引用本文： 段鴻濤, 劉紅剛, 閆小龍, 張志培, 李小飛. TGF-β/Smad介導上皮細胞間質轉化在氣管移植后移植體狹窄中的機制研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(5): 485-489. doi: 10.7507/1007-4848.20160114 復制
氣管移植應用于因外傷、腫瘤等原因切除氣管后的氣管重建[1]。但是，氣管移植后移植體出現不同程度的移植體狹窄[2-3]。有學者嘗試用頸部胸骨舌骨肌包裹氣管、用大網膜包裹氣管的方法解決氣管血供，采用深低溫冷凍去除上皮細胞去除免疫抗原[4]，但這些方法都沒有徹底解決氣管狹窄[5-6]。目前，關于氣管移植后移植體狹窄的致病機理并未完全清楚，因此明確氣管移植后移植體狹窄的致病機理仍是亟待解決的難題。
上皮細胞間質轉化（epithelial mesenchymal tran-sition，EMT），是指在刺激因子的作用下上皮細胞發生向間質細胞轉化的一種過程，主要表現為上皮細胞形態由典型的鵝卵石樣變化為長條形、梭形樣間質細胞形態，多種上皮細胞表型分子如E-cadherin、ZO-1等表達下調，伴隨著間質細胞表型分子如平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）等表達量增加[7-8]。既往研究表明TGF-β/Smad信號通路是調節上皮細胞間質轉化的主要信號通路。同時，轉錄因子ZEB-1、Snail1等參與此過程[9-10]。本實驗采用wistar大鼠-SD大鼠氣管原位移植模型，探討氣管移植后移植體狹窄的機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、實驗材料及分組
1.1.1 實驗動物
體重約180～220 g wistar大鼠（n=25）與Sprague Dawley（SD）大鼠（n=50），由第四軍醫大學實驗動物中心提供。所有試驗大鼠均從動物中心領取，飼養于25℃的動物飼養室，動物可隨意進食、飲水。
1.1.2 實驗藥品及試劑
E-cadherin抗體、vimentin抗體、α-SMA抗體、p-Smad2/3抗體購自CST公司。ZEB1抗體、Snail1抗體購自博鰲森生物有限公司。羊抗兔IgG、蛋白凝膠試劑盒購自西安精彩生物制劑有限公司。其他相關試劑都由西安小草植物有限公司提供。
1.1.3 分組
將50只體重180～220 g雄性大鼠隨機均分為2組，取未移植大鼠氣管為對照組，實驗組為經體重匹配的wistar-SD大鼠行氣管原位移植術后大鼠。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物模型建立
實驗組wistar-SD大鼠氣管原位移植模型按照標準化步驟實施[11]。收取wistar大鼠氣管，將wistar大鼠5～6個環的氣管按體重配對SD大鼠進行氣管原位移植。做頸正中切口；分離包膜，暴露氣管；氣管甲狀軟骨以下3～4個環處離斷氣管；取供體氣管，用7-0縫線行遠端氣管斷端縫合；7-0縫線近端氣管縫合；逐層縫合肌肉、皮膚。
1.2.2 氣管狹窄率指標測定
對照組為未手術SD大鼠（n=25）。實驗組（n=25），氣管移植后第3、7、10、14、35、90 天每個時間點分別處死大鼠三只。將移植體進行HE染色，計算大鼠移植體狹窄程度。移植體狹窄程度（移植體中央切片測量數據，即：圖 1右劃紅線處）。纖維化率：APP（image pro 6.0）計算黏膜下層到氣管軟骨之間的面積除以氣管軟骨層以上面積的比值（圖 1）。
圖1
氣管移植后移植體于術后第3天即可出現狹窄
注：A為纖維化率=黏膜下層到氣管軟骨之間的面積/氣管軟骨層以上面積；B為氣管移植后各個時間點內纖維化率；C為氣管移植大體標本，移植體中央切片測量數據，即劃紅線處；與對照組比較，*
1.2.3 氣管狹窄率指標測定
用免疫組織化學方法檢測氣管移植后移植體內TGF-β1及上皮細胞間質轉化相關分子E-cadherin、vimentin、α-SMA表達量以及信號通路蛋白p-Smad2/3和轉錄因子ZEB1、Snail1表達量。對照組為未手術SD大鼠（n=25）。實驗組（n=25），氣管移植后第3、7、10、14、35、90 d每個時間點分別處死大鼠三只。對照組檢查方法及指標同實驗組。免疫組織化學半定量方法（移植體中央切片測量數據，即：圖 1C劃紅線處）：計算Log10（IOD）值。計算方法為：每張切片留取0°、45°、90°、135°、180°（設定氣管膜部平行線為0°）五個點在同一亮度的情況下（關閉自動白平衡）抓拍1 360×1 024像素200倍照片。設置APP（image pro 6.0）軟件measurement parameters包括density mean，area sum和IOD；optical density設置為hue，0～30；saturation，0～255；intensity，0～255，將圖片中選取的部分轉化為灰度值，測量得出IOD值。計算所得log10（IOD）即為測量值[12]。
