工程化心肌補片（engineered heart tissues，EHTs）目前已成為心肌修復、再生的希望所在，但如何能實現移植物的快速血管化卻一直是影響其走入臨床的“瓶頸”問題之一。本文將綜合探討近幾年 EHTs 血管化策略的進展，以期為最終克服移植物血供限制，推動 EHTs 走入臨床探索出一條新路。
引用本文： 蔡俊, 康凱, 蔣樹林. 從生物學誘導到工程化組裝—— 組織工程心肌血管化的研究現狀及展望. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(9): 730-734. doi: 10.7507/1007-4848.201604031 復制
在人體組織中，心肌是血管密度最高，代謝最為旺盛的組織結構。因此，以“模擬人體心肌組織結構和功能”為目標的工程化心肌補片（engieered heart tissues，EHTs）研究就必須解決“移植物血管化”這一難題[1]。這種移植物的血管化包括兩方面的含義：（1）構建移植物內在的，具有灌注功能的成熟血管網絡；（2）實現移植后，移植物與宿主血管網絡的快速吻合和長期整合。由于宿主血管具有自然的侵入移植物生長的特點，故最初的研究策略主要是通過定時定向的傳遞特定細胞、生長因子或基因等生物學方法來加速這一過程而實現[2-4]；隨著我們對這一概念理解的不斷深入以及相關技術的不斷進步，以細胞片層疊加，微模塊組裝等為特征的工程學理念日益滲透其間。我們將以這一發展過程為脈絡，系統總結 EHTs 的血管化研究策略。
1 以生物學理念促進 EHTs 的血管化策略
1.1 以內皮細胞或內皮前體細胞為基礎的細胞共培養策略
基于內皮細胞（endothelial cells，ECs）是組成血管最為重要的細胞成分，故早期的促移植物血管化策略就是采用 ECs 作為種子細胞以提供血管形成所需要的細胞成分[5]。進一步的研究顯示，與 ECs 的單獨培養比較，將 ECs 與血管平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）等血管周細胞（pericytes）共同培養可提供更加穩定，成熟的脈管結構[6]。此外，Hudon 等[7]的研究也證實，將成纖維細胞（fibroblast cells，FBCs），ECs 以及 FBCs 分泌的細胞外基質（extracellar matrix，ECM）共培養后，工程化組織獲得了更穩定、更成熟的血管網絡形成。此外，Tsigkou 等[8]的研究還證實，將人的臍帶內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）與人骨髓來源的基質干細胞（bone marrow derived human mesenchymal stem cells，BM-hMSCs）共同培養于含有纖維連接蛋白的膠原支架上，植入小鼠裸鼠 4 d 后即有了穩定的血管結構形成，11 d 后與宿主血管實現相通。這里，hMSCs 除了本身像周細胞一樣為新生血管提供支持外，還可以通過旁分泌作用誘導細胞歸巢，從而加速血管形成[9]。這一實驗的意義在于，從臨床角度而言，獲取足夠數量的自體 hMSCs 較其他血管周細胞更為容易和現實。
考慮體內新生血管形成的現實情況，采用其他細胞或細胞組合與 ECs 共培養以獲得更好的組織血管化似乎是一個更明智的選擇。但究竟采用何種細胞進行共培養，共培養的細胞應采用何種方式植入基質目前還無定論，需要進一步的研究來提升我們對這一問題的認識。
1.2 生長因子、基因或 RNA 調控策略
