引用本文： 許士俊, 穆軍升, 張健群, 伯平. 小鼠誘導多能干細胞與PHBHHx膜體外共培養的實驗研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(8): 822-826. doi: 10.7507/1007-4848.20160196 復制
干細胞替代療法是一種具有巨大潛力的可以治療多種疾病（如心肌梗死等）的有效方法[1]。成熟哺乳動物的大部分正常體細胞損傷后可以再生，但是處于分化終末階段的細胞，如心肌細胞、腦細胞和軟骨細胞，一旦受損或凋亡后便不能再生，只能由成纖維細胞替代，使臟器功能受損，極大地損害了人類的健康。干細胞移植可以利用干細胞的分化潛能從而替代受損細胞，改善受損臟器的部分功能[2]。然而，干細胞移植過程中因為缺乏相應的載體，導致移植細胞難以在移植區良好的存活和增殖，因此尋找一種能為細胞提供適宜的生長環境、有效減少細胞流失的生物材料顯得尤為重要[3-4]。誘導多能干細胞（iPSCs）是將與胚胎干細胞多能性密切相關的4個轉錄因子（Oct-4，Sox2、c-Myc和Klf）通過逆轉錄病毒導入到小鼠胚胎成纖維細胞和鼠尾成纖維細胞而重編程為的多能干細胞[5]。iPSCs在細胞形態、生長特點、基因表達譜和形成畸胎瘤方面與ESCs（胚胎干細胞）類似，也具有相似的全能性，能夠在體外適宜的條件下分化為心肌細胞、腦細胞、軟骨細胞等所有三胚層類型的細胞[6]，且解決了胚胎干細胞與生俱有的免疫排斥、倫理和道德等問題，是非常理想的種子細胞。細胞補片能夠為種子細胞提供生存和增殖的細胞外環境，防止細胞的流失。因此，細胞補片材料需要有良好的生物相容性、無毒及可降解等特性[7]。所以探索尋找一種適合細胞生長增殖的支架材料是制作細胞補片的重要環節之一。聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯（PHBHHx）作為PHA家族中的一員，已經證實與多種細胞能夠很好的融合[8]。具有作為生物醫學材料的潛力，但是作為iPSCs的補片材料應用到干細胞移植治療領域還缺乏相應的研究。本研究通過小鼠誘導多能干細胞（miPSCs）與PHBHHx材料補片共培養，觀察PHBHHx細胞補片對miPSCs粘附及增殖的影響，以探索尋找適合細胞粘附和增殖，并具有良好生物相容性和可降解特性的生物材料。
1 材料與方法
1.1 材料
孕13.5 d的昆明白鼠，由中國軍事科學院提供。小鼠誘導多能干細胞來自于中國科學院動物研究所。高糖DMEM（Hyclone）、1%的非必須氨基酸、L-谷氨酰胺、0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇、青鏈霉素、5%的血清替代物（SR）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.05%胰酶EDTA（Gibco）、絲裂霉素C（Sigma）、明膠（BD Phar-mingen），PHBHHx材料由清華大學化工系高分子研究所合成
1.2 方法
小鼠誘導多能干細胞飼養層的制備[9]：將孕期13.5 d的昆明白孕鼠拉頸處死，浸入酒精，放入超凈臺中，無菌條件下取出子宮，PBS充分洗去血跡。剪開子宮和胎膜，取出胚胎，用鑷子去其頭部和內臟，充分洗滌，將其剪成1 mm3以下的碎塊，濾網過濾去除未剪碎的組織塊，將濾過液吸于離心管中靜置5～10 min，上清吸棄，加入1 ml 0.25%胰酶EDTA溶液，輕吹并消化2 min，加入等體積的MEF培養液（含10%普通胎牛血清的高糖DMEM）終止消化，吹打重懸，移入離心機中，800 r/min，離心5 min，上清吸棄。計數后以5×105/ml重懸于MEF生長培養基上，37℃，5% CO2的細胞培養箱中培養至90%的融合度后傳代，傳至第三代后，10 μg/ml的絲裂霉素C處理細胞2.5 h，胰酶消化后，800 r/min離心4 min，收集細胞后重懸于培養基中，計數細胞，以5×104/ml接種于0.1%明膠包被的100 mm培養皿中，多余細胞凍存備用。
