組（3b）和 C 組（3c）肺組織視野中許多細胞胞漿可見明顯棕黃色染色；圖 4 各組大鼠 T2 期肺組織 Bcl-2 蛋白表達 （SABC×400）A 組（4a）和C組（4c）肺組織視野中極少數細胞胞漿可見棕黃色染色，B 組（4b）肺組織視野中少數細胞胞漿可見棕黃色染色；圖 5 各組大鼠肺組織 T2 期細胞凋亡情況 （TUNEL×400）A 組（5a）和 C 組（5c）肺組織視野中許多細胞胞核可見明顯棕黃色染色，B 組（5b）肺組織視野中少數細胞胞核可見棕黃色染色
2.2 肺組織 HO-1 活力測定
各組大鼠肺組織 HO-1 活力經過 CPB 后逐漸增加，在 T2 點活力最強，其后逐漸降低。B 組肺組織 HO-1 活力在 CPB 前后各期均高于 A 組和 C 組（P<0.05）。肺組織 HO-1 活力測定結果與免疫組化法檢測的 HO-1 蛋白表達情況相一致，見表 2。
表2
各組大鼠不同時間點肺組織 HO-1 的活力測定比較[ pmol/（mg·h），
]
2.3 肺組織 Bcl-2 蛋白測定
各組大鼠肺組織細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白在 CPB 前差異無統計學意義（P>0.05），CPB 后 Bcl-2 蛋白逐漸下調，到 T2 點減少最明顯，之后逐漸上調。B 組在 CPB 后各期 Bcl-2 蛋白表達全部高于 A 組和 C 組，其差異有統計學意義（P<0.05），見表 3、圖 3、圖 4。
表3
各組大鼠不同時間點肺組織 Bcl-2 蛋白的測定結果比較（
）
2.4 肺組織凋亡指數的測定
各組大鼠肺組織細胞 AI 在 CPB 前差異無統計學意義，CPB 后 AI 逐漸增加，到 T2 點增加最明顯，之后逐漸下降。B 組在 CPB 后各期 AI 均顯著低于 A 組和 C 組（P<0.05），見表 4、圖 5。
表4
各組大鼠不同時間點肺組織凋亡指數的測定結果比較（%，
）
2.5 肺組織病理學改變
光鏡下觀察各組大鼠肺組織在 CPB 前 T0 期肺泡腔較為完整，無明顯組織液滲出。肺泡間隔無明顯增厚，均勻一致，肺泡壁無明顯增厚，較為光滑，肺泡腔內未見明顯滲出液或僅有少量白細胞滲出。CPB 后 A 組和 C 組大鼠肺泡間隔明顯增厚、肺泡壁水腫，毛細血管擴張明顯，并出現充血性改變，肺泡間質以及肺泡腔內出現明顯的炎性細胞滲出浸潤，滲出的炎性細胞以中性粒細胞為主，部分肺泡腔內能觀察到滲出的紅細胞、炎性滲出液體；與 A 組和 C 組相比，B 組肺泡間隔增厚減輕，肺泡腔內滲出明顯減少，較少觀察到炎性滲出液體及紅細胞。間質水腫也有明顯減輕，肺泡毛細血管充血性改變明顯減輕，炎性細胞滲出浸潤明顯減少。各組大鼠肺組織損傷的形態學變化在 T2 期最嚴重, 見圖 6、圖 7。
圖6
各組大鼠肺組織 T0 期光鏡觀察圖 （HE染色×100） A 組（6a）、B 組（6b）和 C 組（6c）肺組織 T0 期光鏡觀察圖；圖 7 各組大鼠肺組織 T2 期光鏡觀察圖 （HE×100）A 組（7a）、B 組（7b）和 C 組（7c）肺組織 T2 期光鏡觀察圖
3 討論
當機體的某些組織器官以及一些細胞受到一定的應激條件時，機體就會被誘導生成 HO-1，從而發揮保護作用，發揮其抗炎性反應、抗氧化應激[1,6]以及抗增生和抗細胞調亡的效應[7-8]。肺損傷是心臟外科領域尤其是CPB 后發生最早、最普遍，也是最難治療的并發癥之一[9-10]。目前有許多研究證實 HO-1 在肺臟疾病中發揮保護作用，大多心臟外科手術需要經過 CPB 甚至深低溫停循環這樣一個非生理過程，對于經過這樣一個復雜的病理生理過程后，HO-1 是否仍能發揮肺損傷保護作用，其具體的機制又如何？目前國內外研究較少。本實驗重點研究在 CPB 后，肺組織細胞凋亡檢測，并探討 HO-1 在 CPB 后肺損傷中發揮的抗細胞凋亡作用，并具體研究其發揮保護作用可能的機制。