當前，采用何種方式將何種生長因子或其組合在何時輸送給缺血心肌尚無定論，但血管源性的生長因子是可以促進缺血心肌的血管化卻是業界的共識。不過，由于生長因子的半衰期多較短，單次局部給藥并不能產生明顯的藥理效果；若通過靜脈或其它途徑持續全身給藥，又有誘發潛在腫瘤的風險。故建立一種可持續、緩慢、局部、定向給藥的生長因子釋放平臺，在提供移植細胞載體的同時又能促進載體及周圍組織的血管形成就成為了理想治療策略。例如 Steffens 等[10]及 Lee 等[11]的團隊分別采取不同技術將血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）結合于肝素化的膠原基質或巖藻酸凝膠上，在體實驗都取得較好的促血管形成效果。Kang 等[12]則采用“碳化二亞胺法”將 VEGF 及堿性成纖維因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）共價結合于膠原海綿上，用其行左室成形術后也更好地促進了補片及周圍組織功能小動脈的形成。
當然，由于局部定位給藥技術的復雜性，各種生長因子藥代動力學監測的困難性，以及為保持生長因子水平所需的高成本等因素都限制了該技術臨床應用的現實性。因此，另一些學者開始探索利用基因轉染技術提高生長因子的局部表達的促血管生成策略。
該方法主要將編碼某種促血管因子的基因片段（目前主要是 VEGF）通過基因載體（質粒 DNA、腺病毒、腺相關病毒）整合進心肌細胞，通過生長因子內源性的生成釋放來促進移植物的再血管化進程[4]。為了解決這一方法轉染率低，表達周期短及表達蛋白效能不確定等問題，Melly 等[13]發明了一種高通量的細胞分選方法，采用這種方法可以高效篩選已被轉染的，能夠適量表達 VEGF 的肌母祖細胞。將利用這一技術篩選出的脂肪干細胞注入缺血的心肌組織，梗死心肌取得了更好的血管再生和功能改善。Marsano 等[14]采用類似技術將分選的，已轉染 VEGF 基因的肌母細胞種植于一 1 mm 厚的彈性補片上并植入缺血心肌，結果種子細胞內源性促血管生成能力使得補片獲得了正常心肌的再血管化效果。
此外，鑒于內源性非編碼 RNA，即微小 RNA（micro-RNA）廣泛的生物學活性，通過調控促血管生長因子生成的微小 RNA 以調控血管再生成為了一個嶄新的治療策略。例如，通過抑制 microRNA-24 的生成，Meloni 等[15]改善了心肌梗死小鼠心肌的血管再生，左室重構以及心臟功能。Zangi 等[16]則通過心肌注射合成的改良 RNA 促進了 VEGF-A 的“脈沖式”生成，通過加強的旁分泌信號通路改善了梗死心肌的血管再生以及心肌梗死后心臟的收縮功能。RNA 療法的優勢在于其可局部靶向施治，較高的轉染率以及基因調節影響可定時實現等。
1.3 調控活性生物支架及水凝膠策略
通過調控天然或人工合成材料，使其更有利于移植細胞生存或誘導宿主細胞歸巢，進而促進移植物血管化是近年興起的另一項研究策略。利用醋酸纖維素制作的中空纖維裝置，Tengood 等[17]將兩種促血管生成因子 bFGF 和血小板衍化生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）與之結合并順序釋放，從而更好地刺激了小鼠皮下成熟血管的形成。Davis 等[18]將可注射的自組裝納米纖維肽鏈 AcN-RARADADARARADADA-CNH2 注射入心肌后，其局部形成了一個可促進 ECs 歸巢的微環境，促進了梗死心肌的局部血管形成并改善了局部心肌細胞的生存率。Zhang 等[19]構建了一種含有膠原蛋白結合域（collagen-binding domain，CBD）的 VEGF 因子。之后無論是將其直接注射于梗死的心肌[19]，還是將其涂于膠原補片的表面再覆蓋于梗死的心肌[20]，均顯著增加了梗死心肌處的新生血管密度。
Hydrogel 膠是一種親水性的高分子聚合物，常呈水凝膠狀態存在，具有良好的組織相容性，可與各種生長因子混合并與細胞組成懸液，心內移植后可增加細胞的局部存留并延長生長因子的半衰期。Wu 等[21]將其與 VEGF 化學結合后注射于梗死心肌附近，明顯延長了 VEGF 的作用半衰期，改善了局部血運。Miyagi 等[22]則將含有基質細胞衍生因子（stromal cell-derived factor，SDF）、MSCs 的 hydrogel 溶液注射于行左室成形術的補片周圍，4 周后，補片周圍組織的血管再生獲得了明顯改善。水凝膠技術操作簡單，極易于小型化、自動化生產，其缺點是與固態基質相比，其生物力學性能太差[23]。