1.3 統計學分析
采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析，所有試驗數據均以均數±標準差（
2 結果
2.1 氣管移植后移植體與對照組相比出現明顯氣管狹窄
成功建立了wistar大鼠-SD大鼠的原位氣管移植模型，大鼠遠期生存率可以達到90%以上。HE染色表明對照組纖維化率為0.171±0.020，氣管移植術后第3天纖維化率為0.537±0.013，兩者差異有統計學意義（P < 0.01），表明移植體氣管狹窄。其中，氣管移植后移植體纖維化率在第90天時高達0.626±0.016（圖 1）。
2.2 氣管移植后移植體與對照組相比TGF-β1高表達
移植體內TGF-β1主要表達在氣管軟骨、氣管黏膜下層以及氣管黏膜層，其表達量明顯高于對照組（圖 2）。
圖2
氣管移植后移植體內TGF-β1表達量
注：A為TGF-β1主要表達在氣管黏膜層、黏膜下層以及軟骨環（褐色部分為目的蛋白）；B為氣管移植后移植體內TGF-β1蛋白定量；與對照組比較*
2.3 氣管移植后移植體與對照組相比EMT相關表型分子呈動態變化
氣管移植后第3天移植體中出現vimentin表達陽性的上皮細胞，其表達量在術后第7天達到高峰；術后第3天上皮細胞中E-cadherin表達量明顯減少，其表達量在術后第7天減少至最低量；雖然上皮細胞內沒有表達α-SMA，但其在黏膜下層表達量明顯增加（圖 3）。
圖3
氣管移植后移植體內EMT相關表達分子表達量
注：A為E-Cadherin在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；B為Vimentin在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；C為α-SMA在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；D為氣管移植后移植體內E-Cadherin在移植后各個時間點內蛋白定量；E為氣管移植后移植體內Vimentin在移植后各個時間點內蛋白定量；F為氣管移植后移植體內α-SMA在移植后各個時間點內蛋白定量；*與對照組比較
2.4 氣管移植后移植體與對照組相比Smad信號通路分子以及轉錄因子ZEB1、Snail1高表達
信號通路蛋白p-Smad2/3主要表達在細胞核，術后第3天在移植體內明顯表達且在術后第7天達到最高峰，對照組中沒有檢測到p-Smad2/3蛋白表達。轉錄因子ZEB1、Snail1是上皮細胞間質轉化重要的轉錄因子。實驗證明，轉錄因子ZEB1主要表達在細胞核，術后第3天在移植體內明顯表達并達到最大值，但術后3天后整體呈減少趨勢，于術后第35天已無法檢測到表達。轉錄因子Snail1主要表達在細胞核及細胞漿，術后第3天在移植體內明顯表達并在移植后第3天達到高峰，雖然在移植術后3 d后Snail1表達量呈減少趨勢，但在術后第10天呈小波峰增多，術后第35天已無法檢測到表達。對照組中未檢測到ZEB1、Snail1蛋白表達（圖 4）。
圖4
氣管移植后移植體內Smad蛋白及轉錄因子ZEB1、Snail1表達量
注：A為p-Smad2/3在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；B為ZEB1在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；C為Snail1在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；D為氣管移植后移植體內p-Smad2/3在移植后各個時間點內蛋白定量；E為氣管移植后移植體內ZEB1在移植后各個時間點內蛋白定量；F為氣管移植后移植體內Snail1在移植后各個時間點內蛋白定量；*與對照組比較
3 討論