復蘇、培養小鼠誘導多能干細胞：從液氮罐中取出一支凍存的miPSCs，浸入37℃的水浴鍋中迅速解凍，移入15 ml離心管中，加入1 ml干細胞培養基（高糖DMEM、5%的干細胞胎牛血清、5%的血清替代物、1000 U/ml LIF、1%的非必須氨基酸、1%的L-谷氨酰胺、1%的青鏈霉素、0.1%的β-巰基乙醇），800 r/min離心4 min，棄去上清，2 ml干細胞培養基重懸細胞，接種于經過絲裂霉素C預處理的小鼠胚胎纖維細胞飼養層上，放入培養箱中培養，隔天更換培養基。當miPSCs克隆過大或者過密時消化傳代，差速貼壁法去除MEF，接種于未加MEF飼養層的培養皿中，繼續培養。
miPSCs的鑒定采用堿性磷酸酶染色：吸棄培養基，PBS洗2～3次，4%的多聚甲醛固定1～2 min（不要超過2 min），吸棄，PBS洗2次，吸出PBS，PBST潤洗一次；配制染色試劑（溶液A :溶液B :溶液C=50 μl:50 μl:400 μl），加適量的（使染色液覆蓋孔底）染色試劑，室溫避光放置10～15 min；將染色液吸出，PBS潤洗一次，然后保存在PBS溶液中，顯微鏡下觀察（分化的細胞無色，未分化細胞被染為藍/紫色）。免疫熒光染色：吸出培養基，PBS洗3次（用搖床），4%的多聚甲醛固定10 min，吸棄，PBS洗3遍，每次5 min。用0.1%Triton-X100處理細胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min。用5%牛血清蛋白（BSA）封閉30 min，PBS洗3遍。加入山羊抗小鼠一抗Nanog、SSE-4（1:200，PBS稀釋），4℃過夜，PBS洗3遍，加入兔抗山羊二抗（1:200，PBS稀釋）和DAPI染液，室溫避光45～60 min，PBS洗5次，加入適量封片劑后，指甲油固定，激光共聚焦顯微鏡下讀片。
與PHBHHx膜共培養及細胞活力測定：在接種miPSCs之前，PHBHHx膜用打孔器剪成直徑0.5 cm的圓形片，經75%酒精浸泡2 h，紫外線正反兩面各照射2 h消毒，放入96孔板中，保持膜表面平整，培養基浸泡過夜備用。將培養至三代的miPSCs經過0.25%胰酶-EDTA消化后，細胞計數，調整細胞濃度為1×104個/ml，接種至96孔板中，分為兩組，一組與細胞補片共培養，另一組用傳統的培養皿培養miPSCs，每孔加入干細胞培養基200 μl。在細胞培養3 d后，CCK-8法測定細胞活力。
掃描電鏡樣品制備：細胞在PHBHHx膜上粘附生長3 d后，PBS洗滌3次，用2.5%的戊二醛固定（冰上）；再經0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗10 min后用1%四氧化鋨固定液固定2 h（冰上）；然后再用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗10 min后用乙醇梯度脫水并經乙酸異戊脂浸泡10 min；臨界點干燥；噴金后掃描電鏡下觀察拍照[10]。
1.3 統計學分析
采用SPSS 19.0統計軟件對所得數據進行統計分析，計數資料均采用均數±標準差（
2 結果
