引用本文： 糜燁東, 秦建偉. 炎癥相關基因多態性與心臟瓣膜置換術后華法林治療療效的相關性研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(11): 1077-1081. doi: 10.7507/1007-4848.20160253 復制
心臟瓣膜置換大大降低了心臟相關疾病的死亡率，但是預后仍不理想，多數患者治療后仍會發生各種并發癥，影響患者預后。越來越多的學者認識到炎癥相關性因子與心臟內膜疾病密切相關[1-2]。炎癥相關基因基質金屬蛋白酶2（MMP2）是特異性降解細胞外基質和基底膜的主要因子，也是心臟內膜疾病最重要的因子，對心血管疾病的發生發展起著關鍵性作用。為此我們對MMP2進行不斷深入研究，以提高心臟瓣膜置換治療的水平[3-4]。已有研究顯示MMP2的-1 306位點上存在著基因多態性位點，該位點存在于種子序列當中，可以調控該基因的成熟體，且研究還提示了MMP2基因的上調與心臟瓣膜疾病有著密切的關系[5]，但是有關MMP2多態性與治療預后的關系尚未見報道，華法林在心臟瓣膜置換術后的治療方面具有重要的臨床實踐意義。為進一步闡明心臟瓣膜疾病治療術后華法林的臨床療效及生存預后與MMP2多態性之間的關系，納入在我院行心臟瓣膜置換術后華法林治療的患者96例作為試驗組，另納入心臟瓣膜置換術后未采用華法林治療的患者78例作為對照組，采用逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應的方法對MMP2的相對表達量進行檢測，運用Kaplan-Meier生存曲線對治療后的患者的生存情況進行分析，初步探討炎癥相關基因MMP2多態性與心臟瓣膜置換術后華法林治療效果的關系，為進一步探討其與預后療效的關系奠定基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入2010年1月到2015年1月在我院胸心外科行心臟瓣膜置換術后華法林治療的患者96例作為試驗組，另納入心臟瓣膜置換術后未采用華法林治療的患者78例作為對照組，年齡32～65（50.34±1.13）歲。收集標本前該臨床試驗研究通過了醫院倫理委員會的批準，所有患者簽訂知情同意書。在術中取材之后，以血液標本報告為標準，提取兩組患者的血液標本RNA，對所有手術治療的患者從出院到死亡進行隨訪觀察，隨訪頻率為每月1次。
1.2 主要試劑與儀器
試劑包括Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（美國Invitroge公司）、蛋白酶K（默克生物公司）、TaqMix（東盛生物公司）、PCR試劑盒、TaqMan RNA試劑盒（美國Santa Cruz公司）、RNA提取試劑盒采用（美國Sigma）、DEPC（上海碧云天生物），乙醇、異丙醇、氯仿（上海碩盟生物）。
儀器包括高速冷凍離心機（德國BiofugeStratos）、-80℃～4℃冰箱（日本松下）、PCR儀（澳大利亞Rotor-gene）、紫外分光光度儀（美國Beckman Coulter公司）。
1.3 RNA提取及qPCR檢測
血液標本采用RNA提取試劑盒進行RNA提取，應用TaqMan RNA試劑盒檢測MMP2的相對表達量。以RNU6作為內參進行校正。對MMP2的表達水平采用二步法進行檢測，第一步通過莖環引物來合成互補DNA，再通過RNA的逆轉錄系統對10 ngRNA進行逆轉了反應體系進行反應，在PCR管加入10 μl逆轉錄緩沖液，總RNA濃度調整到2 ng/μl，最后加入5 μl逆轉錄引物，在冰上混勻之后反應5 min，接著進行梯度變性反應，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減；第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應體系，反應體系為2×的PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman RNA的特異性引物，通過逆轉錄體系進行反應，5 μlcDNA加入到RNA去酶水中，將體積擴增至20 μl，通過循環反應94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減擴張40個循環之后采用熒光實時定量反應，按照PCR操作說明，Ct的檢測值應當在20～32之外的需要進行第二次檢測。應用△ Ct=Ct MMP2-Ct RNU6的計算公式計算MMP2的相對表達量。
1.4 統計學分析
應用SPSS 21.0分析數據。用χ2檢驗判斷對照組的基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。正態分布計量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。采用logistic回歸分析MMP2 GG及GC基因型是否為預后的危險因素。運用Kaplan-Meier生存曲線對患者的生存情況進行分析，對于MMP2 GC基因型攜帶者與生存率之間的關系，統計檢測采用雙尾的檢測方法，應用Mann-Whitney U檢驗法進行兩兩數據之間比較。P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 臨床資料比較
