引用本文： 郭海, 袁楊, 覃勝, 黃建鳴, 肖波, 方強, 任光國. Twist 在食管鱗狀細胞癌中的表達與臨床預后的關系. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(11): 849-852. doi: 10.7507/1007-4848.201608037 復制
食管癌是我國排名第 4 的致死性疾病，每年約有 15 萬人死于此病，鱗狀細胞癌（鱗癌）是主要病理類型，占 90% 以上，其次為腺癌[1]。食管癌患者術后 5 年生存率僅為 20%～30%，術后腫瘤復發和轉移是低生存率的主要原因[2]。Twist 蛋白由 Twist 基因轉錄表達形成，通過調節 p53 依賴和非 p53 依賴途徑，Akt 途徑，JNK 途徑等抑制腫瘤細胞凋亡，促使腫瘤細胞增殖[3-5]。
現有研究證實 Twist 通過介導上皮-間充質細胞轉化的發育，使腫瘤失去上皮細胞的粘附，增加了腫瘤的侵襲性和轉移性[6]。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取 2010 年 6 月至 2012 年 6 月四川省腫瘤醫院胸外科一病區經同一小組醫師行食管切除術的 70 例食管鱗癌患者的術后石蠟標本，其中男 39 例、女 31 例，平均年齡 63.6 歲。另切取該入組患者的正常食管組織（即距腫瘤邊緣大于 5 cm 的食管組織）作為對照組。70例患者中 35 例標本脈管瘤栓陽性，35 例標本脈管瘤栓陰性，所有患者術前均未行放化療及其它抗腫瘤治療。胸上段食管癌 12 例，胸中段食管癌 37 例，胸下段食管癌 21 例，術后病理均為鱗癌。根據 WHO 組織學分類，高分化鱗癌 15 例，中分化鱗癌 24 例，低分化鱗癌 31 例。根據國際抗癌聯盟 2007 年 TNM 分期標準，Ⅰ～Ⅱ 期 41 例，Ⅲ 期 29 例，無 Ⅳ 期患者標本。所有納入研究病例臨床資料和隨訪資料均完整。
1.2 主要試劑
兔抗人 Twist 多克隆抗體、兔抗人 D2-40 單克隆抗體由艾博抗（上海）貿易有限公司；0.01 M 磷酸鹽緩沖液（PBS）、枸櫞酸組織抗原修復液、抗體稀釋液由福州邁新生物技術公司提供；GTVisionTMⅢ 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑由基因科技（上海）有限公司生產。
1.3 方法
1.3.1 切片準備
選擇符合條件的石蠟標本，切成厚約 4 μm 的薄片。每張石蠟塊切 4 張片[Twist，蘇木精-伊紅染色（HE），D2-40，空白對照片各一張]。
1.3.2 石蠟切片脫蠟和水化
將備好的切片依次浸泡在二甲苯 Ⅰ、Ⅱ 溶液中 15 min，再依次放入濃度梯度為 100%、95%、80% 乙醇溶液中浸泡 2 min 完成脫蠟和水化過程。蒸餾水反復沖洗后再用 PBS（0.01 M，pH 7.5±0.1）充分沖洗。
1.3.3 抗原修復
將經上述方法處理過的切片浸泡在已加熱至恒溫 92℃～96℃ 的枸櫞酸鹽組織修復液（0.01 M，pH 6.0）中進行抗原修復。20 min 后取出用 PBS 溶液反復沖洗后，室溫下浸泡于濃度為 3% H2O2 溶液中 15 min，再用 PBS 反復沖洗切片以清除切片中的內源性過氧化物酶活性。
1.3.4 ?制片
每張石蠟切片分別加 1 滴兔血清工作液，常溫下 15 min。清除掉封閉用的兔血清后滴加羊抗人 Twist 多克隆一抗（工作濃度為 1∶200，抗體稀釋液稀釋），放置于 4℃ 濕盒內 12 h；對照組行相同處理。
1.3.5 ?染色
PBS 溶液反復沖洗后，滴加 l 滴通用型免疫組化染色劑[二抗與二氨基聯苯胺（DAB）染色一體試劑]，DAB 顯微鏡下控制染色，再用蒸餾水沖洗直至染色效果滿意。Harris 蘇木素染色后蒸餾水沖洗。
1.3.6 封片
分別在濃度梯度為 80%、95%、100% 乙醇溶液中浸泡 2 min 后于 60℃ 烘箱烘干；再于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中浸泡 10 min；中性樹膠封片。