光鏡下小鼠誘導多能干細胞的觀察到miPSCs呈克隆生長，形成集落、類似球形、邊緣齊整、立體感強、細胞排列緊密、細胞界限難以分清，見圖 1A。對呈簇生長的小鼠誘導多能干細胞經胰酶消化后，通過差速離心法去除MEF飼養層后進行堿性磷酸酶染色鑒定，見圖 1B（分化的細胞為無色，未分化細胞被染成藍紫色）。SSE-4和Nanog為干細胞的特異性標志蛋白，對miPSCs進行免疫熒光觀察SSE-4和Nanog的表達，見圖 1C和1D（細胞核被染為藍色，紅色為SSE-4和Nanog蛋白表達）。
圖1
光鏡下小鼠誘導多能干細胞觀察圖
注：A：小鼠誘導多能干細胞在光鏡下×200；B：miPSCs鑒定，AP染色×200；C：免疫熒光鑒定miPSCs標志蛋白SSE-4，細胞核為藍色，蛋白紅色；D：免疫熒光鑒定miPSCs標志蛋白Nanog，細胞核為藍色，蛋白紅色
miPSCs與PHBHHx膜共培養細胞活力測定示miPSCs生長迅速，一般培養3 d即可傳代，傳代后生長更快。當克隆長大后，胰酶消化后重懸細胞，細胞計數后接種于預先處理的PHBHHx膜中培養，在培養3 d后對其進行CCK-8測定細胞活力，結果見圖 2，PHBHHx膜OD值大于傳統的細胞培養皿培養的OD值（0.617±0.019 vs. 0.312±0.004，P < 0.05），PHBHHx膜培養效果明顯優于傳統的培養皿培養。并對miPSCs與PHBHHx膜共培養3 d后進行DAPI染色觀察miPSCs在PHBHHx膜上粘附生長情況，見圖 3，細胞與PHBHHx膜粘附良好，細胞生長迅速。
圖2
PHBHHx膜與miPSCs共培養3 d后細胞活力測定結果圖
圖3
miPSCs在PHBHHx膜上粘附生長行DAPI染色圖
掃描電鏡觀察miPSCs在PHBHHx膜上的生長粘附狀態，見圖 4，在miPSCs與PHBHHx膜共培養3 d后，吸棄培養基，PBS洗3遍后，用0.25%戊二醛固定后，制成掃描電鏡標本后上機檢測。細胞粘附在PHBHHx膜上，生長良好。
圖4
電鏡觀察miPSCs在PHBHHx膜上的生長粘附狀態圖
注：A：掃描電鏡觀察PHBHHx膜表面形態×1000；B：miPSCs在PHBHHx膜上生長×2000
3 討論
干細胞具有自我復制和分化能力，是目前進行細胞治療的主要種子細胞[11]。干細胞按照發育階段可以分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細胞。ESC是一種高度未分化的細胞，具有分化為體內所有細胞類型的能力。但其存在免疫排斥及倫理學等問題，限制了ESC的應用前景[12]。2006年，Takahashi等[5]通過轉入4種轉錄因子，成功的將成纖維細胞重新編程從而獲得了具有ESC特性的全能干細胞—誘導多能干細胞。iPSC與ESC在形態、增殖分化潛力、細胞表面抗原、類胚體和畸胎瘤生成能力方面與ESC類似，而且還避免了倫理學和細胞免疫排斥等問題，因此具有巨大的應用潛力[13-14]。心肌梗死是由于冠狀動脈狹窄或者閉塞導致的遠端心肌細胞缺血、缺氧而發生壞死性疾病，發病兇險、死亡率高、預后不良。目前的治療方法只能改善缺血區的心肌供血，并不能從根本上改變心肌細胞壞死的結局。而且，大片的心肌壞死后會導致心臟射血功能下降，出現心力衰竭，危及生命。