1.4 體內異位移植預血管化策略
在心臟修補前，將 EHTs 植入體內血運豐富部位進行“預血管化”處理也是一種常用策略。Dvir 等[24]將心肌細胞植入結合有生長因子的鹽藻酸補片，并將補片異位移植于大網膜 7 d 后移植于梗死心肌的表面，4 周后，補片與宿主心肌實現了結構和電生理的整合。Zhang 等[25]是將大鼠左心耳心肌被覆大網膜后移植于大鼠梗死心肌表面，4 周后，梗死邊緣的心肌血管再生獲得了明顯改善，并伴隨著基質金屬蛋白酶和內皮素的明顯下降。而 Huang 等[26]則是直接利用大網膜作心肌補片，也取得了類似的治療效果。另一個預血管化的著名的實驗是由 Morritt 等[27]利用動靜脈環（A-V loop）模型來實現的。研究團隊將新生大鼠心肌細胞與膠原凝膠共置于一小室內，皮下植入大鼠腹股溝部的動靜脈環周圍，動靜脈環內流動的血液提供了心肌細胞代謝所需的必要物質。4～10 周后，上述組織長成為一個含有血管蒂，可自發收縮的，已被廣泛血管化了的心肌組織塊，該組織塊對電及血管活性藥刺激均呈現出生理反應。上述模型的缺點在于“預血管化”需要兩次額外的手術，且在植入心臟前組織塊要經歷一段短暫的“無灌注”過程。為解決上述問題，Sekine[28]及 Chiu等[29]分別在體外構建出了含有動靜脈血管蒂的組織血管床，在其上反復種植心肌細胞片層，均獲得了含有豐富血管，具有收縮功能的心肌組織塊。
2 以工程學理念促進 EHTs 的血管化策略
2.1 細胞片層疊加技術
將心肌細胞（cardiomyocytes，CMs）種植于涂備有溫敏物質的培養皿中，待細胞爬滿后，通過調控溫度變化，即可獲得具有收縮能力的單細胞片層，將上述 CMs 片層疊加，Shimizu 等[30]構造出了最早的具有收縮能力的三維心肌組織塊。為了更好地為心肌細胞提供血運，Sekine 等[31]還采用“三明治”方法，在兩層 CMs 片層間加入 ECs 片層，將這種 EHTs 植入缺血的心肌后，局部的新生血管生成獲得了明顯改善。隨后，Shimizu 等[32]發現，植入體內的 CMs 片層不能超過 3 層，否則外層的 CMs 會因缺血而死亡；但植入心臟表面的單細胞片層則在體內植入 3 d 后即可與宿主心肌建立血運聯系。因此，他們將單細胞片層在體內先進行預血管化，每 1～3 d 后開胸將細胞片層固定于上一片層表面，通過反復疊加，最后獲得了含有 12 個細胞片層，厚度近 1 mm 的心肌組織。當然，從臨床現實角度講，這種需反復開胸定植的 EHTs 是不可接受的，此外由于缺乏間質的支持，補片的機械性能也不值得信任。仍需要進一步的研究去優化這一技術方法。
2.2 微組織模塊組配策略
微組織模塊組配技術是工程學理念在 EHTs 構建中最突出的體現，它是伴隨著組織工程血管化的探索而發展起來的。由于既往的促血管化策略都是誘導血管“自外向內”長入組織，這就決定了所構建的 EHTs 的厚度及體積均受限制，因為 Radisic 等[33]研究已證實：如果沒有內生毛細血管網而僅依賴局部彌散的話，能保證移植細胞生存的組織塊的最大厚度僅為 150～200 μm。微模塊組配策略則體現了“自內向外”的血管化誘導思維。利用 ECs 片層包被微組織塊形成模塊單元，再將上述模塊單元按設計組裝成大的組織塊。由于各微組織模塊間均為 ECs 包被的間隙，可以允許血液灌注為各微組織塊提供代謝支持；此外，微組塊表面的 ECs 可快速連接，形成具有三維構象，有血液灌注功能的成熟血管網絡[34]。這一技術理念的最大優勢就是可以按設計構造任意大小的組織塊而不必顧慮其血運，但在實踐中它卻存在著諸多問題。首先，微組織塊內實質細胞的任何變化都會影響其表面 ECs 層結構的完整性[35]，而體內移植后 ECs 引發的免疫排斥反應則會使血管結構大量衰退[36]。盡管有研究顯示，MSCs 的加入可明顯減輕這種損傷[37]。其實，微模塊組配策略從促進移植物血管化角度講可能是成功的，但就 EHTs 的構建而言，它卻存在著先天的缺陷—— 由于表面上 ECs 的包被，各微組織塊間本質上是孤立的，但心肌組織本質上卻要求各細胞間均存在著連接，以實現同步的生物電傳導和向心的機械收縮。盡管如此，這一技術的發明仍有其突出的現實意義，因為它反映了組織工程概念中一個最本質的含義之一—— 將隨機的細胞連接變為可控的組織裝配。