1.3.7 結果判定
免疫組織化學結果采用半定量記分法判定，按陽性著色程度評分：0 分為無著色；1 分為淺黃色；2 分為棕色；3 分為棕褐色。再按陽性細胞所占比例評分：0 分為陰性；1 分為<10%；2 分為 11%～50%；3 分為 51% 以上，以兩者乘積判定結果：4 分以下（–），4～6 分（+），6～9 分（++），9 分以上（+++）。
1.4 統計學分析
使用 IBM SPSS22.0 統計軟件進行統計學分析。不同 Twist 表達組患者的無病生存率比較采用 Kaplan-Meier 法及 log-rank 檢驗。多因素預后分析采用 Cox 模型。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
Twist 陽性表達率在正常食管組織中和腫瘤組織中分別為 42.9%、77.1%，差異有統計學意義（P<0.05）。脈管瘤栓陽性和陰性的食管鱗癌患者腫瘤細胞中 Twist 陽性表達率分別為 74.3%、80.0%，差異無統計學意義（P>0.05）。Twist 在腫瘤細胞和在脈管瘤栓內陽性表達率分別為74.3%、71.4%，差異無統計學意義（P>0.05）。Twist 在脈管瘤栓陽性患者的淋巴管內和血管內表達分別為 56.0%、72.0%，差異無統計學意義（P>0.05）。
Twist 在腫瘤細胞中的陽性表達與食管鱗癌患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度（T 分期）、腫瘤分化程度、淋巴結轉移這些臨床病理特征之間無相關性（P>0.05）。
腫瘤細胞內 Twist 陰性表達的食管鱗癌患者平均無病生存期 8.3 個月；Twist 表達（+）食管鱗癌患者平均無病生存期 10.8 個月；Twist 表達（++）食管鱗癌患者平均無病生存期 8.8 個月；Twist 表達（+++）食管鱗癌患者平均無病生存期 9.6 個月（表 1）。通過 log-rank 檢驗，四組患者之間的無病生存期差異無統計學意義（P>0.05）；見圖 1。
表1
Twist 在食管鱗癌患者中不同表達強度與 FDS 之間的關系
圖1
Twist 在食管鱗癌患者中不同表達程度的生存曲線
Twist 在腫瘤細胞陽性表達和陰性表達分別為 26∶9；在脈管瘤栓內陽性表達和陰性表達分別為 25∶10。Twist 在食管鱗癌患者中，腫瘤細胞和脈管瘤栓陽性表達率分別為 74.3%、71.4%，差異無統計學意義（P>0.05），Twist 不同表達情況見圖 2。
圖2
Twist在不同部位的表達情況（HE×400） a. Twist 在脈管瘤栓內陽性表達； b. Twist 在腫瘤細胞內陽性表達； c. Twist 陰性表達； d. Twist 在正常食管黏膜陽性表達
3 討論
研究結果顯示食管鱗癌患者淋巴結轉移是影響預后的主要危險因素；食管鱗癌患者脈管內出現瘤栓與淋巴結轉移存在相關關系，是淋巴結轉移的獨立危險因素[7-9]。研究顯示正常食管組織與腫瘤細胞中 Twist 的表達存在差異，食管癌腫瘤細胞中 Twist 的表達明顯較正常食管黏膜組織中高[10]。本研究結果與之相符。Yang 等[6]研究表明，Twist 基因通過介導上皮-間充質細胞轉化的發育，使腫瘤失去上皮細胞的粘附，促進腫瘤侵襲和轉移。本研究中，脈管瘤栓陽性和陰性的食管鱗癌患者腫瘤細胞中 Twist 陽性表達率分別為 74.3%、80.0%，差異無統計學意義（P>0.05），提示 Twist 在腫瘤細胞內的表達與食管鱗癌患者脈管瘤栓無相關性。
本研究對 Twist 在脈管瘤栓陽性患者腫瘤細胞中和脈管瘤栓中的表達是否具有一致性進行了分析比較，其中 Twist 在食管鱗癌腫瘤細胞中的陽性表達率為 74.3%，脈管瘤栓中陽性表達率為 71.4%，兩者表達差異并無統計學意義（P>0.05），說明 Twist 在食管鱗癌腫瘤細胞中和脈管瘤栓中的表達具有一致性，提示 Twist 介導了腫瘤的轉移。作者考慮 Twist 的高表達是否將導致腫瘤對血管侵犯更加顯著。因此將食管鱗癌患者標本中的脈管瘤栓進一步分層，分為血管瘤栓和淋巴管瘤栓進行分層分析，結果顯示：食管鱗癌患者標本中 Twist 在淋巴管瘤栓內的陽性表達率和和血管內瘤栓的陽性表達率并無顯著差異（P>0.05），這說明 Twist 介導的腫瘤侵襲和轉移對淋巴管和血管并無顯著的選擇性。