研究者在體外利用誘導多能干細胞分化為心肌細胞，注射到事先構建好的小鼠梗死模型中，與單純注入成纖維細胞相比，發現移植入誘導多能干細胞的小鼠左心室收縮功能得到了明顯改善，心室壁增厚和心室重構也得到了抑制，同時還增加了心電穩定性[15-16]。但是，干細胞移植治療的過程中，移植區細胞會隨著血流的沖刷或伴隨機械活動，導致移植細胞的流失[17]。所以，miPSCs移植到梗死心肌細胞表面需要載體依托，保證移植細胞能夠在心臟表面粘附并增殖。因此，我們需要尋找一種能夠為細胞生長增殖提供合適的生存環境，具有良好的生物相容性和物理特性，以及在體內可降解吸收的材料，提高移植細胞在移植區的存活和增殖，從而更好地治療疾病，改善疾病的預后。
生物可降解高分子聚合材料是組織工程學材料研究中最活躍的領域[18]。PHA家族是近年來被廣泛關注的新型生物材料[19]，由于組成各種PHA材料的單體結構不同，其機械性能和生物相容性也不同。PHBHHx是PHA家族中具有很好生物相容性、合適的物理特性和可降解特性的新型材料[20]。鑒于此，我們選擇PHBHHx支架材料作為細胞補片，將miPSCs與PHBHHx膜共培養。實驗中，通過DAPI染色可以看到小鼠誘導多能干細胞粘附在PHBHHx膜上，形態正常（圖 3）；制作電鏡標本后，經過掃面電鏡可以清晰的觀察到PHBHHx的表面形態，miPSCs在PHBHHx膜上粘附生長，擠作一團、呈簇生長、類似球形。3 d后進行CCK-8法測定細胞的活力，酶標儀測定450 mm處的吸光度，與PHBHHx膜共培養組OD值為0.617±0.019，顯著大于傳統的細胞培養皿培養的OD值0.312±0.004（P < 0.05）；說明PHBHHx膜不僅能夠與miPSCs良好的融合，而且miPSCs在PHBHHx材料上生長更加活躍，PHBHHx可以促進miPSCs的增殖。因此，PHBHHx材料有希望成為治療多種疾病的細胞培養支架材料。
本實驗雖然證明了PHBHHx與miPSCs具有良好的相容性，miPSCs在PHBHHx膜上可以很好的粘附、存活和增殖，但是，我們并不知道補片材料能否促進miPSCs的分化以及補片材料移植入體內降解吸收后對機體的影響，是否會發生免疫排斥等情況。接下來我們會進一步研究PHBHHx作為心肌補片能否促進miPSCs向心肌細胞分化，為干細胞治療心肌梗死走上臨床奠定實驗基礎。
干細胞替代療法是一種具有巨大潛力的可以治療多種疾病（如心肌梗死等）的有效方法[1]。成熟哺乳動物的大部分正常體細胞損傷后可以再生，但是處于分化終末階段的細胞，如心肌細胞、腦細胞和軟骨細胞，一旦受損或凋亡后便不能再生，只能由成纖維細胞替代，使臟器功能受損，極大地損害了人類的健康。干細胞移植可以利用干細胞的分化潛能從而替代受損細胞，改善受損臟器的部分功能[2]。然而，干細胞移植過程中因為缺乏相應的載體，導致移植細胞難以在移植區良好的存活和增殖，因此尋找一種能為細胞提供適宜的生長環境、有效減少細胞流失的生物材料顯得尤為重要[3-4]。誘導多能干細胞（iPSCs）是將與胚胎干細胞多能性密切相關的4個轉錄因子（Oct-4，Sox2、c-Myc和Klf）通過逆轉錄病毒導入到小鼠胚胎成纖維細胞和鼠尾成纖維細胞而重編程為的多能干細胞[5]。iPSCs在細胞形態、生長特點、基因表達譜和形成畸胎瘤方面與ESCs（胚胎干細胞）類似，也具有相似的全能性，能夠在體外適宜的條件下分化為心肌細胞、腦細胞、軟骨細胞等所有三胚層類型的細胞[6]，且解決了胚胎干細胞與生俱有的免疫排斥、倫理和道德等問題，是非常理想的種子細胞。細胞補片能夠為種子細胞提供生存和增殖的細胞外環境，防止細胞的流失。因此，細胞補片材料需要有良好的生物相容性、無毒及可降解等特性[7]。所以探索尋找一種適合細胞生長增殖的支架材料是制作細胞補片的重要環節之一。聚3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯（PHBHHx）作為PHA家族中的一員，已經證實與多種細胞能夠很好的融合[8]。具有作為生物醫學材料的潛力，但是作為iPSCs的補片材料應用到干細胞移植治療領域還缺乏相應的研究。本研究通過小鼠誘導多能干細胞（miPSCs）與PHBHHx材料補片共培養，觀察PHBHHx細胞補片對miPSCs粘附及增殖的影響，以探索尋找適合細胞粘附和增殖，并具有良好生物相容性和可降解特性的生物材料。