本實驗證明大鼠氣管移植后第3天即出現移植體狹窄，目前的實驗數據表明術后第3、7天氣管狹窄程度高于術后第10天（P < 0.01，P=0.003），可能是因為大鼠移植后氣管上皮在第3天發生缺血-再灌注損傷致使氣管組織水腫或上皮壞死，在術后第3～7天氣管上皮發生再生形成復層上皮，表現為氣管狹窄較第10天嚴重[13-14]。
氣管移植后移植體狹窄本質上是氣管重塑，其主要特征是異常上皮修復以及促使成纖維細胞集聚和成纖維細胞分泌黏膜下細胞外基質沉積。所以成纖維細胞可能是氣管纖維化的重要原因。研究表明，EMT是組織中成纖維細胞來源的重要組成部分[15-16]。研究[17]表明在腎纖維化當中，成纖維細胞有65%來源于局部成纖維細胞聚集，而EMT是這一部分成纖維細胞的重要來源。氣管移植后移植體內存在EMT。這是基于本實驗的發現，在大鼠氣管移植后第7天，隨著vimentin表達陽性的上皮細胞增加，上皮細胞中E-cadherin表達量減少，這表明氣管移植后移植體內發生EMT，同時也表明了氣管移植后移植體內EMT呈動態變化，于術后第7天達到最高峰，術后35天基本已無法檢測到相關表達分子的變化，提示此時EMT的作用已經很弱。但是，另一EMT表型分子α-SMA并沒有在上皮細胞中表達，但其在黏膜下表達量逐漸增加，這可能是因為α-SMA也是纖維組織的表型分子，其表達量逐漸增加預示著移植后移植體中纖維化逐漸增加[18]。
Peinado等在敲除基因大鼠體內研究發現，TGF-β/Smad信號通路是EMT中最重要的信號通路[19]。TGF-β1在組織發育、炎癥、癌癥進展當中具有非常重要的作用[20]。在病理過程中，TGF-β1可以明顯誘導肺泡上皮細胞發生EMT[21]。在本實驗中，移植體內TGF-β1表達量較之對照組明顯增加，同時其表達量的變化趨勢與EMT動態變化趨勢一致，術后第35天明顯減少。與此相對應，p-Smad 2/3也是術后第3天出現，術后第7天達到高峰，證明TGF-β/Smad信號通路確實參與氣管移植后移植體狹窄。此外，轉錄因子ZEB1、Snail1的變化要早于EMT相關分子以及信號通路蛋白表達變化，都是由術后第3天達到最高表達量。Snail1的表達量具有波動性，術后第10天小高峰可能是因為氣管移植后，移植體上皮一般在術后第7～12 d會發生再次損傷[22]，推測是由于上皮損傷后支氣管上皮細胞修復過程當中導致轉錄因子Snail1增多[23]。
總之，氣管移植后移植體狹窄中存在EMT過程，同時其受到TGF-β/Smad信號通路以及轉錄因子ZEB1、Snail1的調節。我們猜測，EMT可能是移植體狹窄的使動因素，但具體機制及作用需要更多的研究。
氣管移植應用于因外傷、腫瘤等原因切除氣管后的氣管重建[1]。但是，氣管移植后移植體出現不同程度的移植體狹窄[2-3]。有學者嘗試用頸部胸骨舌骨肌包裹氣管、用大網膜包裹氣管的方法解決氣管血供，采用深低溫冷凍去除上皮細胞去除免疫抗原[4]，但這些方法都沒有徹底解決氣管狹窄[5-6]。目前，關于氣管移植后移植體狹窄的致病機理并未完全清楚，因此明確氣管移植后移植體狹窄的致病機理仍是亟待解決的難題。
上皮細胞間質轉化（epithelial mesenchymal tran-sition，EMT），是指在刺激因子的作用下上皮細胞發生向間質細胞轉化的一種過程，主要表現為上皮細胞形態由典型的鵝卵石樣變化為長條形、梭形樣間質細胞形態，多種上皮細胞表型分子如E-cadherin、ZO-1等表達下調，伴隨著間質細胞表型分子如平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）等表達量增加[7-8]。既往研究表明TGF-β/Smad信號通路是調節上皮細胞間質轉化的主要信號通路。同時，轉錄因子ZEB-1、Snail1等參與此過程[9-10]。本實驗采用wistar大鼠-SD大鼠氣管原位移植模型，探討氣管移植后移植體狹窄的機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、實驗材料及分組
1.1.1 實驗動物
體重約180～220 g wistar大鼠（n=25）與Sprague Dawley（SD）大鼠（n=50），由第四軍醫大學實驗動物中心提供。所有試驗大鼠均從動物中心領取，飼養于25℃的動物飼養室，動物可隨意進食、飲水。
1.1.2 實驗藥品及試劑
E-cadherin抗體、vimentin抗體、α-SMA抗體、p-Smad2/3抗體購自CST公司。ZEB1抗體、Snail1抗體購自博鰲森生物有限公司。羊抗兔IgG、蛋白凝膠試劑盒購自西安精彩生物制劑有限公司。其他相關試劑都由西安小草植物有限公司提供。
1.1.3 分組