本實驗表明，在 CPB 前，各組大鼠肺組織 HO-1 表達較少，表明正常情況下，HO-1 表達較少。CPB 后大鼠肺組織 HO-1 表達逐漸增加，表明了 CPB 帶來缺血再灌注損傷的同時，也啟動了 HO-1 表達的內在保護系統。而且本研究表明在 CPB 前及 CPB 后各時間點 CoPP 組 HO-1 表達明顯高于較對照組，表明 CoPP 可以誘導肺組織 HO-1 蛋白的表達，而加入 ZnPP 后 HO-1 表達與對照組無明顯差異，說明 ZnPP 抑制了肺組織 HO-1 蛋白的表達。
細胞凋亡是引起肺缺血再灌注早期肺損傷的重要因素之一，而Ⅱ型肺泡上皮細胞是肺組織內細胞凋亡最常發生的細胞，也見于肺組織的氣道上皮細胞等[11-13]。本實驗中 CPB 后細胞凋亡比例逐漸增加，說明了缺血再灌注后細胞凋亡事件參與了肺損傷過程，進一步提示抑制細胞凋亡可在肺缺血再灌注損傷中發揮保護作用。細胞凋亡的發生過程中，Bcl-2 家族起了舉足輕重的作用，其中 Bcl-2 是一種原癌基因，是機體內至關重要的抗凋亡基因，能夠抑制多種細胞毒因素引起的細胞死亡[14-15]。目前研究指出 Bcl-2 抑制細胞凋亡的作用可能與以下幾種作用有關[16-18]：抑制鈣離子的跨膜流動[19]；減少氧自由基生成和脂質過氧化反應，發揮抗氧化損傷作用；抑制線粒體通透性的改變，抑制線粒體釋放凋亡蛋白激活因子細胞色素 C 和凋亡誘導因子[20-21]；Bcl-2 還可與 Bcl-2 家族外的蛋白結合，共同發揮其抗凋亡作用；它還可以將凋亡蛋白的前體物質凋亡酶活化因子等定位至線粒體膜上，從而抑制其發揮促凋亡作用。此研究數據表明 CoPP 組大鼠 CPB 后肺組織抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達要明顯強于對照組和 ZnPP 抑制組，CoPP 組大鼠肺組織經過 CPB 過程后發生細胞凋亡的比例明顯減少。因此該研究證實 HO-1 能夠在 CPB 過程中減輕和抑制大鼠 CPB 過程中肺組織細胞的細胞凋亡的發生，其抗凋亡作用可能是通過上調抗凋亡相關蛋白 Bcl-2 在肺組織中的表達來實現的。ZnPP 組大鼠 Bcl-2 的表達較 CoPP 組明顯減少，說明 HO-1 的抗凋亡作用可被 HO-1 的特異性抑制劑減弱。
在本實驗中，從病理切片上觀察到 CPB 開始后肺組織的損傷逐漸加重，而經過 CoPP 預處理組肺組織，其損傷程度明顯減輕。這從形態學上再次證明了 CoPP 預處理可以減輕大鼠體外循環后肺組織的損傷，改善術后肺功能。C 組中加入了 ZnPP 后，肺組織的損傷程度在病理切片上與對照組類似，再次說明了這一保護作用可被 HO-1 的特異性抑制劑 ZnPP 所抑制。
綜上所述，CoPP 可以誘導肺組織 HO-1 的高表達，使其活性增加，而且經過 CPB 這一復雜的病理生理過程后，仍保持較高的表達。內源性 HO-1 高表達在 CPB 肺損傷中具有一定的抗細胞凋亡作用。從而減輕 CPB 后肺組織損傷的發生。其抗凋亡作用可能通過使抗凋亡蛋白 Bcl-2 增高而實現。因此通過各種途徑誘導 HO-1 在肺組織的高表達能夠為心臟外科領域 CPB 過程中肺功能的保護另辟蹊徑。
血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）作為一種內源性的保護基因[1]，在肺臟疾病的發生發展過程中，起到了重要的作用[2-3]。本實驗旨在研究 HO-1 在體外循環后（CPB）肺組織細胞凋亡中發揮的保護作用，并具體研究其發揮保護作用可能的機制。
1 資料與方法
1.1 實驗材料和分組