1 材料與方法
1.1 材料
孕13.5 d的昆明白鼠，由中國軍事科學院提供。小鼠誘導多能干細胞來自于中國科學院動物研究所。高糖DMEM（Hyclone）、1%的非必須氨基酸、L-谷氨酰胺、0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇、青鏈霉素、5%的血清替代物（SR）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.05%胰酶EDTA（Gibco）、絲裂霉素C（Sigma）、明膠（BD Phar-mingen），PHBHHx材料由清華大學化工系高分子研究所合成
1.2 方法
小鼠誘導多能干細胞飼養層的制備[9]：將孕期13.5 d的昆明白孕鼠拉頸處死，浸入酒精，放入超凈臺中，無菌條件下取出子宮，PBS充分洗去血跡。剪開子宮和胎膜，取出胚胎，用鑷子去其頭部和內臟，充分洗滌，將其剪成1 mm3以下的碎塊，濾網過濾去除未剪碎的組織塊，將濾過液吸于離心管中靜置5～10 min，上清吸棄，加入1 ml 0.25%胰酶EDTA溶液，輕吹并消化2 min，加入等體積的MEF培養液（含10%普通胎牛血清的高糖DMEM）終止消化，吹打重懸，移入離心機中，800 r/min，離心5 min，上清吸棄。計數后以5×105/ml重懸于MEF生長培養基上，37℃，5% CO2的細胞培養箱中培養至90%的融合度后傳代，傳至第三代后，10 μg/ml的絲裂霉素C處理細胞2.5 h，胰酶消化后，800 r/min離心4 min，收集細胞后重懸于培養基中，計數細胞，以5×104/ml接種于0.1%明膠包被的100 mm培養皿中，多余細胞凍存備用。
復蘇、培養小鼠誘導多能干細胞：從液氮罐中取出一支凍存的miPSCs，浸入37℃的水浴鍋中迅速解凍，移入15 ml離心管中，加入1 ml干細胞培養基（高糖DMEM、5%的干細胞胎牛血清、5%的血清替代物、1000 U/ml LIF、1%的非必須氨基酸、1%的L-谷氨酰胺、1%的青鏈霉素、0.1%的β-巰基乙醇），800 r/min離心4 min，棄去上清，2 ml干細胞培養基重懸細胞，接種于經過絲裂霉素C預處理的小鼠胚胎纖維細胞飼養層上，放入培養箱中培養，隔天更換培養基。當miPSCs克隆過大或者過密時消化傳代，差速貼壁法去除MEF，接種于未加MEF飼養層的培養皿中，繼續培養。
miPSCs的鑒定采用堿性磷酸酶染色：吸棄培養基，PBS洗2～3次，4%的多聚甲醛固定1～2 min（不要超過2 min），吸棄，PBS洗2次，吸出PBS，PBST潤洗一次；配制染色試劑（溶液A :溶液B :溶液C=50 μl:50 μl:400 μl），加適量的（使染色液覆蓋孔底）染色試劑，室溫避光放置10～15 min；將染色液吸出，PBS潤洗一次，然后保存在PBS溶液中，顯微鏡下觀察（分化的細胞無色，未分化細胞被染為藍/紫色）。免疫熒光染色：吸出培養基，PBS洗3次（用搖床），4%的多聚甲醛固定10 min，吸棄，PBS洗3遍，每次5 min。用0.1%Triton-X100處理細胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min。用5%牛血清蛋白（BSA）封閉30 min，PBS洗3遍。加入山羊抗小鼠一抗Nanog、SSE-4（1:200，PBS稀釋），4℃過夜，PBS洗3遍，加入兔抗山羊二抗（1:200，PBS稀釋）和DAPI染液，室溫避光45～60 min，PBS洗5次，加入適量封片劑后，指甲油固定，激光共聚焦顯微鏡下讀片。