2.3 血管網絡誘導發生策略
既往的一項研究證實[38]：如果 EHTs 內 ECs 構建的血管網絡能夠有序的分布的話，那么在體移植后，該血管網相較于那種自發無序生成的血管網更容易與宿主血管實現吻合，成熟及血液灌注。由此可見，EHTs 內血管的拓撲空間構型相較于血管密度更為重要。因此，也催生出了這種旨在實現新生血管更合理排布的促血管化策略。這種策略的基本思維就是利用當前微加工技術的進展，在 EHTs 構建的基質中刻畫出理想的血管網絡構型，然后將含有 ECs 的灌注液灌注其間，ECs 即可按照已規劃好的構型自發組裝成血管樣結構。Baranski 等[39]將采用該思路制備的血管網浸漬于含有實質細胞的 Hydrogel 中，形成一種具有血管合理布局的 EHTs。將其在體移植后 3 d，該血管網即與宿主血管實現吻合，并在之后的 4 周內迅速發育為具有灌注功能的成熟血管。
這種策略除了用來引導 ECs 按規劃來生成血管外，還用來引導含有血管的組織塊按規劃來生發新生血管。例如最近，Chiu等[29]設計了一個有趣的實驗：她們將分別含有動靜脈的組織塊相距一定距離進行體外培養，中間間隔以已刻畫好圖案的硅膠板，上述裝置置于含有胸腺素 β4，VEGF 和肝細胞生長因子（hepatic growth factor，HGF）的培養液中。2 周后，上述組織塊發出的新生血管按照刻畫好的圖案在硅膠板上生成了一個相互聯通的動靜脈血管床。在其上被覆心肌細胞片層，最后形成了一個已被充分血管化了的跳動的心肌組織塊。
2.4 血管網絡的人工構建策略
與以往指導血管網絡的組裝或生長不同，利用現代微流體技術、微加工工藝以及生物材料研究的不斷進展，人工合成具有合理空間布局的血管網絡的生物材料技術正方興未艾。這一策略的基本思路是選用合適的生物材料，利用微加工技術模擬天然血管網絡的拓撲構型構建人工血管槽網，再利用微流體技術將含有 ECs，SMCs，其他周細胞或/和實體細胞的灌流液灌注其間，以精確控制血管網絡的形成及空間布局。在體移植時，可以采用顯微外科技術將灌注點與宿主血管吻合，這樣移植后即刻，生物材料的內生血管網即可與宿主實現整合。上述構想的實現主要是依賴材料的進步來實現。例如：Kaihara 等[40]首先制作了硅的血管網絡模板，然后以聚二甲基硅氧烷（PDMS）成型，形成封閉的血管槽網，同時接種 ECs 以構成天然血管網。為克服上述材料不能降解的難題，Fidkowski 等[41]又以丙三醇葵二酸鹽（PGS）為材料，利用“軟光蝕刻技術”構建了一種可降解的，內襯以 ECs 的血管網絡。上述材料的優勢在于其卓越的機械性能及可加工性，但因為材料本身的結構問題（不允許生物大分子通過）限制了組織內細胞間的連接，而這對構建以實現“電-機械偶聯”為目標的 EHTs 而言不可接受。因此，許多學者又把目光轉到了 Hydrogel 膠上。Hydrogel 膠的應用使上述問題迎刃而解—— 無論是材料內的生物大分子的自由流動，還是其內細胞的相互連接及作用均不再是問題。例如：Golden 等[42]將用明膠構建的血管網包埋于含有細胞的 Hydrogel 膠中，然后升溫至生理水平以促進明膠溶解，殘留的血管槽可被凝膠中的 ECs 覆蓋形成血管結構。近來，利用 3D 打印技術，以碳水化合物玻璃為基質，Miller 等[43]采用上述方法實現了血管網絡的快速批量生產。目前，這種方法的主要局限在于組織內的細胞密度過低，壓實水凝膠雖可提高細胞密度，但更可能造成已構建血管系統的坍塌。此外，降解產物造成的局部靜水壓升高也會對組織內的細胞生存造成很大影響。
3 未來展望