將50只體重180～220 g雄性大鼠隨機均分為2組，取未移植大鼠氣管為對照組，實驗組為經體重匹配的wistar-SD大鼠行氣管原位移植術后大鼠。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物模型建立
實驗組wistar-SD大鼠氣管原位移植模型按照標準化步驟實施[11]。收取wistar大鼠氣管，將wistar大鼠5～6個環的氣管按體重配對SD大鼠進行氣管原位移植。做頸正中切口；分離包膜，暴露氣管；氣管甲狀軟骨以下3～4個環處離斷氣管；取供體氣管，用7-0縫線行遠端氣管斷端縫合；7-0縫線近端氣管縫合；逐層縫合肌肉、皮膚。
1.2.2 氣管狹窄率指標測定
對照組為未手術SD大鼠（n=25）。實驗組（n=25），氣管移植后第3、7、10、14、35、90 天每個時間點分別處死大鼠三只。將移植體進行HE染色，計算大鼠移植體狹窄程度。移植體狹窄程度（移植體中央切片測量數據，即：圖 1右劃紅線處）。纖維化率：APP（image pro 6.0）計算黏膜下層到氣管軟骨之間的面積除以氣管軟骨層以上面積的比值（圖 1）。
圖1
氣管移植后移植體于術后第3天即可出現狹窄
注：A為纖維化率=黏膜下層到氣管軟骨之間的面積/氣管軟骨層以上面積；B為氣管移植后各個時間點內纖維化率；C為氣管移植大體標本，移植體中央切片測量數據，即劃紅線處；與對照組比較，*
1.2.3 氣管狹窄率指標測定
用免疫組織化學方法檢測氣管移植后移植體內TGF-β1及上皮細胞間質轉化相關分子E-cadherin、vimentin、α-SMA表達量以及信號通路蛋白p-Smad2/3和轉錄因子ZEB1、Snail1表達量。對照組為未手術SD大鼠（n=25）。實驗組（n=25），氣管移植后第3、7、10、14、35、90 d每個時間點分別處死大鼠三只。對照組檢查方法及指標同實驗組。免疫組織化學半定量方法（移植體中央切片測量數據，即：圖 1C劃紅線處）：計算Log10（IOD）值。計算方法為：每張切片留取0°、45°、90°、135°、180°（設定氣管膜部平行線為0°）五個點在同一亮度的情況下（關閉自動白平衡）抓拍1 360×1 024像素200倍照片。設置APP（image pro 6.0）軟件measurement parameters包括density mean，area sum和IOD；optical density設置為hue，0～30；saturation，0～255；intensity，0～255，將圖片中選取的部分轉化為灰度值，測量得出IOD值。計算所得log10（IOD）即為測量值[12]。
1.3 統計學分析
采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析，所有試驗數據均以均數±標準差（
2 結果
2.1 氣管移植后移植體與對照組相比出現明顯氣管狹窄
成功建立了wistar大鼠-SD大鼠的原位氣管移植模型，大鼠遠期生存率可以達到90%以上。HE染色表明對照組纖維化率為0.171±0.020，氣管移植術后第3天纖維化率為0.537±0.013，兩者差異有統計學意義（P < 0.01），表明移植體氣管狹窄。其中，氣管移植后移植體纖維化率在第90天時高達0.626±0.016（圖 1）。
2.2 氣管移植后移植體與對照組相比TGF-β1高表達
移植體內TGF-β1主要表達在氣管軟骨、氣管黏膜下層以及氣管黏膜層，其表達量明顯高于對照組（圖 2）。
圖2
氣管移植后移植體內TGF-β1表達量
注：A為TGF-β1主要表達在氣管黏膜層、黏膜下層以及軟骨環（褐色部分為目的蛋白）；B為氣管移植后移植體內TGF-β1蛋白定量；與對照組比較*
2.3 氣管移植后移植體與對照組相比EMT相關表型分子呈動態變化
氣管移植后第3天移植體中出現vimentin表達陽性的上皮細胞，其表達量在術后第7天達到高峰；術后第3天上皮細胞中E-cadherin表達量明顯減少，其表達量在術后第7天減少至最低量；雖然上皮細胞內沒有表達α-SMA，但其在黏膜下層表達量明顯增加（圖 3）。
圖3
氣管移植后移植體內EMT相關表達分子表達量
注：A為E-Cadherin在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；B為Vimentin在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；C為α-SMA在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；D為氣管移植后移植體內E-Cadherin在移植后各個時間點內蛋白定量；E為氣管移植后移植體內Vimentin在移植后各個時間點內蛋白定量；F為氣管移植后移植體內α-SMA在移植后各個時間點內蛋白定量；*與對照組比較