與PHBHHx膜共培養及細胞活力測定：在接種miPSCs之前，PHBHHx膜用打孔器剪成直徑0.5 cm的圓形片，經75%酒精浸泡2 h，紫外線正反兩面各照射2 h消毒，放入96孔板中，保持膜表面平整，培養基浸泡過夜備用。將培養至三代的miPSCs經過0.25%胰酶-EDTA消化后，細胞計數，調整細胞濃度為1×104個/ml，接種至96孔板中，分為兩組，一組與細胞補片共培養，另一組用傳統的培養皿培養miPSCs，每孔加入干細胞培養基200 μl。在細胞培養3 d后，CCK-8法測定細胞活力。
掃描電鏡樣品制備：細胞在PHBHHx膜上粘附生長3 d后，PBS洗滌3次，用2.5%的戊二醛固定（冰上）；再經0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗10 min后用1%四氧化鋨固定液固定2 h（冰上）；然后再用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗10 min后用乙醇梯度脫水并經乙酸異戊脂浸泡10 min；臨界點干燥；噴金后掃描電鏡下觀察拍照[10]。
1.3 統計學分析
采用SPSS 19.0統計軟件對所得數據進行統計分析，計數資料均采用均數±標準差（
2 結果
光鏡下小鼠誘導多能干細胞的觀察到miPSCs呈克隆生長，形成集落、類似球形、邊緣齊整、立體感強、細胞排列緊密、細胞界限難以分清，見圖 1A。對呈簇生長的小鼠誘導多能干細胞經胰酶消化后，通過差速離心法去除MEF飼養層后進行堿性磷酸酶染色鑒定，見圖 1B（分化的細胞為無色，未分化細胞被染成藍紫色）。SSE-4和Nanog為干細胞的特異性標志蛋白，對miPSCs進行免疫熒光觀察SSE-4和Nanog的表達，見圖 1C和1D（細胞核被染為藍色，紅色為SSE-4和Nanog蛋白表達）。
圖1
光鏡下小鼠誘導多能干細胞觀察圖
注：A：小鼠誘導多能干細胞在光鏡下×200；B：miPSCs鑒定，AP染色×200；C：免疫熒光鑒定miPSCs標志蛋白SSE-4，細胞核為藍色，蛋白紅色；D：免疫熒光鑒定miPSCs標志蛋白Nanog，細胞核為藍色，蛋白紅色
miPSCs與PHBHHx膜共培養細胞活力測定示miPSCs生長迅速，一般培養3 d即可傳代，傳代后生長更快。當克隆長大后，胰酶消化后重懸細胞，細胞計數后接種于預先處理的PHBHHx膜中培養，在培養3 d后對其進行CCK-8測定細胞活力，結果見圖 2，PHBHHx膜OD值大于傳統的細胞培養皿培養的OD值（0.617±0.019 vs. 0.312±0.004，P < 0.05），PHBHHx膜培養效果明顯優于傳統的培養皿培養。并對miPSCs與PHBHHx膜共培養3 d后進行DAPI染色觀察miPSCs在PHBHHx膜上粘附生長情況，見圖 3，細胞與PHBHHx膜粘附良好，細胞生長迅速。
圖2
PHBHHx膜與miPSCs共培養3 d后細胞活力測定結果圖
圖3
miPSCs在PHBHHx膜上粘附生長行DAPI染色圖
掃描電鏡觀察miPSCs在PHBHHx膜上的生長粘附狀態，見圖 4，在miPSCs與PHBHHx膜共培養3 d后，吸棄培養基，PBS洗3遍后，用0.25%戊二醛固定后，制成掃描電鏡標本后上機檢測。細胞粘附在PHBHHx膜上，生長良好。
