引用本文： 馬義祥, 穆軍升, 張健群, 伯平. 維生素C促進胚胎干細胞與P(3HB-co-4HB)共培養分化生成心肌補片的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(5): 496-500. doi: 10.7507/1007-4848.20160116 復制
心血管疾病發病率逐年提高，已成為目前全球發病率最高的疾病。心肌梗塞可以通過內科介入或者外科搭橋手術進行姑息性的治療，臨床上多數能達到令人滿意的效果，但心肌梗死后心肌細胞受到嚴重損傷，無法恢復。干細胞移植是利用干細胞的定向誘導分化的潛能去取代或彌補受到損害的組織，這被認為是一個很有前景的治療方法。到目前為止，研究人員已經可以在體外順利的提取并培養胚胎干細胞。通過懸滴法制備擬胚體（EBs），在定向誘導劑的誘導下可將EBs誘導為心肌細胞[1-3]。在細胞移植過程中缺乏有效的運輸載體會導致部分干細胞丟失，同時也會影響干細胞的成活和增殖，因此尋找一種合適的生物材料在減少干細胞的流失的同時不影響干細胞繁殖就顯得十分重要[4-6]。三維細胞培養技術（three dimensional cell culture，TDCC）是指將具有三維結構的支架載體與干細胞在體外共同培養，使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長，構成三維的細胞-載體復合物，三維支架載體是三維細胞培養技術的關鍵。聚（3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯）[P（3HB-co-4HB ）]是一種新型的第3代聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA）材料，具有一定的機械強度、良好生物相容性并且是在體內可完全降解的三維高分子材料，因其具有良好的物理性能引起了廣泛的關注。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和試劑
實驗于2014年7月至2015年8月在北京市心肺血管疾病研究所、省部共建心血管重塑重點實驗室完成。實驗選取了3只清潔級雌性昆明小白鼠，平均體重為37.5 g，購自首都醫科大學附屬北京安貞醫院動物房。小鼠胚胎干細胞購于上海生命科學院R1干細胞株。用到的主要試劑有高糖DMEM（Gibco）、胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸、L谷氨酰胺、白血病抑制因子（LIF，Gibco公司）、明膠（BD Pharmingen）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青鏈霉素（Gibco）、絲裂霉素C（Sigma）等。
1.2 方法
提取和培養小鼠胚胎纖維狀細胞（mouse embr-yonic fibrous cell，MEF）：取懷孕12.5～14 d的昆明小白鼠，頸椎脫頸法處死，無菌條件下取出胎鼠，只保留胎鼠的軀干部分，其余部分去除。用眼科剪將其剪成1 mm3以下的碎片，消化離心過濾后搜集濾液，離心去上清液，重懸后鋪板培養。當傳至第三代時，用絲裂霉素C處理。多余細胞凍存。
小鼠胚胎干細胞的復蘇、培養和傳代：從液氮罐中取出1管ES細胞，水浴鍋中1 min內迅速解凍，然后加入到含有ES培養基的離心管中，離心5 min，除去上清液，重懸細胞轉移至已經鋪好MEF細胞的培養瓶中。第二天換液，以后隔天換液。
懸滴法制備EBs：胰酶消化處于對數成長期的ESCs，離心后重懸，用不含LIF的培養基稀釋，懸滴于培養皿的蓋子上面，每滴含400個細胞，培養皿中加入PBS，2天后EBs形成。
