引用本文： 何銘, 朱愷, 段洪濤, 李鵬程, 閆小龍, 張志培, 李小飛. TGF-β1 和 TNF-α 協同刺激誘導人支氣管上皮細胞優化上皮間質轉化模型. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(3): 228-232. doi: 10.7507/1007-4848.201604063 復制
外傷、腫瘤及先天性的疾病造成的氣管損傷或是缺損在臨床上比較常見[1]。當氣管缺損較短時，可直接經行端-端吻合修復，然而當缺損大于 6 cm 時，必須尋找同種異體氣管組織或合適的氣管代替物進行修復，以維持氣道正常功能[2]。Grillo 首次進行了氣管移植重建的研究[3]。氣管移植后，移植體狹窄是目前臨床治療的瓶頸，有研究發現上皮間質轉化（EMT）及成纖維細胞的纖維性修復可能是移植體狹窄的主要形成原因[4-6]。
EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉化成為具有間質表型細胞的生物學過程，在胚胎發育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉移和纖維化疾病等多種生物學過程中發揮著重要作用[7]。在 EMT 過程中，上皮細胞失去細胞極性、失去與基底膜連接的上皮表型，獲得了較高遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質等間質表型，通常我們將與組織損傷修復，再生和器官纖維化相關的 EMT 定義為 2 型 EMT[8]。研究發現，當炎癥損傷時，巨噬細胞、活化的成纖維細胞和損傷的上皮細胞，都通過釋放大量的生長因子，趨化因子和基質蛋白酶，其中包括轉化細胞生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在內的多種因子，從而啟動 2 型 EMT[9-10]。TGF-β1 通過經典和非經典的 Smad 信號通路來實現誘導 EMT 的過程[11]。而 TNF-α在器官組織纖維化的過程中同樣扮演著重要角色[12]。研究表明，TNF-α與 TGF-β1 相互協同激活的轉化生長因子-B 激活激酶 1（transforming growth factor-1，TAK1）是氣管上皮間質轉化的重要調控因子，并參與免疫細胞活化[13]。本研究將使用 TNF-α與 TGF-β1 協同刺激人支氣管上皮（human bronchial epithelial，HBE）細胞，觀察其細胞形態，遷移和增殖能力變化，判斷是否更容易發生 EMT，為以后進一步研究 EMT 過程和如何有效防止氣管移植體狹窄提供新的理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
TGF-β1、TNF-α購買自 Sigma 公司。HBE 細胞來源于 ATCC 細胞庫。細胞在含有 1% 的鏈青霉素，10% 的胎牛血清的高糖 DMEM 培養液，于 37℃、5%CO2 的培養箱中培養細胞，用含有 0.02%EDTA 的胰酶進行消化傳代，DMEM 培養基使用 PBS 配制，022 μm 和 0.45 μm 濾紙過濾備用；細胞增殖與活性檢測的 CCK8 試劑盒購買自壯志生物有限公司，二辛可寧酸法（BCA）蛋白提取試劑盒購買于碧云天公司。兔抗β-actin 購買自 abcam 公司，兔抗 E-cadherin 和 Vimentin 購買自 abcam 公司。抗兔二抗購買自碧云天公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞形態學改變 將 HBE 細胞接種到六孔板中，每孔細胞的濃度為 2×105/ml，培養基培養 24 h 后，加入不同刺激因素：空白對照組、TGF-β1 10 ng/ml 組、TNF-α10 ng/ml 組、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α10 ng/ml 組，繼續培養 24 h 后在光鏡下拍照觀察細胞形態改變。