圖4
電鏡觀察miPSCs在PHBHHx膜上的生長粘附狀態圖
注：A：掃描電鏡觀察PHBHHx膜表面形態×1000；B：miPSCs在PHBHHx膜上生長×2000
3 討論
干細胞具有自我復制和分化能力，是目前進行細胞治療的主要種子細胞[11]。干細胞按照發育階段可以分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細胞。ESC是一種高度未分化的細胞，具有分化為體內所有細胞類型的能力。但其存在免疫排斥及倫理學等問題，限制了ESC的應用前景[12]。2006年，Takahashi等[5]通過轉入4種轉錄因子，成功的將成纖維細胞重新編程從而獲得了具有ESC特性的全能干細胞—誘導多能干細胞。iPSC與ESC在形態、增殖分化潛力、細胞表面抗原、類胚體和畸胎瘤生成能力方面與ESC類似，而且還避免了倫理學和細胞免疫排斥等問題，因此具有巨大的應用潛力[13-14]。心肌梗死是由于冠狀動脈狹窄或者閉塞導致的遠端心肌細胞缺血、缺氧而發生壞死性疾病，發病兇險、死亡率高、預后不良。目前的治療方法只能改善缺血區的心肌供血，并不能從根本上改變心肌細胞壞死的結局。而且，大片的心肌壞死后會導致心臟射血功能下降，出現心力衰竭，危及生命。
研究者在體外利用誘導多能干細胞分化為心肌細胞，注射到事先構建好的小鼠梗死模型中，與單純注入成纖維細胞相比，發現移植入誘導多能干細胞的小鼠左心室收縮功能得到了明顯改善，心室壁增厚和心室重構也得到了抑制，同時還增加了心電穩定性[15-16]。但是，干細胞移植治療的過程中，移植區細胞會隨著血流的沖刷或伴隨機械活動，導致移植細胞的流失[17]。所以，miPSCs移植到梗死心肌細胞表面需要載體依托，保證移植細胞能夠在心臟表面粘附并增殖。因此，我們需要尋找一種能夠為細胞生長增殖提供合適的生存環境，具有良好的生物相容性和物理特性，以及在體內可降解吸收的材料，提高移植細胞在移植區的存活和增殖，從而更好地治療疾病，改善疾病的預后。
生物可降解高分子聚合材料是組織工程學材料研究中最活躍的領域[18]。PHA家族是近年來被廣泛關注的新型生物材料[19]，由于組成各種PHA材料的單體結構不同，其機械性能和生物相容性也不同。PHBHHx是PHA家族中具有很好生物相容性、合適的物理特性和可降解特性的新型材料[20]。鑒于此，我們選擇PHBHHx支架材料作為細胞補片，將miPSCs與PHBHHx膜共培養。實驗中，通過DAPI染色可以看到小鼠誘導多能干細胞粘附在PHBHHx膜上，形態正常（圖 3）；制作電鏡標本后，經過掃面電鏡可以清晰的觀察到PHBHHx的表面形態，miPSCs在PHBHHx膜上粘附生長，擠作一團、呈簇生長、類似球形。3 d后進行CCK-8法測定細胞的活力，酶標儀測定450 mm處的吸光度，與PHBHHx膜共培養組OD值為0.617±0.019，顯著大于傳統的細胞培養皿培養的OD值0.312±0.004（P < 0.05）；說明PHBHHx膜不僅能夠與miPSCs良好的融合，而且miPSCs在PHBHHx材料上生長更加活躍，PHBHHx可以促進miPSCs的增殖。因此，PHBHHx材料有希望成為治療多種疾病的細胞培養支架材料。
本實驗雖然證明了PHBHHx與miPSCs具有良好的相容性，miPSCs在PHBHHx膜上可以很好的粘附、存活和增殖，但是，我們并不知道補片材料能否促進miPSCs的分化以及補片材料移植入體內降解吸收后對機體的影響，是否會發生免疫排斥等情況。接下來我們會進一步研究PHBHHx作為心肌補片能否促進miPSCs向心肌細胞分化，為干細胞治療心肌梗死走上臨床奠定實驗基礎。