1.1.1 實驗材料 本實驗以 144 只雄性 Wistar 大鼠（體重 250～350 g）為研究對象，大鼠由青島市藥品檢驗所動物實驗中心提供。主要試劑HO-1多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體、SP免疫組化染色試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司。鈷原卟啉 (CoPP)、鋅原卟啉 (ZnPP)購自Sigma公司。TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.1.2 分組 將大鼠按照隨機原則分為 3 組，每組 48 只。A 組（對照組）：模型建立前 24 h 腹腔注射生理鹽水；B 組 [鈷原卟啉（CoPP）組]: 模型建立前 24 h 腹腔注射 CoPP（5 mg/kg）；C 組 [CoPP+鋅原卟啉（ZnPP）組]：模型建立前 24 h 腹腔注射 CoPP（5 mg/kg），同時注射 ZnPP（5 mg/kg）。
1.2 實驗方法
1.2.1 改良大鼠體外循環肺損傷模型的建立 采用復合誘導麻醉，通過右側頸內動脈和頸靜脈通路建立體外循環[4]。貯血器置于大鼠心臟平面以下 40 cm 左右，靜脈血經過變溫器變溫，膜肺氧合后通過蠕動泵灌注進入右側頸內動脈。CPB 開始前經股靜脈置管注入肝素（500 IU/kg），全血活化凝血時間（ACT）在 480 s 以上后才能開始轉流。胸骨正中切口，切開心包，分離主肺動脈，平均動脈壓在 CPB 過程中維持在 55～60 mm Hg。轉流漸趨平穩后，CPB 開始后 10 min，阻斷肺動脈，停止機械通氣，并行循環 50 min 后開放肺動脈，將頸靜脈插管退回至右心房內，恢復機械通氣，逐漸復溫，30 min 內肛溫達到 36.0℃ 左右停止體外循環。改良大鼠體外循環肺損傷模型模擬圖見圖 1。
圖1
改良大鼠體外循環肺損傷模擬圖
1.2.2 標本采集 建立改良大鼠 CPB 肺損傷模型后，采用斷頸法分別于 CPB 前（T0）、CPB 結束即刻（T1）、CPB 后 2 h（T2）、6 h（T3）、12 h（T4）、24 h（T5）各期將動物處死，每次 8 只。取肺組織作相應指標檢測。打開胸腔，取右肺組織，4% 的多聚甲醛固定部分肺組織，石蠟包埋，以備蘇木精-伊紅（HE）染色及各指標的免疫組織化學法測定。余肺組織置于液氮中凍存備用。
1.2.3 免疫組化法檢測肺組織 HO-1 和 Bcl-2 蛋白表達的位置及強度 采用免疫組化鏈霉素親合素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）法檢測。陽性表達為棕黃色顆粒。應用 Image-Pro Plus 6.0 病理圖文分析系統分析圖像，隨機選擇 5 個不同視野，測定陽性產物表達的平均光密度值（OD 值），HO-1 和 Bcl-2 蛋白陽性表達的強度用 5 個不同視野的 OD 值的均值來表示。
1.2.4 肺組織 HO-1 活力測定 根據 HO-1 降解血紅素生成一氧化碳和膽紅素的原理，計算肺組織中生成膽紅素的量評估肺組織 HO-1 的活性。選擇 464 nm 和 530 nm 雙波長分光光度法來測定肺組織勻漿中膽紅素生成量。膽紅素摩爾吸光系數為 40 nm/cm，其結果用 pmol/（mg·h） 表示。
1.2.5 TUNEL 法檢測細胞凋亡 TUNEL 標記的陽性細胞即為凋亡細胞，其細胞核呈棕黃色染色。肺組織細胞凋亡指數（AI）[5]：每張切片鏡檢，測定 5 個不同高倍視野下的凋亡細胞數，凋亡指數=TUNEL 陽性細胞數之和/細胞數總數之和×100%。
1.2.6 大鼠肺組織病理學觀察 通過 HE 染色，光鏡下觀察每組大鼠肺組織在不同時期的結構改變。
1.3 統計學分析
采用統計軟件 SPSS 16.0 進行數據分析。經方差分析進行正態性檢驗，計量資料為正態分布，采用均數±標準差（ ）表示。各組組間、組內數據的比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織 HO-1 的表達