1.2.2 細胞增殖抑制曲線 將 HBE 細胞以每孔 1×104/ml 濃度接種到 96 孔板中，培養 24 h 后，換成不同刺激因素：TGF-β1、TNF-α、TGF-β1+TNF-α、1%FCS、10%FCS，培養 24 h 后（每組設 5 個副孔），每孔加入 10 μl 的 CCK8 試劑，在 37℃、5%CO2 中孵育 2 h，用酶標儀在 570 nm 處測量吸光度 A，同時設無細胞的培養液作為空白對照。計算細胞增殖抑制率并繪制曲線，IF=（對照組 A-實驗組 A）/（對照組 A-空白組 A）。
1.2.3 體外劃痕檢測細胞遷移能力 在對數期生長的細胞用 0.02%EDTA 胰酶消化后，以 2×105/ml 的密度接種到六孔板中，用含 10% 胎牛血清的高糖的 DMEM 培養液培養，待細胞生長到 70%～80% 后，加入不同刺激因素：空白對照、TGF-β1 10 ng/ml、TNF-α 10 ng/ml、TGF-β1+TNF-α 處理 24 h 后，除去培養液，使用 20 μl Eppendorf Tip 在細胞板中劃痕，造成損傷模型，用無菌 PBS 沖洗刮掉的細胞，再使用無血清培養液培養 24 h 后，在倒置顯微鏡下觀察。
1.2.4 免疫印跡定量分析 將細胞接種到六孔板中，密度為 2×105/ml，10% 胎牛血清的高糖 DMEM，于 37℃、5%CO2 溫箱中培養，待細胞生長到 70%～80% 左右，換無血清培養液過夜培育，再分別予以不同刺激因素處理，空白對照、TGF-β1 10 ng/ml、TNF-α 10 ng/ml、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α 10 ng/ml，處理細胞 24 h 后，使用 RIPA 裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，使用 BCA 試劑盒對蛋白濃度定量，后進行 SDS-PAGE 電泳，電轉蛋白到 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉固定，分別加入抗人 E-cadherin、Vimentin，多克隆抗體（1∶1000）4 ℃ 孵育過夜，第 2 d TBST 清洗，酶標二抗（1∶7500）室溫搖床 1 h，TBST 洗滌，顯色。用 β-actin 作為對照，進行定量分析。
1.3 統計學分析
采用 SPSS19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（ ）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較選擇 SNK 法，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 細胞形態改變
倒置顯微鏡下發現，TGF-β1 10 ng/ml 組、TNF-α 10 ng/ml 組、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α10 ng/ml 組細胞都出現了不同程度的形態變化。對照組中正常細胞形態呈鵝卵石樣，細胞間連接緊密，邊界清晰；而處理組中均出現了細胞形態梭形變，細胞間隙增寬，邊界模糊。其中 TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α 10 ng/ml 組的變化較為明顯（圖 1）。
圖1
不同刺激因素作用 HBE 細胞 24 h 后形態變化情況 ×200
2.2 細胞增殖抑制曲線
CCK-8 檢測不同刺激因素下，1%FCS、TGF-β1、TNF-α、TGF-β1+TNF-α、10%FCS，24 h 后 HBE 細胞吸光度值的變化差異有統計學意義（F=13.71，P<0.05），各組測量的吸光度值分別是 0.92±0.23、1.31±0.14、1.44±0.17、2.18±0.21、2.72±0.78（圖 2）。
圖2
不同刺激因素作用 HBE 細胞 24 h 后細胞增殖情況
2.3 體外劃痕實驗