當前，盡管 EHTs 的血管化研究已取得了長足的進展，但距構建出具有臨床實用價值，可完全替代自體心肌組織的 EHTs 這一目標而言，仍有相當長的一段路要走。工程化策略對指導脈管系統的體外組裝、構建頗具優勢，而生物學策略則有助于促進移植物內的脈管系統與宿主血管連接、整合及成熟。也許綜合利用兩者的優勢將是今后 EHTs 血管化研究的方向和目標。
在人體組織中，心肌是血管密度最高，代謝最為旺盛的組織結構。因此，以“模擬人體心肌組織結構和功能”為目標的工程化心肌補片（engieered heart tissues，EHTs）研究就必須解決“移植物血管化”這一難題[1]。這種移植物的血管化包括兩方面的含義：（1）構建移植物內在的，具有灌注功能的成熟血管網絡；（2）實現移植后，移植物與宿主血管網絡的快速吻合和長期整合。由于宿主血管具有自然的侵入移植物生長的特點，故最初的研究策略主要是通過定時定向的傳遞特定細胞、生長因子或基因等生物學方法來加速這一過程而實現[2-4]；隨著我們對這一概念理解的不斷深入以及相關技術的不斷進步，以細胞片層疊加，微模塊組裝等為特征的工程學理念日益滲透其間。我們將以這一發展過程為脈絡，系統總結 EHTs 的血管化研究策略。
1 以生物學理念促進 EHTs 的血管化策略
1.1 以內皮細胞或內皮前體細胞為基礎的細胞共培養策略
基于內皮細胞（endothelial cells，ECs）是組成血管最為重要的細胞成分，故早期的促移植物血管化策略就是采用 ECs 作為種子細胞以提供血管形成所需要的細胞成分[5]。進一步的研究顯示，與 ECs 的單獨培養比較，將 ECs 與血管平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）等血管周細胞（pericytes）共同培養可提供更加穩定，成熟的脈管結構[6]。此外，Hudon 等[7]的研究也證實，將成纖維細胞（fibroblast cells，FBCs），ECs 以及 FBCs 分泌的細胞外基質（extracellar matrix，ECM）共培養后，工程化組織獲得了更穩定、更成熟的血管網絡形成。此外，Tsigkou 等[8]的研究還證實，將人的臍帶內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）與人骨髓來源的基質干細胞（bone marrow derived human mesenchymal stem cells，BM-hMSCs）共同培養于含有纖維連接蛋白的膠原支架上，植入小鼠裸鼠 4 d 后即有了穩定的血管結構形成，11 d 后與宿主血管實現相通。這里，hMSCs 除了本身像周細胞一樣為新生血管提供支持外，還可以通過旁分泌作用誘導細胞歸巢，從而加速血管形成[9]。這一實驗的意義在于，從臨床角度而言，獲取足夠數量的自體 hMSCs 較其他血管周細胞更為容易和現實。
考慮體內新生血管形成的現實情況，采用其他細胞或細胞組合與 ECs 共培養以獲得更好的組織血管化似乎是一個更明智的選擇。但究竟采用何種細胞進行共培養，共培養的細胞應采用何種方式植入基質目前還無定論，需要進一步的研究來提升我們對這一問題的認識。
1.2 生長因子、基因或 RNA 調控策略
當前，采用何種方式將何種生長因子或其組合在何時輸送給缺血心肌尚無定論，但血管源性的生長因子是可以促進缺血心肌的血管化卻是業界的共識。不過，由于生長因子的半衰期多較短，單次局部給藥并不能產生明顯的藥理效果；若通過靜脈或其它途徑持續全身給藥，又有誘發潛在腫瘤的風險。故建立一種可持續、緩慢、局部、定向給藥的生長因子釋放平臺，在提供移植細胞載體的同時又能促進載體及周圍組織的血管形成就成為了理想治療策略。例如 Steffens 等[10]及 Lee 等[11]的團隊分別采取不同技術將血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）結合于肝素化的膠原基質或巖藻酸凝膠上，在體實驗都取得較好的促血管形成效果。Kang 等[12]則采用“碳化二亞胺法”將 VEGF 及堿性成纖維因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）共價結合于膠原海綿上，用其行左室成形術后也更好地促進了補片及周圍組織功能小動脈的形成。