肺組織中 HO-1 蛋白表達主要在細胞膜或細胞漿中，陽性細胞表現為棕黃色染色。采用免疫組化方法顯示肺組織細胞中 HO-1 蛋白陽性表達主要分布在細支氣管上皮細胞以及肺泡上皮細胞，在肺組織血管內皮也有少量表達。統計數據顯示 B 組肺組織 HO-1 蛋白表達在 CPB 前后各期均顯著強于 A 組和 C 組（P<0.05）。各組大鼠肺組織在經過 CPB 后 HO-1 蛋白表達增加，在 T2 點表達最多。免疫組化檢測的 HO-1 表達見表 1 及圖 2。
表1
各組大鼠不同時間點肺組織 HO-1 的表達比較（
）
圖2
各組大鼠肺組織 T2 期 HO-1 蛋白的表達 （SABC×200）A 組（2a）和C組（2c）肺組織中少數細胞胞漿可見棕黃色染色，B 組（2b）肺組織中許多細胞胞漿可見明顯棕黃色染色；圖 3 各組大鼠T0期肺組織Bcl-2蛋白表達 （SABC×400）A 組（3a）、B 組（3b）和 C 組（3c）肺組織視野中許多細胞胞漿可見明顯棕黃色染色；圖 4 各組大鼠 T2 期肺組織 Bcl-2 蛋白表達 （SABC×400）A 組（4a）和C組（4c）肺組織視野中極少數細胞胞漿可見棕黃色染色，B 組（4b）肺組織視野中少數細胞胞漿可見棕黃色染色；圖 5 各組大鼠肺組織 T2 期細胞凋亡情況 （TUNEL×400）A 組（5a）和 C 組（5c）肺組織視野中許多細胞胞核可見明顯棕黃色染色，B 組（5b）肺組織視野中少數細胞胞核可見棕黃色染色
2.2 肺組織 HO-1 活力測定
各組大鼠肺組織 HO-1 活力經過 CPB 后逐漸增加，在 T2 點活力最強，其后逐漸降低。B 組肺組織 HO-1 活力在 CPB 前后各期均高于 A 組和 C 組（P<0.05）。肺組織 HO-1 活力測定結果與免疫組化法檢測的 HO-1 蛋白表達情況相一致，見表 2。
表2
各組大鼠不同時間點肺組織 HO-1 的活力測定比較[ pmol/（mg·h），
]
2.3 肺組織 Bcl-2 蛋白測定
各組大鼠肺組織細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白在 CPB 前差異無統計學意義（P>0.05），CPB 后 Bcl-2 蛋白逐漸下調，到 T2 點減少最明顯，之后逐漸上調。B 組在 CPB 后各期 Bcl-2 蛋白表達全部高于 A 組和 C 組，其差異有統計學意義（P<0.05），見表 3、圖 3、圖 4。
表3
各組大鼠不同時間點肺組織 Bcl-2 蛋白的測定結果比較（
）
2.4 肺組織凋亡指數的測定
各組大鼠肺組織細胞 AI 在 CPB 前差異無統計學意義，CPB 后 AI 逐漸增加，到 T2 點增加最明顯，之后逐漸下降。B 組在 CPB 后各期 AI 均顯著低于 A 組和 C 組（P<0.05），見表 4、圖 5。
表4
各組大鼠不同時間點肺組織凋亡指數的測定結果比較（%，
）
2.5 肺組織病理學改變
光鏡下觀察各組大鼠肺組織在 CPB 前 T0 期肺泡腔較為完整，無明顯組織液滲出。肺泡間隔無明顯增厚，均勻一致，肺泡壁無明顯增厚，較為光滑，肺泡腔內未見明顯滲出液或僅有少量白細胞滲出。CPB 后 A 組和 C 組大鼠肺泡間隔明顯增厚、肺泡壁水腫，毛細血管擴張明顯，并出現充血性改變，肺泡間質以及肺泡腔內出現明顯的炎性細胞滲出浸潤，滲出的炎性細胞以中性粒細胞為主，部分肺泡腔內能觀察到滲出的紅細胞、炎性滲出液體；與 A 組和 C 組相比，B 組肺泡間隔增厚減輕，肺泡腔內滲出明顯減少，較少觀察到炎性滲出液體及紅細胞。間質水腫也有明顯減輕，肺泡毛細血管充血性改變明顯減輕，炎性細胞滲出浸潤明顯減少。各組大鼠肺組織損傷的形態學變化在 T2 期最嚴重, 見圖 6、圖 7。
圖6
各組大鼠肺組織 T0 期光鏡觀察圖 （HE染色×100） A 組（6a）、B 組（6b）和 C 組（6c）肺組織 T0 期光鏡觀察圖；圖 7 各組大鼠肺組織 T2 期光鏡觀察圖 （HE×100）A 組（7a）、B 組（7b）和 C 組（7c）肺組織 T2 期光鏡觀察圖
3 討論