不同刺激因素 TGF-β1 10ng/ml、TNF-α 10 ng/ml、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α 10 ng/ml 作用 24 h 后劃痕間距大小發生改變，TGF-β1+TNF-α組劃痕間距明顯變小。各組劃痕間距差異有統計學意義（F=18.31，P<0.05）。空白對照組、TGF-β1 10 ng/ml 組、TNF-α 10 ng/ml 組、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α 10 ng/ml 組的細胞遷移距離測量值分別為（420.06±10.38）μm、（499.86±34.00）μm、（514.93±10.56）μm 和（569.68±33.58）μm。TGF-β1+TNF-α 組與對照組、TGF-β1、TNF-α的差異有統計學意義（P<0.05，圖 3）。
圖3
不同刺激因素作用 HBE 細胞 24 h 細胞劃痕中遷移能力的變化 ×200
2.4 免疫印跡定量分析
TGF-β1、TNF-α、TGF-β1+TNF-α、空白對照處理 HBE 細胞 24 h 后，細胞中 E-cadherin 蛋白表達情況發生變化，其灰度值差異有統計學意義（F =58.28，P<0.05）。不同處理組的分別為 1.67±0.19、1.43±0.22、0.99±0.07、2.63±0.07。其中 TGF-β1+TNF-α組與 TGF-β1 組、TNF-α組的差異有統計學意義（P<0.05）。細胞中 Vimentin 蛋白表達情況有差異（圖 4），其灰度值因不同處理因素而發生變化，差異有統計學意義（F=84.60，P<0.05）。不同處理組的灰度值分別為 1.29±0.20、1.76±0.21、3.27±0.20、1.20±0.05，其中 TGF-β1 +TNF-α 組與 TGF-β1 組、TNF-α 組的差異有統計學意義（P<0.05，圖 5）。
圖4
不同刺激因素作用 HBE 細胞 24 h 后，細胞上皮標志物和間質標志物的表達情況
圖5
E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表達的灰度值
3 討論
氣管上皮細胞間質轉化是氣管移植體狹窄最可能的原因[14]，氣管上皮細胞獲得間質表型，包括細胞極性消失、細胞形態學變化、上皮標志物表達下調、間質標志物表達上調、細胞遷移和增殖能力增加等，加劇了氣管移植體處成纖維細胞和肌成纖維細胞的形成[15-16]。有研究表明 TGF-β 和 TNF-α 在器官組織纖維化的過程中起重要作用，TNF-α 和 TGF-β1 均可活化 TGF-β 激酶 1（TAK1），上調磷酸化 TAK1 的表達[17]。所以推測 TGF-β1 和 TNF-α 可協同刺激 HBE 細胞 EMT 過程。我們的研究中用 TGF-β1 10 ng/ml、TNF-α 10 ng/ml、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α 10 ng/ml 分別誘導 HBE 細胞 24 h 后，TGF-β1 和 TNF-α 協同誘導組細胞呈明顯梭形，細胞間隙明顯增寬，邊界模糊。這提示 TGF-β1 和 TNF-α 協同誘導 HBE 細胞比單獨使用 TGF-β1 或 TNF-α 誘導細胞間的粘附能力、細胞間連接、細胞形態學改變效果更顯著。CCK-8 實驗檢測細胞增殖能力結果提示，TGF-β1 和 TNF-α 協同誘導 HBE 細胞比單獨使用 TGF-β1 或 TNF-α誘導細胞增殖明顯增強。體外劃痕實驗結果提示，TGF-β1 和 TNF-α 協同誘導 HBE 細胞比單獨 TGF-β1 或 TNF-α 誘導 HBE 細胞遷移能力明顯增強。
前期在組織胚胎或是多種腫瘤細胞中的大量研究表明，TGF-β1 和 TNF-α 均可刺激細胞發生 EMT，增加腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。同時伴隨著細胞的上皮標志物 E-cadherin 等蛋白的表達出現下調，間質標志物 Vimentin 蛋白出現上調[18-19]。我們的研究中，在 TGF-β1+TNF-α 刺激下，HBE 細胞上皮標志物和間質標志物的表達情況比單獨使用 TGF-β1 或 TNF-α 誘導 HBE 細胞存在明顯差異。我們的前期研究顯示細胞發生 EMT 的標準改變包括上皮標志物消失、間質標志物出現、細胞形態呈現梭形、細胞間連接不緊密，極性消失，細胞遷移能力改變，當除去刺激因素后，細胞上述表型變現穩定等標準[20]，我們可以認為 TGF-β1 和 TNF-α 協同刺激 HBE 細胞比單獨使用 TGF-β1 或 TNF-α 刺激，上述 EMT 改變的標準指標發生更明顯的變化。因此，TGF-β1 和 TNF-α 協同刺激 HBE 細胞可以優化 EMT 細胞模型。