兩組患者年齡無明顯差異（P > 0.05），肝腎功能差異明顯（P < 0.05）。心臟瓣膜置換術后華法林治療組的GG基因型所分布的比例明顯高于對照組（P < 0.05），而GC基因型的分布比例兩組無顯著差異（P > 0.05），臨床資料顯示對照組的各個基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P=0.75），見表 1，圖 1、圖 2。
圖1
GG基因型
圖2
GC基因型
表1
兩組患者臨床資料比較[例/ X±s ]
2.2 嚴重并發癥患者的臨床基本特征
出現嚴重并發癥（瓣周漏、人造瓣膜血栓及血栓栓塞、溶血及溶血性貧血、人造瓣膜感染性心內膜炎、急性呼吸衰竭、肝功能不全及衰竭、多臟器功能衰竭、縱隔感染等）的患者GG基因型的比例要高于未出現嚴重并發癥患者，提示MMP2的GG基因型是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的重要危險因素，年齡、肝腎功能損傷也是主要危險因素（表 2）。
表2
心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥患者的臨床基本特征[例/ X±s ]
2.3 基因型與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的危險因素分析
研究結果顯示，GG與GC兩種基因型是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的危險因素，其中攜帶GC基因型（OR=2.998，95% CI 1.176～7.639，P=0.023）；攜帶GG基因型（OR=2.936，95% CI 1.198～7.246，P=0.019）；攜帶GC基因型者心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的風險增加16%，而攜帶GG基因型者心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的風險增加28%；從華法林治療的效果上看，攜帶GC基因型的治療后可降低嚴重并發癥的風險（OR=2.936，95% CI 0.576～1.896，P=0.019）；攜帶GG基因型降低嚴重并發癥風險（OR=1.846，95% CI 1.148～2.965，0.015）；采用華法林之后可顯著降低兩基因型的嚴重并發癥發生風險（表 3）。
表3
基因型與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的危險因素分析
2.4 MMP2攜帶GG基因型表達的高低與預后之間的相關性
心臟瓣膜置換術后華法林治療組的MMP2的相對表達量為1.436，95% CI 0.323～0.534。表達量低于平均值的有42例，高于平均值的有54例，攜帶GG基因型MMP2高表達的患者中生存時間為（37.34±10.90）個月，而低表達的患者生存時間為（54.23±12.43）個月，兩組差異有統計學意義（P < 0.05），MMP2攜帶GG基因型的高低與預后有一定的相關性。
3 討論
心臟瓣膜置換大大降低了心臟系統疾病的死亡率，但是一旦出現嚴重術后并發癥，則患者預后極差，生存率較低[6]。華法林可以有效防止血栓的擴大，同時溶解血栓，達到消除癥狀、預防肺栓塞及血栓復發的目的，該藥不會產生出血等不良反應。隨著生物信息學的發展，心臟瓣膜置換的預后相關研究越來越深入，研究發現基因參與疾病的發生發展，并與預后密切相關，且其表達譜還決定著病情的嚴重程度，在臨床病理因素中發揮著重要作用，尤其對于術后的生存期及預后具有一定的相關性，研究提示了特異性的基因可以用于對心臟瓣膜置換術后預后的評估，其表達量與疾病的預后有著一定的相關性[7-9]。
已有研究表明與心臟瓣膜相關疾病密切相關的炎癥因子MMP2，其編碼定位在人的1號染色體（1p34.23）上[7, 10]。研究還提示了MMP2基因的上調與心臟炎癥活動有著密切的關系，但特定區域的單核苷酸多態性可以使人更易罹患疾病[11-12]。已有研究提示MMP2的-1 306位點上存在著基因多態性位點，該位點存在于種子序列當中，可以調控該基因的成熟體，即調控MMP2的表達，但有關MMP2多態性與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥之間的關系尚未見報道[13-14]。本研究旨在進一步研究闡明MMP2中的一種G/C多態現象與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生發展及預后的關系，為進一步了解MMP2基因多態性與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥之間的關系。