當機體的某些組織器官以及一些細胞受到一定的應激條件時，機體就會被誘導生成 HO-1，從而發揮保護作用，發揮其抗炎性反應、抗氧化應激[1,6]以及抗增生和抗細胞調亡的效應[7-8]。肺損傷是心臟外科領域尤其是CPB 后發生最早、最普遍，也是最難治療的并發癥之一[9-10]。目前有許多研究證實 HO-1 在肺臟疾病中發揮保護作用，大多心臟外科手術需要經過 CPB 甚至深低溫停循環這樣一個非生理過程，對于經過這樣一個復雜的病理生理過程后，HO-1 是否仍能發揮肺損傷保護作用，其具體的機制又如何？目前國內外研究較少。本實驗重點研究在 CPB 后，肺組織細胞凋亡檢測，并探討 HO-1 在 CPB 后肺損傷中發揮的抗細胞凋亡作用，并具體研究其發揮保護作用可能的機制。
本實驗表明，在 CPB 前，各組大鼠肺組織 HO-1 表達較少，表明正常情況下，HO-1 表達較少。CPB 后大鼠肺組織 HO-1 表達逐漸增加，表明了 CPB 帶來缺血再灌注損傷的同時，也啟動了 HO-1 表達的內在保護系統。而且本研究表明在 CPB 前及 CPB 后各時間點 CoPP 組 HO-1 表達明顯高于較對照組，表明 CoPP 可以誘導肺組織 HO-1 蛋白的表達，而加入 ZnPP 后 HO-1 表達與對照組無明顯差異，說明 ZnPP 抑制了肺組織 HO-1 蛋白的表達。
細胞凋亡是引起肺缺血再灌注早期肺損傷的重要因素之一，而Ⅱ型肺泡上皮細胞是肺組織內細胞凋亡最常發生的細胞，也見于肺組織的氣道上皮細胞等[11-13]。本實驗中 CPB 后細胞凋亡比例逐漸增加，說明了缺血再灌注后細胞凋亡事件參與了肺損傷過程，進一步提示抑制細胞凋亡可在肺缺血再灌注損傷中發揮保護作用。細胞凋亡的發生過程中，Bcl-2 家族起了舉足輕重的作用，其中 Bcl-2 是一種原癌基因，是機體內至關重要的抗凋亡基因，能夠抑制多種細胞毒因素引起的細胞死亡[14-15]。目前研究指出 Bcl-2 抑制細胞凋亡的作用可能與以下幾種作用有關[16-18]：抑制鈣離子的跨膜流動[19]；減少氧自由基生成和脂質過氧化反應，發揮抗氧化損傷作用；抑制線粒體通透性的改變，抑制線粒體釋放凋亡蛋白激活因子細胞色素 C 和凋亡誘導因子[20-21]；Bcl-2 還可與 Bcl-2 家族外的蛋白結合，共同發揮其抗凋亡作用；它還可以將凋亡蛋白的前體物質凋亡酶活化因子等定位至線粒體膜上，從而抑制其發揮促凋亡作用。此研究數據表明 CoPP 組大鼠 CPB 后肺組織抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達要明顯強于對照組和 ZnPP 抑制組，CoPP 組大鼠肺組織經過 CPB 過程后發生細胞凋亡的比例明顯減少。因此該研究證實 HO-1 能夠在 CPB 過程中減輕和抑制大鼠 CPB 過程中肺組織細胞的細胞凋亡的發生，其抗凋亡作用可能是通過上調抗凋亡相關蛋白 Bcl-2 在肺組織中的表達來實現的。ZnPP 組大鼠 Bcl-2 的表達較 CoPP 組明顯減少，說明 HO-1 的抗凋亡作用可被 HO-1 的特異性抑制劑減弱。
在本實驗中，從病理切片上觀察到 CPB 開始后肺組織的損傷逐漸加重，而經過 CoPP 預處理組肺組織，其損傷程度明顯減輕。這從形態學上再次證明了 CoPP 預處理可以減輕大鼠體外循環后肺組織的損傷，改善術后肺功能。C 組中加入了 ZnPP 后，肺組織的損傷程度在病理切片上與對照組類似，再次說明了這一保護作用可被 HO-1 的特異性抑制劑 ZnPP 所抑制。
綜上所述，CoPP 可以誘導肺組織 HO-1 的高表達，使其活性增加，而且經過 CPB 這一復雜的病理生理過程后，仍保持較高的表達。內源性 HO-1 高表達在 CPB 肺損傷中具有一定的抗細胞凋亡作用。從而減輕 CPB 后肺組織損傷的發生。其抗凋亡作用可能通過使抗凋亡蛋白 Bcl-2 增高而實現。因此通過各種途徑誘導 HO-1 在肺組織的高表達能夠為心臟外科領域 CPB 過程中肺功能的保護另辟蹊徑。