當然，由于局部定位給藥技術的復雜性，各種生長因子藥代動力學監測的困難性，以及為保持生長因子水平所需的高成本等因素都限制了該技術臨床應用的現實性。因此，另一些學者開始探索利用基因轉染技術提高生長因子的局部表達的促血管生成策略。
該方法主要將編碼某種促血管因子的基因片段（目前主要是 VEGF）通過基因載體（質粒 DNA、腺病毒、腺相關病毒）整合進心肌細胞，通過生長因子內源性的生成釋放來促進移植物的再血管化進程[4]。為了解決這一方法轉染率低，表達周期短及表達蛋白效能不確定等問題，Melly 等[13]發明了一種高通量的細胞分選方法，采用這種方法可以高效篩選已被轉染的，能夠適量表達 VEGF 的肌母祖細胞。將利用這一技術篩選出的脂肪干細胞注入缺血的心肌組織，梗死心肌取得了更好的血管再生和功能改善。Marsano 等[14]采用類似技術將分選的，已轉染 VEGF 基因的肌母細胞種植于一 1 mm 厚的彈性補片上并植入缺血心肌，結果種子細胞內源性促血管生成能力使得補片獲得了正常心肌的再血管化效果。
此外，鑒于內源性非編碼 RNA，即微小 RNA（micro-RNA）廣泛的生物學活性，通過調控促血管生長因子生成的微小 RNA 以調控血管再生成為了一個嶄新的治療策略。例如，通過抑制 microRNA-24 的生成，Meloni 等[15]改善了心肌梗死小鼠心肌的血管再生，左室重構以及心臟功能。Zangi 等[16]則通過心肌注射合成的改良 RNA 促進了 VEGF-A 的“脈沖式”生成，通過加強的旁分泌信號通路改善了梗死心肌的血管再生以及心肌梗死后心臟的收縮功能。RNA 療法的優勢在于其可局部靶向施治，較高的轉染率以及基因調節影響可定時實現等。
1.3 調控活性生物支架及水凝膠策略
通過調控天然或人工合成材料，使其更有利于移植細胞生存或誘導宿主細胞歸巢，進而促進移植物血管化是近年興起的另一項研究策略。利用醋酸纖維素制作的中空纖維裝置，Tengood 等[17]將兩種促血管生成因子 bFGF 和血小板衍化生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）與之結合并順序釋放，從而更好地刺激了小鼠皮下成熟血管的形成。Davis 等[18]將可注射的自組裝納米纖維肽鏈 AcN-RARADADARARADADA-CNH2 注射入心肌后，其局部形成了一個可促進 ECs 歸巢的微環境，促進了梗死心肌的局部血管形成并改善了局部心肌細胞的生存率。Zhang 等[19]構建了一種含有膠原蛋白結合域（collagen-binding domain，CBD）的 VEGF 因子。之后無論是將其直接注射于梗死的心肌[19]，還是將其涂于膠原補片的表面再覆蓋于梗死的心肌[20]，均顯著增加了梗死心肌處的新生血管密度。
Hydrogel 膠是一種親水性的高分子聚合物，常呈水凝膠狀態存在，具有良好的組織相容性，可與各種生長因子混合并與細胞組成懸液，心內移植后可增加細胞的局部存留并延長生長因子的半衰期。Wu 等[21]將其與 VEGF 化學結合后注射于梗死心肌附近，明顯延長了 VEGF 的作用半衰期，改善了局部血運。Miyagi 等[22]則將含有基質細胞衍生因子（stromal cell-derived factor，SDF）、MSCs 的 hydrogel 溶液注射于行左室成形術的補片周圍，4 周后，補片周圍組織的血管再生獲得了明顯改善。水凝膠技術操作簡單，極易于小型化、自動化生產，其缺點是與固態基質相比，其生物力學性能太差[23]。
1.4 體內異位移植預血管化策略