通過對心臟瓣膜置換術后華法林治療的病例采用基因測序的方法確定單核苷酸多態性的等位基因，分析心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥的發生與不同的MMP2基因型之間的關系，結果顯示，MMP2基因型在心臟瓣膜置換術后華法林治療組及對照組基因型的分布是不相同的，通過多因素的logistic回歸分析顯示GC與GG兩種基因型是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的危險因素，華法林可顯著降低兩基因型患者發生嚴重并發癥的風險，結果顯示，出現嚴重并發癥的患者GG基因型的比例要高于未出現嚴重并發癥的患者，提示MMP2的GG基因型是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥的重要危險因素，年齡、肝腎功能損傷也是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥的主要危險因素，因此攜帶GG基因型患者，大齡、肝腎功能損傷患者行心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生風險會明顯增加；生存分析方面，攜帶GG基因型MMP2高表達的患者中生存時間為（37.34±10.90）個月，而低表達的患者生存時間為（54.23±12.43）個月，攜帶MMP2 GG基因型的患者生存時間要短于攜帶GC基因型，這表明MMP2 GG基因型表達的高低與預后有著一定的相關性。
綜上所述，我們發現基因的多態性在心臟瓣膜置換的調控機制上具有重要的作用，與術后并發癥的發生、機制的調節及疾病的預后密切相關性，本研究結果提示MMP2GG基因型可能與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥的發生和預后有關，該差異性表達推測可能是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生早期的潛在靶點，但是本研究尚存在一定的不足，如病例數還相對較少，還未行長期的預后隨訪研究，接下來我們將進一步行前瞻性的隊列研究以獲得更多的相關資料，但是本研究初步揭示了MMP2基因多態性與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥之間的相關性，綜合之前的研究提示了GG基因型對心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的影響可能是通過上調MMP2的表達，從而啟動心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥的發生發展，隨著試驗的進一步研究我們相信更多的炎癥相關基因調控機制將會被揭示，從而為心臟瓣膜置換治療及預后的判斷提供新的方法及依據。
心臟瓣膜置換大大降低了心臟相關疾病的死亡率，但是預后仍不理想，多數患者治療后仍會發生各種并發癥，影響患者預后。越來越多的學者認識到炎癥相關性因子與心臟內膜疾病密切相關[1-2]。炎癥相關基因基質金屬蛋白酶2（MMP2）是特異性降解細胞外基質和基底膜的主要因子，也是心臟內膜疾病最重要的因子，對心血管疾病的發生發展起著關鍵性作用。為此我們對MMP2進行不斷深入研究，以提高心臟瓣膜置換治療的水平[3-4]。已有研究顯示MMP2的-1 306位點上存在著基因多態性位點，該位點存在于種子序列當中，可以調控該基因的成熟體，且研究還提示了MMP2基因的上調與心臟瓣膜疾病有著密切的關系[5]，但是有關MMP2多態性與治療預后的關系尚未見報道，華法林在心臟瓣膜置換術后的治療方面具有重要的臨床實踐意義。為進一步闡明心臟瓣膜疾病治療術后華法林的臨床療效及生存預后與MMP2多態性之間的關系，納入在我院行心臟瓣膜置換術后華法林治療的患者96例作為試驗組，另納入心臟瓣膜置換術后未采用華法林治療的患者78例作為對照組，采用逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應的方法對MMP2的相對表達量進行檢測，運用Kaplan-Meier生存曲線對治療后的患者的生存情況進行分析，初步探討炎癥相關基因MMP2多態性與心臟瓣膜置換術后華法林治療效果的關系，為進一步探討其與預后療效的關系奠定基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入2010年1月到2015年1月在我院胸心外科行心臟瓣膜置換術后華法林治療的患者96例作為試驗組，另納入心臟瓣膜置換術后未采用華法林治療的患者78例作為對照組，年齡32～65（50.34±1.13）歲。收集標本前該臨床試驗研究通過了醫院倫理委員會的批準，所有患者簽訂知情同意書。在術中取材之后，以血液標本報告為標準，提取兩組患者的血液標本RNA，對所有手術治療的患者從出院到死亡進行隨訪觀察，隨訪頻率為每月1次。
1.2 主要試劑與儀器
試劑包括Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（美國Invitroge公司）、蛋白酶K（默克生物公司）、TaqMix（東盛生物公司）、PCR試劑盒、TaqMan RNA試劑盒（美國Santa Cruz公司）、RNA提取試劑盒采用（美國Sigma）、DEPC（上海碧云天生物），乙醇、異丙醇、氯仿（上海碩盟生物）。