Forghanifard 等[11]研究發現：Twist 高表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤分期存在正相關；而另一些研究結果則顯示 Twist 的高表達與食管鱗癌患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移并無相關性[12]。作者對本研究病例進行分層比較發現 Twist 在不同組食管鱗癌患者腫瘤細胞中的表達與性別、年齡、淋巴結是否轉移、腫瘤浸潤深度（T 分期）、腫瘤分化程度無相關性（P>0.05）。Twist 蛋白能夠促進腫瘤細胞分化，抑制細胞凋亡，能介導腫瘤細胞的侵襲和轉移，因此 Twist 的高表達可能會影響患者的預后。本研究中的隨訪數據統計分析顯示 Twist 表達為（–）、（+）、（++）（+++）的四組患者之間無病生存期差異無統計學意義。Cox 邏輯回歸生存分析顯示 Twist 陽性表達并不是影響食管鱗癌患者無病生存期的危險因素。Wushou 等[13]分析相關文獻并系統評價：Twist 的表達確實導致包括食管鱗癌在內的多種惡性腫瘤患者總生存期縮短。但我們本次研究中隨訪調查中定義的終點事件是患者出現腫瘤復發，即為無病生存期。目前所查文獻中 Twist 與食管鱗癌患者無病生存期之間的關系目前研究報道甚少。因此 Twist 與食管鱗癌患者無病生存期之間的關系還需更大樣本研究，更詳細隨訪，方可得到可信度更高的結論。
?
綜上，Twist 在食管鱗癌患者腫瘤細胞中的陽性表達與患者脈管內出現瘤栓、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、患者無病生存期這些臨床資料和預后無關。Twist 在腫瘤細胞和脈管瘤栓的表達有一致性，其在淋巴管瘤栓和脈管瘤栓內的表達并無選擇性。Twist 對食管鱗癌患者的影響還需進一步探究。
食管癌是我國排名第 4 的致死性疾病，每年約有 15 萬人死于此病，鱗狀細胞癌（鱗癌）是主要病理類型，占 90% 以上，其次為腺癌[1]。食管癌患者術后 5 年生存率僅為 20%～30%，術后腫瘤復發和轉移是低生存率的主要原因[2]。Twist 蛋白由 Twist 基因轉錄表達形成，通過調節 p53 依賴和非 p53 依賴途徑，Akt 途徑，JNK 途徑等抑制腫瘤細胞凋亡，促使腫瘤細胞增殖[3-5]。
現有研究證實 Twist 通過介導上皮-間充質細胞轉化的發育，使腫瘤失去上皮細胞的粘附，增加了腫瘤的侵襲性和轉移性[6]。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取 2010 年 6 月至 2012 年 6 月四川省腫瘤醫院胸外科一病區經同一小組醫師行食管切除術的 70 例食管鱗癌患者的術后石蠟標本，其中男 39 例、女 31 例，平均年齡 63.6 歲。另切取該入組患者的正常食管組織（即距腫瘤邊緣大于 5 cm 的食管組織）作為對照組。70例患者中 35 例標本脈管瘤栓陽性，35 例標本脈管瘤栓陰性，所有患者術前均未行放化療及其它抗腫瘤治療。胸上段食管癌 12 例，胸中段食管癌 37 例，胸下段食管癌 21 例，術后病理均為鱗癌。根據 WHO 組織學分類，高分化鱗癌 15 例，中分化鱗癌 24 例，低分化鱗癌 31 例。根據國際抗癌聯盟 2007 年 TNM 分期標準，Ⅰ～Ⅱ 期 41 例，Ⅲ 期 29 例，無 Ⅳ 期患者標本。所有納入研究病例臨床資料和隨訪資料均完整。
1.2 主要試劑
兔抗人 Twist 多克隆抗體、兔抗人 D2-40 單克隆抗體由艾博抗（上海）貿易有限公司；0.01 M 磷酸鹽緩沖液（PBS）、枸櫞酸組織抗原修復液、抗體稀釋液由福州邁新生物技術公司提供；GTVisionTMⅢ 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑由基因科技（上海）有限公司生產。