2.4 氣管移植后移植體與對照組相比Smad信號通路分子以及轉錄因子ZEB1、Snail1高表達
信號通路蛋白p-Smad2/3主要表達在細胞核，術后第3天在移植體內明顯表達且在術后第7天達到最高峰，對照組中沒有檢測到p-Smad2/3蛋白表達。轉錄因子ZEB1、Snail1是上皮細胞間質轉化重要的轉錄因子。實驗證明，轉錄因子ZEB1主要表達在細胞核，術后第3天在移植體內明顯表達并達到最大值，但術后3天后整體呈減少趨勢，于術后第35天已無法檢測到表達。轉錄因子Snail1主要表達在細胞核及細胞漿，術后第3天在移植體內明顯表達并在移植后第3天達到高峰，雖然在移植術后3 d后Snail1表達量呈減少趨勢，但在術后第10天呈小波峰增多，術后第35天已無法檢測到表達。對照組中未檢測到ZEB1、Snail1蛋白表達（圖 4）。
圖4
氣管移植后移植體內Smad蛋白及轉錄因子ZEB1、Snail1表達量
注：A為p-Smad2/3在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；B為ZEB1在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；C為Snail1在移植體內表達（褐色部分為目的蛋白）；D為氣管移植后移植體內p-Smad2/3在移植后各個時間點內蛋白定量；E為氣管移植后移植體內ZEB1在移植后各個時間點內蛋白定量；F為氣管移植后移植體內Snail1在移植后各個時間點內蛋白定量；*與對照組比較
3 討論
本實驗證明大鼠氣管移植后第3天即出現移植體狹窄，目前的實驗數據表明術后第3、7天氣管狹窄程度高于術后第10天（P < 0.01，P=0.003），可能是因為大鼠移植后氣管上皮在第3天發生缺血-再灌注損傷致使氣管組織水腫或上皮壞死，在術后第3～7天氣管上皮發生再生形成復層上皮，表現為氣管狹窄較第10天嚴重[13-14]。
氣管移植后移植體狹窄本質上是氣管重塑，其主要特征是異常上皮修復以及促使成纖維細胞集聚和成纖維細胞分泌黏膜下細胞外基質沉積。所以成纖維細胞可能是氣管纖維化的重要原因。研究表明，EMT是組織中成纖維細胞來源的重要組成部分[15-16]。研究[17]表明在腎纖維化當中，成纖維細胞有65%來源于局部成纖維細胞聚集，而EMT是這一部分成纖維細胞的重要來源。氣管移植后移植體內存在EMT。這是基于本實驗的發現，在大鼠氣管移植后第7天，隨著vimentin表達陽性的上皮細胞增加，上皮細胞中E-cadherin表達量減少，這表明氣管移植后移植體內發生EMT，同時也表明了氣管移植后移植體內EMT呈動態變化，于術后第7天達到最高峰，術后35天基本已無法檢測到相關表達分子的變化，提示此時EMT的作用已經很弱。但是，另一EMT表型分子α-SMA并沒有在上皮細胞中表達，但其在黏膜下表達量逐漸增加，這可能是因為α-SMA也是纖維組織的表型分子，其表達量逐漸增加預示著移植后移植體中纖維化逐漸增加[18]。
Peinado等在敲除基因大鼠體內研究發現，TGF-β/Smad信號通路是EMT中最重要的信號通路[19]。TGF-β1在組織發育、炎癥、癌癥進展當中具有非常重要的作用[20]。在病理過程中，TGF-β1可以明顯誘導肺泡上皮細胞發生EMT[21]。在本實驗中，移植體內TGF-β1表達量較之對照組明顯增加，同時其表達量的變化趨勢與EMT動態變化趨勢一致，術后第35天明顯減少。與此相對應，p-Smad 2/3也是術后第3天出現，術后第7天達到高峰，證明TGF-β/Smad信號通路確實參與氣管移植后移植體狹窄。此外，轉錄因子ZEB1、Snail1的變化要早于EMT相關分子以及信號通路蛋白表達變化，都是由術后第3天達到最高表達量。Snail1的表達量具有波動性，術后第10天小高峰可能是因為氣管移植后，移植體上皮一般在術后第7～12 d會發生再次損傷[22]，推測是由于上皮損傷后支氣管上皮細胞修復過程當中導致轉錄因子Snail1增多[23]。
總之，氣管移植后移植體狹窄中存在EMT過程，同時其受到TGF-β/Smad信號通路以及轉錄因子ZEB1、Snail1的調節。我們猜測，EMT可能是移植體狹窄的使動因素，但具體機制及作用需要更多的研究。