外傷、腫瘤及先天性的疾病造成的氣管損傷或是缺損在臨床上比較常見[1]。當氣管缺損較短時，可直接經行端-端吻合修復，然而當缺損大于 6 cm 時，必須尋找同種異體氣管組織或合適的氣管代替物進行修復，以維持氣道正常功能[2]。Grillo 首次進行了氣管移植重建的研究[3]。氣管移植后，移植體狹窄是目前臨床治療的瓶頸，有研究發現上皮間質轉化（EMT）及成纖維細胞的纖維性修復可能是移植體狹窄的主要形成原因[4-6]。
EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉化成為具有間質表型細胞的生物學過程，在胚胎發育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉移和纖維化疾病等多種生物學過程中發揮著重要作用[7]。在 EMT 過程中，上皮細胞失去細胞極性、失去與基底膜連接的上皮表型，獲得了較高遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質等間質表型，通常我們將與組織損傷修復，再生和器官纖維化相關的 EMT 定義為 2 型 EMT[8]。研究發現，當炎癥損傷時，巨噬細胞、活化的成纖維細胞和損傷的上皮細胞，都通過釋放大量的生長因子，趨化因子和基質蛋白酶，其中包括轉化細胞生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在內的多種因子，從而啟動 2 型 EMT[9-10]。TGF-β1 通過經典和非經典的 Smad 信號通路來實現誘導 EMT 的過程[11]。而 TNF-α在器官組織纖維化的過程中同樣扮演著重要角色[12]。研究表明，TNF-α與 TGF-β1 相互協同激活的轉化生長因子-B 激活激酶 1（transforming growth factor-1，TAK1）是氣管上皮間質轉化的重要調控因子，并參與免疫細胞活化[13]。本研究將使用 TNF-α與 TGF-β1 協同刺激人支氣管上皮（human bronchial epithelial，HBE）細胞，觀察其細胞形態，遷移和增殖能力變化，判斷是否更容易發生 EMT，為以后進一步研究 EMT 過程和如何有效防止氣管移植體狹窄提供新的理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
TGF-β1、TNF-α購買自 Sigma 公司。HBE 細胞來源于 ATCC 細胞庫。細胞在含有 1% 的鏈青霉素，10% 的胎牛血清的高糖 DMEM 培養液，于 37℃、5%CO2 的培養箱中培養細胞，用含有 0.02%EDTA 的胰酶進行消化傳代，DMEM 培養基使用 PBS 配制，022 μm 和 0.45 μm 濾紙過濾備用；細胞增殖與活性檢測的 CCK8 試劑盒購買自壯志生物有限公司，二辛可寧酸法（BCA）蛋白提取試劑盒購買于碧云天公司。兔抗β-actin 購買自 abcam 公司，兔抗 E-cadherin 和 Vimentin 購買自 abcam 公司。抗兔二抗購買自碧云天公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞形態學改變 將 HBE 細胞接種到六孔板中，每孔細胞的濃度為 2×105/ml，培養基培養 24 h 后，加入不同刺激因素：空白對照組、TGF-β1 10 ng/ml 組、TNF-α10 ng/ml 組、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α10 ng/ml 組，繼續培養 24 h 后在光鏡下拍照觀察細胞形態改變。
1.2.2 細胞增殖抑制曲線 將 HBE 細胞以每孔 1×104/ml 濃度接種到 96 孔板中，培養 24 h 后，換成不同刺激因素：TGF-β1、TNF-α、TGF-β1+TNF-α、1%FCS、10%FCS，培養 24 h 后（每組設 5 個副孔），每孔加入 10 μl 的 CCK8 試劑，在 37℃、5%CO2 中孵育 2 h，用酶標儀在 570 nm 處測量吸光度 A，同時設無細胞的培養液作為空白對照。計算細胞增殖抑制率并繪制曲線，IF=（對照組 A-實驗組 A）/（對照組 A-空白組 A）。