在心臟修補前，將 EHTs 植入體內血運豐富部位進行“預血管化”處理也是一種常用策略。Dvir 等[24]將心肌細胞植入結合有生長因子的鹽藻酸補片，并將補片異位移植于大網膜 7 d 后移植于梗死心肌的表面，4 周后，補片與宿主心肌實現了結構和電生理的整合。Zhang 等[25]是將大鼠左心耳心肌被覆大網膜后移植于大鼠梗死心肌表面，4 周后，梗死邊緣的心肌血管再生獲得了明顯改善，并伴隨著基質金屬蛋白酶和內皮素的明顯下降。而 Huang 等[26]則是直接利用大網膜作心肌補片，也取得了類似的治療效果。另一個預血管化的著名的實驗是由 Morritt 等[27]利用動靜脈環（A-V loop）模型來實現的。研究團隊將新生大鼠心肌細胞與膠原凝膠共置于一小室內，皮下植入大鼠腹股溝部的動靜脈環周圍，動靜脈環內流動的血液提供了心肌細胞代謝所需的必要物質。4～10 周后，上述組織長成為一個含有血管蒂，可自發收縮的，已被廣泛血管化了的心肌組織塊，該組織塊對電及血管活性藥刺激均呈現出生理反應。上述模型的缺點在于“預血管化”需要兩次額外的手術，且在植入心臟前組織塊要經歷一段短暫的“無灌注”過程。為解決上述問題，Sekine[28]及 Chiu等[29]分別在體外構建出了含有動靜脈血管蒂的組織血管床，在其上反復種植心肌細胞片層，均獲得了含有豐富血管，具有收縮功能的心肌組織塊。
2 以工程學理念促進 EHTs 的血管化策略
2.1 細胞片層疊加技術
將心肌細胞（cardiomyocytes，CMs）種植于涂備有溫敏物質的培養皿中，待細胞爬滿后，通過調控溫度變化，即可獲得具有收縮能力的單細胞片層，將上述 CMs 片層疊加，Shimizu 等[30]構造出了最早的具有收縮能力的三維心肌組織塊。為了更好地為心肌細胞提供血運，Sekine 等[31]還采用“三明治”方法，在兩層 CMs 片層間加入 ECs 片層，將這種 EHTs 植入缺血的心肌后，局部的新生血管生成獲得了明顯改善。隨后，Shimizu 等[32]發現，植入體內的 CMs 片層不能超過 3 層，否則外層的 CMs 會因缺血而死亡；但植入心臟表面的單細胞片層則在體內植入 3 d 后即可與宿主心肌建立血運聯系。因此，他們將單細胞片層在體內先進行預血管化，每 1～3 d 后開胸將細胞片層固定于上一片層表面，通過反復疊加，最后獲得了含有 12 個細胞片層，厚度近 1 mm 的心肌組織。當然，從臨床現實角度講，這種需反復開胸定植的 EHTs 是不可接受的，此外由于缺乏間質的支持，補片的機械性能也不值得信任。仍需要進一步的研究去優化這一技術方法。
2.2 微組織模塊組配策略
微組織模塊組配技術是工程學理念在 EHTs 構建中最突出的體現，它是伴隨著組織工程血管化的探索而發展起來的。由于既往的促血管化策略都是誘導血管“自外向內”長入組織，這就決定了所構建的 EHTs 的厚度及體積均受限制，因為 Radisic 等[33]研究已證實：如果沒有內生毛細血管網而僅依賴局部彌散的話，能保證移植細胞生存的組織塊的最大厚度僅為 150～200 μm。微模塊組配策略則體現了“自內向外”的血管化誘導思維。利用 ECs 片層包被微組織塊形成模塊單元，再將上述模塊單元按設計組裝成大的組織塊。由于各微組織模塊間均為 ECs 包被的間隙，可以允許血液灌注為各微組織塊提供代謝支持；此外，微組塊表面的 ECs 可快速連接，形成具有三維構象，有血液灌注功能的成熟血管網絡[34]。這一技術理念的最大優勢就是可以按設計構造任意大小的組織塊而不必顧慮其血運，但在實踐中它卻存在著諸多問題。首先，微組織塊內實質細胞的任何變化都會影響其表面 ECs 層結構的完整性[35]，而體內移植后 ECs 引發的免疫排斥反應則會使血管結構大量衰退[36]。盡管有研究顯示，MSCs 的加入可明顯減輕這種損傷[37]。其實，微模塊組配策略從促進移植物血管化角度講可能是成功的，但就 EHTs 的構建而言，它卻存在著先天的缺陷—— 由于表面上 ECs 的包被，各微組織塊間本質上是孤立的，但心肌組織本質上卻要求各細胞間均存在著連接，以實現同步的生物電傳導和向心的機械收縮。盡管如此，這一技術的發明仍有其突出的現實意義，因為它反映了組織工程概念中一個最本質的含義之一—— 將隨機的細胞連接變為可控的組織裝配。