制作細胞補片及維生素C誘導：消毒處理P（3HB-co-4HB）生物膜，按24孔板的圓孔大小剪出圓形片，培養基浸潤后備用。將EBs種植到生物膜表面，每個孔里種植5個擬胚體。實驗組用含有維生素C（濃度1×10-4 mol/L）的培養基培養，對照組使用不含維生素C的培養基，兩組培養基都不添加LIF因子，每天換液，誘導心肌補片。
免疫熒光染色：在鋪有心肌補片的24孔板中，正常換液培養至第13天。多聚甲醛固定細胞后使用PBS沖洗。加入Triton X-100（由PBS配制） 對細胞進行10 min打孔。5%牛血清蛋白（BSA） 封閉30 min后使用PBS沖洗。加入l抗cTnT、α-actin，4℃孵育20 h，PBS沖洗后加入二抗，常溫孵育30 min后，PBS沖洗。同時，滴加DAPI染料觀察心肌細胞核的形態。加入20 μl封片劑封片后，共聚焦顯微鏡下讀片。
掃描電鏡觀察心肌補片：心肌補片標本用去離子水進行洗滌后經戊二醛固定，4 ℃下保存。補片經冷凍、干燥脫水后，使用金屬鍍膜法制成掃描電鏡標本，上機觀察拍照記錄。
誘導分化效率曲線繪制：從EB與補片共培養第7天開始，隔天觀察并統計添加誘導劑組和不添加誘導組各15個心肌補片上的心肌細胞，用心肌細胞特異性標志物肌鈣蛋白標記心肌細胞，DAPI熒光染色標記存活細胞，每3個心肌補片為一組，一組15個擬胚體，計算誘導分化效率，繪制分化效率隨誘導時間的分布圖。
1.3 統計學分析
使用SPSS20.0軟件進行統計分析，正態分布的計量使用均數±標準差（
2 結果
2.1 光學顯微鏡下的MEF和ESCs
在光學顯微鏡下觀察，MEF細胞貼壁生長，以長梭形為主，也有少部分為多邊形或呈現不規則形狀。細胞大小不均，中間有卵圓形核。MEF細胞生長迅速，細胞生長每隔3～4 d就接近匯合（圖 1a）。ESCs排列緊密呈集落狀生長，細胞和周圍存在明顯界限，細胞核較大，表面有折光較強的脂狀小滴。ESCs每隔5天傳代一次（圖 1b）。
圖1
MEF、ESCs在光學顯微鏡鏡下的形態
注：a為MEF；b為ESCs
2.2 免疫熒光學顯微鏡觀察心肌補片
維生素C誘導EB 13 d后，對EB進行心肌特異性標志物cTnT、α-actin的免疫熒光染色，可以看到EB的cTnT和α-actin染色都呈陽性。經共聚焦顯微鏡觀察cTnT的免疫熒光染色為紅色，α-actin的免疫熒光染色為綠色（圖 2）。
圖2
光學顯微鏡鏡下心肌補片的熒光染色 ×100
注：a為cTnT染色；b為α-actin染色
2.3 掃描電鏡觀察心肌補片
電鏡下觀察空白P（3HB-co-4HB）的材料形態（圖 3a）。高倍數下觀察可見心肌補片形態，膜的纖維細絲環繞在心肌樣細胞的周圍，擬胚體與P（3HB-co-4HB）共培養形成心肌補片（圖 3b）。
圖3
心肌補片的掃描電鏡下形態 ×1000
注：a為電鏡下空白生物膜的觀察圖；b為高倍數下觀察圖
2.4 分化效率隨誘導時間的分布圖
兩組之間進行比較，顯示添加維生素C組的誘導分化效率明顯高于不添加維生素C組，差異有統計學意義（P < 0.05，圖 4）。
圖4
兩組分化效率隨誘導時間的分布圖
3 討論
隨著細胞學和組織工程學研究的深入，干細胞移植技術逐漸成為治療心血管疾病的熱點[7-9]。ESCs具有很高的向心肌細胞分化的傾向[10]，人和小鼠的基因水平高度同源[11]，干細胞誘導分化為心肌細胞應用于臨床之前，小鼠是最常用的實驗移植宿主。將ESCs移植到梗死的心肌表面需要有合適的補片材料作為載體。