1.2.3 體外劃痕檢測細胞遷移能力 在對數期生長的細胞用 0.02%EDTA 胰酶消化后，以 2×105/ml 的密度接種到六孔板中，用含 10% 胎牛血清的高糖的 DMEM 培養液培養，待細胞生長到 70%～80% 后，加入不同刺激因素：空白對照、TGF-β1 10 ng/ml、TNF-α 10 ng/ml、TGF-β1+TNF-α 處理 24 h 后，除去培養液，使用 20 μl Eppendorf Tip 在細胞板中劃痕，造成損傷模型，用無菌 PBS 沖洗刮掉的細胞，再使用無血清培養液培養 24 h 后，在倒置顯微鏡下觀察。
1.2.4 免疫印跡定量分析 將細胞接種到六孔板中，密度為 2×105/ml，10% 胎牛血清的高糖 DMEM，于 37℃、5%CO2 溫箱中培養，待細胞生長到 70%～80% 左右，換無血清培養液過夜培育，再分別予以不同刺激因素處理，空白對照、TGF-β1 10 ng/ml、TNF-α 10 ng/ml、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α 10 ng/ml，處理細胞 24 h 后，使用 RIPA 裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，使用 BCA 試劑盒對蛋白濃度定量，后進行 SDS-PAGE 電泳，電轉蛋白到 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉固定，分別加入抗人 E-cadherin、Vimentin，多克隆抗體（1∶1000）4 ℃ 孵育過夜，第 2 d TBST 清洗，酶標二抗（1∶7500）室溫搖床 1 h，TBST 洗滌，顯色。用 β-actin 作為對照，進行定量分析。
1.3 統計學分析
采用 SPSS19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（ ）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較選擇 SNK 法，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 細胞形態改變
倒置顯微鏡下發現，TGF-β1 10 ng/ml 組、TNF-α 10 ng/ml 組、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α10 ng/ml 組細胞都出現了不同程度的形態變化。對照組中正常細胞形態呈鵝卵石樣，細胞間連接緊密，邊界清晰；而處理組中均出現了細胞形態梭形變，細胞間隙增寬，邊界模糊。其中 TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α 10 ng/ml 組的變化較為明顯（圖 1）。
圖1
不同刺激因素作用 HBE 細胞 24 h 后形態變化情況 ×200
2.2 細胞增殖抑制曲線
CCK-8 檢測不同刺激因素下，1%FCS、TGF-β1、TNF-α、TGF-β1+TNF-α、10%FCS，24 h 后 HBE 細胞吸光度值的變化差異有統計學意義（F=13.71，P<0.05），各組測量的吸光度值分別是 0.92±0.23、1.31±0.14、1.44±0.17、2.18±0.21、2.72±0.78（圖 2）。
圖2
不同刺激因素作用 HBE 細胞 24 h 后細胞增殖情況
2.3 體外劃痕實驗
不同刺激因素 TGF-β1 10ng/ml、TNF-α 10 ng/ml、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α 10 ng/ml 作用 24 h 后劃痕間距大小發生改變，TGF-β1+TNF-α組劃痕間距明顯變小。各組劃痕間距差異有統計學意義（F=18.31，P<0.05）。空白對照組、TGF-β1 10 ng/ml 組、TNF-α 10 ng/ml 組、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α 10 ng/ml 組的細胞遷移距離測量值分別為（420.06±10.38）μm、（499.86±34.00）μm、（514.93±10.56）μm 和（569.68±33.58）μm。TGF-β1+TNF-α 組與對照組、TGF-β1、TNF-α的差異有統計學意義（P<0.05，圖 3）。