1.3 方法
1.3.1 切片準備
選擇符合條件的石蠟標本，切成厚約 4 μm 的薄片。每張石蠟塊切 4 張片[Twist，蘇木精-伊紅染色（HE），D2-40，空白對照片各一張]。
1.3.2 石蠟切片脫蠟和水化
將備好的切片依次浸泡在二甲苯 Ⅰ、Ⅱ 溶液中 15 min，再依次放入濃度梯度為 100%、95%、80% 乙醇溶液中浸泡 2 min 完成脫蠟和水化過程。蒸餾水反復沖洗后再用 PBS（0.01 M，pH 7.5±0.1）充分沖洗。
1.3.3 抗原修復
將經上述方法處理過的切片浸泡在已加熱至恒溫 92℃～96℃ 的枸櫞酸鹽組織修復液（0.01 M，pH 6.0）中進行抗原修復。20 min 后取出用 PBS 溶液反復沖洗后，室溫下浸泡于濃度為 3% H2O2 溶液中 15 min，再用 PBS 反復沖洗切片以清除切片中的內源性過氧化物酶活性。
1.3.4 ?制片
每張石蠟切片分別加 1 滴兔血清工作液，常溫下 15 min。清除掉封閉用的兔血清后滴加羊抗人 Twist 多克隆一抗（工作濃度為 1∶200，抗體稀釋液稀釋），放置于 4℃ 濕盒內 12 h；對照組行相同處理。
1.3.5 ?染色
PBS 溶液反復沖洗后，滴加 l 滴通用型免疫組化染色劑[二抗與二氨基聯苯胺（DAB）染色一體試劑]，DAB 顯微鏡下控制染色，再用蒸餾水沖洗直至染色效果滿意。Harris 蘇木素染色后蒸餾水沖洗。
1.3.6 封片
分別在濃度梯度為 80%、95%、100% 乙醇溶液中浸泡 2 min 后于 60℃ 烘箱烘干；再于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中浸泡 10 min；中性樹膠封片。
1.3.7 結果判定
免疫組織化學結果采用半定量記分法判定，按陽性著色程度評分：0 分為無著色；1 分為淺黃色；2 分為棕色；3 分為棕褐色。再按陽性細胞所占比例評分：0 分為陰性；1 分為<10%；2 分為 11%～50%；3 分為 51% 以上，以兩者乘積判定結果：4 分以下（–），4～6 分（+），6～9 分（++），9 分以上（+++）。
1.4 統計學分析
使用 IBM SPSS22.0 統計軟件進行統計學分析。不同 Twist 表達組患者的無病生存率比較采用 Kaplan-Meier 法及 log-rank 檢驗。多因素預后分析采用 Cox 模型。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
Twist 陽性表達率在正常食管組織中和腫瘤組織中分別為 42.9%、77.1%，差異有統計學意義（P<0.05）。脈管瘤栓陽性和陰性的食管鱗癌患者腫瘤細胞中 Twist 陽性表達率分別為 74.3%、80.0%，差異無統計學意義（P>0.05）。Twist 在腫瘤細胞和在脈管瘤栓內陽性表達率分別為74.3%、71.4%，差異無統計學意義（P>0.05）。Twist 在脈管瘤栓陽性患者的淋巴管內和血管內表達分別為 56.0%、72.0%，差異無統計學意義（P>0.05）。
Twist 在腫瘤細胞中的陽性表達與食管鱗癌患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度（T 分期）、腫瘤分化程度、淋巴結轉移這些臨床病理特征之間無相關性（P>0.05）。
腫瘤細胞內 Twist 陰性表達的食管鱗癌患者平均無病生存期 8.3 個月；Twist 表達（+）食管鱗癌患者平均無病生存期 10.8 個月；Twist 表達（++）食管鱗癌患者平均無病生存期 8.8 個月；Twist 表達（+++）食管鱗癌患者平均無病生存期 9.6 個月（表 1）。通過 log-rank 檢驗，四組患者之間的無病生存期差異無統計學意義（P>0.05）；見圖 1。
表1
Twist 在食管鱗癌患者中不同表達強度與 FDS 之間的關系
圖1
Twist 在食管鱗癌患者中不同表達程度的生存曲線