三維補片材料需要有以下特點：首先，孔內部是連通的且間隙合適，這樣才能使得細胞與細胞之間信號傳輸、養料和氧氣的輸送更為便捷，使細胞更易生長增殖；材料可在體內降解且細胞相容性好[12]；材料可承受一定壓力，有助于組織的修復等[13]。P（3HB-co-4HB）的生物相容性及降解吸收等物理特性比聚-β-羥丁酸（polyhydroxybutyrate,PHB）更優越[14-15]。有報道表明P（3HB-co-4HB）可作為醫學生物材料應用于臨床治療疾病[16]。但是P（3HB-co-4HB）作為ES細胞的補片材料應用于干細胞移植治療尚缺乏研究，普通的二維培養模式下維生素C可顯著提高ESCs誘導分化為心肌細胞的效率[17]，但是在胚胎干細胞與P（3HB-co-4HB）共培養中維生素C是否還能促進胚胎干細胞誘導分化還沒有得到證實。本研究通過對比添加和不添加維生素C作為誘導因子的條件下，將ESCs與P（3HB-co-4HB）三維生物補片材料共同培養，觀察心肌細胞在三維生物膜上的生長、增殖及誘導分化。分析并計算兩組的誘導分化效率曲線，得到維生素C是否在胚胎干細胞與P（3HB-co-4HB）共培養時能促進分化為心肌補片。從而在尋找到一種干細胞治療心肌梗死的心肌補片支架材料的同時證明了維生素C可以促進胚胎干細胞與P（3HB-co-4HB）共培養分化成心肌補片。
本文中，對比研究添加和不添加維生素C作為誘導因子，誘導小鼠ES細胞與P（3HB-co-4HB）共培養分化成心肌補片。本組實驗結果中cTnT、α-actin免疫熒光染色陽性，表明ES擬胚體細胞在支架上成功誘導為心肌細胞。利用掃描電鏡觀察心肌補片，可看到纖維細絲穿過或包繞心肌樣細胞，誘導成功的心肌細胞在三維支架上生長形成心肌補片。對比觀察兩組試驗結果可知兩組分化效率都隨著誘導時間在增高，添加維生素C組比不添加維生素C組明顯增高了誘導分化率，兩者差異有統計學意義（P < 0.05）。本實驗表明P（3HB-co-4HB）對ESCs無明顯的損害，ESCs能在三維膜上生長并誘導分化形成心肌補片。因此，P（3HB-co-4HB)有希望成為干細胞移植治療心肌梗死的補片材料之一。添加維生素C作為誘導劑可以促進胚胎干細胞與P（3HB-co-4HB）共培養分化成心肌補片。
此外，本研究尚存在不足之處：（1）需進一步確定P（3HB-co-4HB）降解吸收后對機體的影響以及補片材料的植入對生物免疫系統是否有傷害。（2）并不是所有的擬胚體都能誘導分化為心肌細胞，分化的純度不夠高、雜細胞較多，誘導技術還有待改良。（3）心肌補片種植后的具體療效還有待行動物實驗來證明。
心血管疾病發病率逐年提高，已成為目前全球發病率最高的疾病。心肌梗塞可以通過內科介入或者外科搭橋手術進行姑息性的治療，臨床上多數能達到令人滿意的效果，但心肌梗死后心肌細胞受到嚴重損傷，無法恢復。干細胞移植是利用干細胞的定向誘導分化的潛能去取代或彌補受到損害的組織，這被認為是一個很有前景的治療方法。到目前為止，研究人員已經可以在體外順利的提取并培養胚胎干細胞。通過懸滴法制備擬胚體（EBs），在定向誘導劑的誘導下可將EBs誘導為心肌細胞[1-3]。在細胞移植過程中缺乏有效的運輸載體會導致部分干細胞丟失，同時也會影響干細胞的成活和增殖，因此尋找一種合適的生物材料在減少干細胞的流失的同時不影響干細胞繁殖就顯得十分重要[4-6]。三維細胞培養技術（three dimensional cell culture，TDCC）是指將具有三維結構的支架載體與干細胞在體外共同培養，使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長，構成三維的細胞-載體復合物，三維支架載體是三維細胞培養技術的關鍵。聚（3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯）[P（3HB-co-4HB ）]是一種新型的第3代聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA）材料，具有一定的機械強度、良好生物相容性并且是在體內可完全降解的三維高分子材料，因其具有良好的物理性能引起了廣泛的關注。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和試劑