圖3
不同刺激因素作用 HBE 細胞 24 h 細胞劃痕中遷移能力的變化 ×200
2.4 免疫印跡定量分析
TGF-β1、TNF-α、TGF-β1+TNF-α、空白對照處理 HBE 細胞 24 h 后，細胞中 E-cadherin 蛋白表達情況發生變化，其灰度值差異有統計學意義（F =58.28，P<0.05）。不同處理組的分別為 1.67±0.19、1.43±0.22、0.99±0.07、2.63±0.07。其中 TGF-β1+TNF-α組與 TGF-β1 組、TNF-α組的差異有統計學意義（P<0.05）。細胞中 Vimentin 蛋白表達情況有差異（圖 4），其灰度值因不同處理因素而發生變化，差異有統計學意義（F=84.60，P<0.05）。不同處理組的灰度值分別為 1.29±0.20、1.76±0.21、3.27±0.20、1.20±0.05，其中 TGF-β1 +TNF-α 組與 TGF-β1 組、TNF-α 組的差異有統計學意義（P<0.05，圖 5）。
圖4
不同刺激因素作用 HBE 細胞 24 h 后，細胞上皮標志物和間質標志物的表達情況
圖5
E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表達的灰度值
3 討論
氣管上皮細胞間質轉化是氣管移植體狹窄最可能的原因[14]，氣管上皮細胞獲得間質表型，包括細胞極性消失、細胞形態學變化、上皮標志物表達下調、間質標志物表達上調、細胞遷移和增殖能力增加等，加劇了氣管移植體處成纖維細胞和肌成纖維細胞的形成[15-16]。有研究表明 TGF-β 和 TNF-α 在器官組織纖維化的過程中起重要作用，TNF-α 和 TGF-β1 均可活化 TGF-β 激酶 1（TAK1），上調磷酸化 TAK1 的表達[17]。所以推測 TGF-β1 和 TNF-α 可協同刺激 HBE 細胞 EMT 過程。我們的研究中用 TGF-β1 10 ng/ml、TNF-α 10 ng/ml、TGF-β1 10 ng/ml+TNF-α 10 ng/ml 分別誘導 HBE 細胞 24 h 后，TGF-β1 和 TNF-α 協同誘導組細胞呈明顯梭形，細胞間隙明顯增寬，邊界模糊。這提示 TGF-β1 和 TNF-α 協同誘導 HBE 細胞比單獨使用 TGF-β1 或 TNF-α 誘導細胞間的粘附能力、細胞間連接、細胞形態學改變效果更顯著。CCK-8 實驗檢測細胞增殖能力結果提示，TGF-β1 和 TNF-α 協同誘導 HBE 細胞比單獨使用 TGF-β1 或 TNF-α誘導細胞增殖明顯增強。體外劃痕實驗結果提示，TGF-β1 和 TNF-α 協同誘導 HBE 細胞比單獨 TGF-β1 或 TNF-α 誘導 HBE 細胞遷移能力明顯增強。
前期在組織胚胎或是多種腫瘤細胞中的大量研究表明，TGF-β1 和 TNF-α 均可刺激細胞發生 EMT，增加腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。同時伴隨著細胞的上皮標志物 E-cadherin 等蛋白的表達出現下調，間質標志物 Vimentin 蛋白出現上調[18-19]。我們的研究中，在 TGF-β1+TNF-α 刺激下，HBE 細胞上皮標志物和間質標志物的表達情況比單獨使用 TGF-β1 或 TNF-α 誘導 HBE 細胞存在明顯差異。我們的前期研究顯示細胞發生 EMT 的標準改變包括上皮標志物消失、間質標志物出現、細胞形態呈現梭形、細胞間連接不緊密，極性消失，細胞遷移能力改變，當除去刺激因素后，細胞上述表型變現穩定等標準[20]，我們可以認為 TGF-β1 和 TNF-α 協同刺激 HBE 細胞比單獨使用 TGF-β1 或 TNF-α 刺激，上述 EMT 改變的標準指標發生更明顯的變化。因此，TGF-β1 和 TNF-α 協同刺激 HBE 細胞可以優化 EMT 細胞模型。