Twist 在腫瘤細胞陽性表達和陰性表達分別為 26∶9；在脈管瘤栓內陽性表達和陰性表達分別為 25∶10。Twist 在食管鱗癌患者中，腫瘤細胞和脈管瘤栓陽性表達率分別為 74.3%、71.4%，差異無統計學意義（P>0.05），Twist 不同表達情況見圖 2。
圖2
Twist在不同部位的表達情況（HE×400） a. Twist 在脈管瘤栓內陽性表達； b. Twist 在腫瘤細胞內陽性表達； c. Twist 陰性表達； d. Twist 在正常食管黏膜陽性表達
3 討論
研究結果顯示食管鱗癌患者淋巴結轉移是影響預后的主要危險因素；食管鱗癌患者脈管內出現瘤栓與淋巴結轉移存在相關關系，是淋巴結轉移的獨立危險因素[7-9]。研究顯示正常食管組織與腫瘤細胞中 Twist 的表達存在差異，食管癌腫瘤細胞中 Twist 的表達明顯較正常食管黏膜組織中高[10]。本研究結果與之相符。Yang 等[6]研究表明，Twist 基因通過介導上皮-間充質細胞轉化的發育，使腫瘤失去上皮細胞的粘附，促進腫瘤侵襲和轉移。本研究中，脈管瘤栓陽性和陰性的食管鱗癌患者腫瘤細胞中 Twist 陽性表達率分別為 74.3%、80.0%，差異無統計學意義（P>0.05），提示 Twist 在腫瘤細胞內的表達與食管鱗癌患者脈管瘤栓無相關性。
本研究對 Twist 在脈管瘤栓陽性患者腫瘤細胞中和脈管瘤栓中的表達是否具有一致性進行了分析比較，其中 Twist 在食管鱗癌腫瘤細胞中的陽性表達率為 74.3%，脈管瘤栓中陽性表達率為 71.4%，兩者表達差異并無統計學意義（P>0.05），說明 Twist 在食管鱗癌腫瘤細胞中和脈管瘤栓中的表達具有一致性，提示 Twist 介導了腫瘤的轉移。作者考慮 Twist 的高表達是否將導致腫瘤對血管侵犯更加顯著。因此將食管鱗癌患者標本中的脈管瘤栓進一步分層，分為血管瘤栓和淋巴管瘤栓進行分層分析，結果顯示：食管鱗癌患者標本中 Twist 在淋巴管瘤栓內的陽性表達率和和血管內瘤栓的陽性表達率并無顯著差異（P>0.05），這說明 Twist 介導的腫瘤侵襲和轉移對淋巴管和血管并無顯著的選擇性。
Forghanifard 等[11]研究發現：Twist 高表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤分期存在正相關；而另一些研究結果則顯示 Twist 的高表達與食管鱗癌患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移并無相關性[12]。作者對本研究病例進行分層比較發現 Twist 在不同組食管鱗癌患者腫瘤細胞中的表達與性別、年齡、淋巴結是否轉移、腫瘤浸潤深度（T 分期）、腫瘤分化程度無相關性（P>0.05）。Twist 蛋白能夠促進腫瘤細胞分化，抑制細胞凋亡，能介導腫瘤細胞的侵襲和轉移，因此 Twist 的高表達可能會影響患者的預后。本研究中的隨訪數據統計分析顯示 Twist 表達為（–）、（+）、（++）（+++）的四組患者之間無病生存期差異無統計學意義。Cox 邏輯回歸生存分析顯示 Twist 陽性表達并不是影響食管鱗癌患者無病生存期的危險因素。Wushou 等[13]分析相關文獻并系統評價：Twist 的表達確實導致包括食管鱗癌在內的多種惡性腫瘤患者總生存期縮短。但我們本次研究中隨訪調查中定義的終點事件是患者出現腫瘤復發，即為無病生存期。目前所查文獻中 Twist 與食管鱗癌患者無病生存期之間的關系目前研究報道甚少。因此 Twist 與食管鱗癌患者無病生存期之間的關系還需更大樣本研究，更詳細隨訪，方可得到可信度更高的結論。
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綜上，Twist 在食管鱗癌患者腫瘤細胞中的陽性表達與患者脈管內出現瘤栓、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、患者無病生存期這些臨床資料和預后無關。Twist 在腫瘤細胞和脈管瘤栓的表達有一致性，其在淋巴管瘤栓和脈管瘤栓內的表達并無選擇性。Twist 對食管鱗癌患者的影響還需進一步探究。