實驗于2014年7月至2015年8月在北京市心肺血管疾病研究所、省部共建心血管重塑重點實驗室完成。實驗選取了3只清潔級雌性昆明小白鼠，平均體重為37.5 g，購自首都醫科大學附屬北京安貞醫院動物房。小鼠胚胎干細胞購于上海生命科學院R1干細胞株。用到的主要試劑有高糖DMEM（Gibco）、胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸、L谷氨酰胺、白血病抑制因子（LIF，Gibco公司）、明膠（BD Pharmingen）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青鏈霉素（Gibco）、絲裂霉素C（Sigma）等。
1.2 方法
提取和培養小鼠胚胎纖維狀細胞（mouse embr-yonic fibrous cell，MEF）：取懷孕12.5～14 d的昆明小白鼠，頸椎脫頸法處死，無菌條件下取出胎鼠，只保留胎鼠的軀干部分，其余部分去除。用眼科剪將其剪成1 mm3以下的碎片，消化離心過濾后搜集濾液，離心去上清液，重懸后鋪板培養。當傳至第三代時，用絲裂霉素C處理。多余細胞凍存。
小鼠胚胎干細胞的復蘇、培養和傳代：從液氮罐中取出1管ES細胞，水浴鍋中1 min內迅速解凍，然后加入到含有ES培養基的離心管中，離心5 min，除去上清液，重懸細胞轉移至已經鋪好MEF細胞的培養瓶中。第二天換液，以后隔天換液。
懸滴法制備EBs：胰酶消化處于對數成長期的ESCs，離心后重懸，用不含LIF的培養基稀釋，懸滴于培養皿的蓋子上面，每滴含400個細胞，培養皿中加入PBS，2天后EBs形成。
制作細胞補片及維生素C誘導：消毒處理P（3HB-co-4HB）生物膜，按24孔板的圓孔大小剪出圓形片，培養基浸潤后備用。將EBs種植到生物膜表面，每個孔里種植5個擬胚體。實驗組用含有維生素C（濃度1×10-4 mol/L）的培養基培養，對照組使用不含維生素C的培養基，兩組培養基都不添加LIF因子，每天換液，誘導心肌補片。
免疫熒光染色：在鋪有心肌補片的24孔板中，正常換液培養至第13天。多聚甲醛固定細胞后使用PBS沖洗。加入Triton X-100（由PBS配制） 對細胞進行10 min打孔。5%牛血清蛋白（BSA） 封閉30 min后使用PBS沖洗。加入l抗cTnT、α-actin，4℃孵育20 h，PBS沖洗后加入二抗，常溫孵育30 min后，PBS沖洗。同時，滴加DAPI染料觀察心肌細胞核的形態。加入20 μl封片劑封片后，共聚焦顯微鏡下讀片。
掃描電鏡觀察心肌補片：心肌補片標本用去離子水進行洗滌后經戊二醛固定，4 ℃下保存。補片經冷凍、干燥脫水后，使用金屬鍍膜法制成掃描電鏡標本，上機觀察拍照記錄。
誘導分化效率曲線繪制：從EB與補片共培養第7天開始，隔天觀察并統計添加誘導劑組和不添加誘導組各15個心肌補片上的心肌細胞，用心肌細胞特異性標志物肌鈣蛋白標記心肌細胞，DAPI熒光染色標記存活細胞，每3個心肌補片為一組，一組15個擬胚體，計算誘導分化效率，繪制分化效率隨誘導時間的分布圖。
1.3 統計學分析
使用SPSS20.0軟件進行統計分析，正態分布的計量使用均數±標準差（
2 結果
2.1 光學顯微鏡下的MEF和ESCs
在光學顯微鏡下觀察，MEF細胞貼壁生長，以長梭形為主，也有少部分為多邊形或呈現不規則形狀。細胞大小不均，中間有卵圓形核。MEF細胞生長迅速，細胞生長每隔3～4 d就接近匯合（圖 1a）。ESCs排列緊密呈集落狀生長，細胞和周圍存在明顯界限，細胞核較大，表面有折光較強的脂狀小滴。ESCs每隔5天傳代一次（圖 1b）。
圖1
MEF、ESCs在光學顯微鏡鏡下的形態
注：a為MEF；b為ESCs
2.2 免疫熒光學顯微鏡觀察心肌補片