儀器包括高速冷凍離心機（德國BiofugeStratos）、-80℃～4℃冰箱（日本松下）、PCR儀（澳大利亞Rotor-gene）、紫外分光光度儀（美國Beckman Coulter公司）。
1.3 RNA提取及qPCR檢測
血液標本采用RNA提取試劑盒進行RNA提取，應用TaqMan RNA試劑盒檢測MMP2的相對表達量。以RNU6作為內參進行校正。對MMP2的表達水平采用二步法進行檢測，第一步通過莖環引物來合成互補DNA，再通過RNA的逆轉錄系統對10 ngRNA進行逆轉了反應體系進行反應，在PCR管加入10 μl逆轉錄緩沖液，總RNA濃度調整到2 ng/μl，最后加入5 μl逆轉錄引物，在冰上混勻之后反應5 min，接著進行梯度變性反應，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減；第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應體系，反應體系為2×的PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman RNA的特異性引物，通過逆轉錄體系進行反應，5 μlcDNA加入到RNA去酶水中，將體積擴增至20 μl，通過循環反應94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減擴張40個循環之后采用熒光實時定量反應，按照PCR操作說明，Ct的檢測值應當在20～32之外的需要進行第二次檢測。應用△ Ct=Ct MMP2-Ct RNU6的計算公式計算MMP2的相對表達量。
1.4 統計學分析
應用SPSS 21.0分析數據。用χ2檢驗判斷對照組的基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。正態分布計量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。采用logistic回歸分析MMP2 GG及GC基因型是否為預后的危險因素。運用Kaplan-Meier生存曲線對患者的生存情況進行分析，對于MMP2 GC基因型攜帶者與生存率之間的關系，統計檢測采用雙尾的檢測方法，應用Mann-Whitney U檢驗法進行兩兩數據之間比較。P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 臨床資料比較
兩組患者年齡無明顯差異（P > 0.05），肝腎功能差異明顯（P < 0.05）。心臟瓣膜置換術后華法林治療組的GG基因型所分布的比例明顯高于對照組（P < 0.05），而GC基因型的分布比例兩組無顯著差異（P > 0.05），臨床資料顯示對照組的各個基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P=0.75），見表 1，圖 1、圖 2。
圖1
GG基因型
圖2
GC基因型
表1
兩組患者臨床資料比較[例/ X±s ]
2.2 嚴重并發癥患者的臨床基本特征
出現嚴重并發癥（瓣周漏、人造瓣膜血栓及血栓栓塞、溶血及溶血性貧血、人造瓣膜感染性心內膜炎、急性呼吸衰竭、肝功能不全及衰竭、多臟器功能衰竭、縱隔感染等）的患者GG基因型的比例要高于未出現嚴重并發癥患者，提示MMP2的GG基因型是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的重要危險因素，年齡、肝腎功能損傷也是主要危險因素（表 2）。
表2
心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥患者的臨床基本特征[例/ X±s ]
2.3 基因型與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的危險因素分析
研究結果顯示，GG與GC兩種基因型是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的危險因素，其中攜帶GC基因型（OR=2.998，95% CI 1.176～7.639，P=0.023）；攜帶GG基因型（OR=2.936，95% CI 1.198～7.246，P=0.019）；攜帶GC基因型者心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的風險增加16%，而攜帶GG基因型者心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的風險增加28%；從華法林治療的效果上看，攜帶GC基因型的治療后可降低嚴重并發癥的風險（OR=2.936，95% CI 0.576～1.896，P=0.019）；攜帶GG基因型降低嚴重并發癥風險（OR=1.846，95% CI 1.148～2.965，0.015）；采用華法林之后可顯著降低兩基因型的嚴重并發癥發生風險（表 3）。
表3