2.3 血管網絡誘導發生策略
既往的一項研究證實[38]：如果 EHTs 內 ECs 構建的血管網絡能夠有序的分布的話，那么在體移植后，該血管網相較于那種自發無序生成的血管網更容易與宿主血管實現吻合，成熟及血液灌注。由此可見，EHTs 內血管的拓撲空間構型相較于血管密度更為重要。因此，也催生出了這種旨在實現新生血管更合理排布的促血管化策略。這種策略的基本思維就是利用當前微加工技術的進展，在 EHTs 構建的基質中刻畫出理想的血管網絡構型，然后將含有 ECs 的灌注液灌注其間，ECs 即可按照已規劃好的構型自發組裝成血管樣結構。Baranski 等[39]將采用該思路制備的血管網浸漬于含有實質細胞的 Hydrogel 中，形成一種具有血管合理布局的 EHTs。將其在體移植后 3 d，該血管網即與宿主血管實現吻合，并在之后的 4 周內迅速發育為具有灌注功能的成熟血管。
這種策略除了用來引導 ECs 按規劃來生成血管外，還用來引導含有血管的組織塊按規劃來生發新生血管。例如最近，Chiu等[29]設計了一個有趣的實驗：她們將分別含有動靜脈的組織塊相距一定距離進行體外培養，中間間隔以已刻畫好圖案的硅膠板，上述裝置置于含有胸腺素 β4，VEGF 和肝細胞生長因子（hepatic growth factor，HGF）的培養液中。2 周后，上述組織塊發出的新生血管按照刻畫好的圖案在硅膠板上生成了一個相互聯通的動靜脈血管床。在其上被覆心肌細胞片層，最后形成了一個已被充分血管化了的跳動的心肌組織塊。
2.4 血管網絡的人工構建策略
與以往指導血管網絡的組裝或生長不同，利用現代微流體技術、微加工工藝以及生物材料研究的不斷進展，人工合成具有合理空間布局的血管網絡的生物材料技術正方興未艾。這一策略的基本思路是選用合適的生物材料，利用微加工技術模擬天然血管網絡的拓撲構型構建人工血管槽網，再利用微流體技術將含有 ECs，SMCs，其他周細胞或/和實體細胞的灌流液灌注其間，以精確控制血管網絡的形成及空間布局。在體移植時，可以采用顯微外科技術將灌注點與宿主血管吻合，這樣移植后即刻，生物材料的內生血管網即可與宿主實現整合。上述構想的實現主要是依賴材料的進步來實現。例如：Kaihara 等[40]首先制作了硅的血管網絡模板，然后以聚二甲基硅氧烷（PDMS）成型，形成封閉的血管槽網，同時接種 ECs 以構成天然血管網。為克服上述材料不能降解的難題，Fidkowski 等[41]又以丙三醇葵二酸鹽（PGS）為材料，利用“軟光蝕刻技術”構建了一種可降解的，內襯以 ECs 的血管網絡。上述材料的優勢在于其卓越的機械性能及可加工性，但因為材料本身的結構問題（不允許生物大分子通過）限制了組織內細胞間的連接，而這對構建以實現“電-機械偶聯”為目標的 EHTs 而言不可接受。因此，許多學者又把目光轉到了 Hydrogel 膠上。Hydrogel 膠的應用使上述問題迎刃而解—— 無論是材料內的生物大分子的自由流動，還是其內細胞的相互連接及作用均不再是問題。例如：Golden 等[42]將用明膠構建的血管網包埋于含有細胞的 Hydrogel 膠中，然后升溫至生理水平以促進明膠溶解，殘留的血管槽可被凝膠中的 ECs 覆蓋形成血管結構。近來，利用 3D 打印技術，以碳水化合物玻璃為基質，Miller 等[43]采用上述方法實現了血管網絡的快速批量生產。目前，這種方法的主要局限在于組織內的細胞密度過低，壓實水凝膠雖可提高細胞密度，但更可能造成已構建血管系統的坍塌。此外，降解產物造成的局部靜水壓升高也會對組織內的細胞生存造成很大影響。
3 未來展望
當前，盡管 EHTs 的血管化研究已取得了長足的進展，但距構建出具有臨床實用價值，可完全替代自體心肌組織的 EHTs 這一目標而言，仍有相當長的一段路要走。工程化策略對指導脈管系統的體外組裝、構建頗具優勢，而生物學策略則有助于促進移植物內的脈管系統與宿主血管連接、整合及成熟。也許綜合利用兩者的優勢將是今后 EHTs 血管化研究的方向和目標。