維生素C誘導EB 13 d后，對EB進行心肌特異性標志物cTnT、α-actin的免疫熒光染色，可以看到EB的cTnT和α-actin染色都呈陽性。經共聚焦顯微鏡觀察cTnT的免疫熒光染色為紅色，α-actin的免疫熒光染色為綠色（圖 2）。
圖2
光學顯微鏡鏡下心肌補片的熒光染色 ×100
注：a為cTnT染色；b為α-actin染色
2.3 掃描電鏡觀察心肌補片
電鏡下觀察空白P（3HB-co-4HB）的材料形態（圖 3a）。高倍數下觀察可見心肌補片形態，膜的纖維細絲環繞在心肌樣細胞的周圍，擬胚體與P（3HB-co-4HB）共培養形成心肌補片（圖 3b）。
圖3
心肌補片的掃描電鏡下形態 ×1000
注：a為電鏡下空白生物膜的觀察圖；b為高倍數下觀察圖
2.4 分化效率隨誘導時間的分布圖
兩組之間進行比較，顯示添加維生素C組的誘導分化效率明顯高于不添加維生素C組，差異有統計學意義（P < 0.05，圖 4）。
圖4
兩組分化效率隨誘導時間的分布圖
3 討論
隨著細胞學和組織工程學研究的深入，干細胞移植技術逐漸成為治療心血管疾病的熱點[7-9]。ESCs具有很高的向心肌細胞分化的傾向[10]，人和小鼠的基因水平高度同源[11]，干細胞誘導分化為心肌細胞應用于臨床之前，小鼠是最常用的實驗移植宿主。將ESCs移植到梗死的心肌表面需要有合適的補片材料作為載體。
三維補片材料需要有以下特點：首先，孔內部是連通的且間隙合適，這樣才能使得細胞與細胞之間信號傳輸、養料和氧氣的輸送更為便捷，使細胞更易生長增殖；材料可在體內降解且細胞相容性好[12]；材料可承受一定壓力，有助于組織的修復等[13]。P（3HB-co-4HB）的生物相容性及降解吸收等物理特性比聚-β-羥丁酸（polyhydroxybutyrate,PHB）更優越[14-15]。有報道表明P（3HB-co-4HB）可作為醫學生物材料應用于臨床治療疾病[16]。但是P（3HB-co-4HB）作為ES細胞的補片材料應用于干細胞移植治療尚缺乏研究，普通的二維培養模式下維生素C可顯著提高ESCs誘導分化為心肌細胞的效率[17]，但是在胚胎干細胞與P（3HB-co-4HB）共培養中維生素C是否還能促進胚胎干細胞誘導分化還沒有得到證實。本研究通過對比添加和不添加維生素C作為誘導因子的條件下，將ESCs與P（3HB-co-4HB）三維生物補片材料共同培養，觀察心肌細胞在三維生物膜上的生長、增殖及誘導分化。分析并計算兩組的誘導分化效率曲線，得到維生素C是否在胚胎干細胞與P（3HB-co-4HB）共培養時能促進分化為心肌補片。從而在尋找到一種干細胞治療心肌梗死的心肌補片支架材料的同時證明了維生素C可以促進胚胎干細胞與P（3HB-co-4HB）共培養分化成心肌補片。
本文中，對比研究添加和不添加維生素C作為誘導因子，誘導小鼠ES細胞與P（3HB-co-4HB）共培養分化成心肌補片。本組實驗結果中cTnT、α-actin免疫熒光染色陽性，表明ES擬胚體細胞在支架上成功誘導為心肌細胞。利用掃描電鏡觀察心肌補片，可看到纖維細絲穿過或包繞心肌樣細胞，誘導成功的心肌細胞在三維支架上生長形成心肌補片。對比觀察兩組試驗結果可知兩組分化效率都隨著誘導時間在增高，添加維生素C組比不添加維生素C組明顯增高了誘導分化率，兩者差異有統計學意義（P < 0.05）。本實驗表明P（3HB-co-4HB）對ESCs無明顯的損害，ESCs能在三維膜上生長并誘導分化形成心肌補片。因此，P（3HB-co-4HB)有希望成為干細胞移植治療心肌梗死的補片材料之一。添加維生素C作為誘導劑可以促進胚胎干細胞與P（3HB-co-4HB）共培養分化成心肌補片。
此外，本研究尚存在不足之處：（1）需進一步確定P（3HB-co-4HB）降解吸收后對機體的影響以及補片材料的植入對生物免疫系統是否有傷害。（2）并不是所有的擬胚體都能誘導分化為心肌細胞，分化的純度不夠高、雜細胞較多，誘導技術還有待改良。（3）心肌補片種植后的具體療效還有待行動物實驗來證明。