基因型與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的危險因素分析
2.4 MMP2攜帶GG基因型表達的高低與預后之間的相關性
心臟瓣膜置換術后華法林治療組的MMP2的相對表達量為1.436，95% CI 0.323～0.534。表達量低于平均值的有42例，高于平均值的有54例，攜帶GG基因型MMP2高表達的患者中生存時間為（37.34±10.90）個月，而低表達的患者生存時間為（54.23±12.43）個月，兩組差異有統計學意義（P < 0.05），MMP2攜帶GG基因型的高低與預后有一定的相關性。
3 討論
心臟瓣膜置換大大降低了心臟系統疾病的死亡率，但是一旦出現嚴重術后并發癥，則患者預后極差，生存率較低[6]。華法林可以有效防止血栓的擴大，同時溶解血栓，達到消除癥狀、預防肺栓塞及血栓復發的目的，該藥不會產生出血等不良反應。隨著生物信息學的發展，心臟瓣膜置換的預后相關研究越來越深入，研究發現基因參與疾病的發生發展，并與預后密切相關，且其表達譜還決定著病情的嚴重程度，在臨床病理因素中發揮著重要作用，尤其對于術后的生存期及預后具有一定的相關性，研究提示了特異性的基因可以用于對心臟瓣膜置換術后預后的評估，其表達量與疾病的預后有著一定的相關性[7-9]。
已有研究表明與心臟瓣膜相關疾病密切相關的炎癥因子MMP2，其編碼定位在人的1號染色體（1p34.23）上[7, 10]。研究還提示了MMP2基因的上調與心臟炎癥活動有著密切的關系，但特定區域的單核苷酸多態性可以使人更易罹患疾病[11-12]。已有研究提示MMP2的-1 306位點上存在著基因多態性位點，該位點存在于種子序列當中，可以調控該基因的成熟體，即調控MMP2的表達，但有關MMP2多態性與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥之間的關系尚未見報道[13-14]。本研究旨在進一步研究闡明MMP2中的一種G/C多態現象與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生發展及預后的關系，為進一步了解MMP2基因多態性與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥之間的關系。
通過對心臟瓣膜置換術后華法林治療的病例采用基因測序的方法確定單核苷酸多態性的等位基因，分析心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥的發生與不同的MMP2基因型之間的關系，結果顯示，MMP2基因型在心臟瓣膜置換術后華法林治療組及對照組基因型的分布是不相同的，通過多因素的logistic回歸分析顯示GC與GG兩種基因型是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的危險因素，華法林可顯著降低兩基因型患者發生嚴重并發癥的風險，結果顯示，出現嚴重并發癥的患者GG基因型的比例要高于未出現嚴重并發癥的患者，提示MMP2的GG基因型是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥的重要危險因素，年齡、肝腎功能損傷也是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥的主要危險因素，因此攜帶GG基因型患者，大齡、肝腎功能損傷患者行心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生風險會明顯增加；生存分析方面，攜帶GG基因型MMP2高表達的患者中生存時間為（37.34±10.90）個月，而低表達的患者生存時間為（54.23±12.43）個月，攜帶MMP2 GG基因型的患者生存時間要短于攜帶GC基因型，這表明MMP2 GG基因型表達的高低與預后有著一定的相關性。
綜上所述，我們發現基因的多態性在心臟瓣膜置換的調控機制上具有重要的作用，與術后并發癥的發生、機制的調節及疾病的預后密切相關性，本研究結果提示MMP2GG基因型可能與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥的發生和預后有關，該差異性表達推測可能是心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生早期的潛在靶點，但是本研究尚存在一定的不足，如病例數還相對較少，還未行長期的預后隨訪研究，接下來我們將進一步行前瞻性的隊列研究以獲得更多的相關資料，但是本研究初步揭示了MMP2基因多態性與心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥之間的相關性，綜合之前的研究提示了GG基因型對心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥發生的影響可能是通過上調MMP2的表達，從而啟動心臟瓣膜置換術后嚴重并發癥的發生發展，隨著試驗的進一步研究我們相信更多的炎癥相關基因調控機制將會被揭示，從而為心臟瓣膜置換治療及預后的判斷提供新的方法及依據。