引用本文： 汪志海, 李忠, 楊清杰, 郭明. Ovol2基因的過表達抑制肺腺癌細胞遠處轉移及侵襲力的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(2): 173-177. doi: 10.7507/1007-4848.20160038 復制
Ovo基因編碼一組在進化上從果蠅、線蟲、斑馬魚到哺乳動物保守的蛋白家族，該蛋白家族為含有4個DNA結合的C2H2鋅指蛋白的轉錄因子。現已發現的Ovo基因家族中，老鼠的Ovol1基因在表皮分化和精子形成時發揮重要作用；Ovol2基因則在胚胎發育中發揮重要作用[1-2]。研究發現，Ovol2基因敲除小鼠會在胚胎第10 d死亡，表明其參與了更重要的發育過程。深入研究，發現Ovol2還參與胚胎早期神經管的發生[3]。在人體內含有3個Ovo基因（Ovol1、Ovol2和Ovol3)。研究發現，人體Ovol2基因與血管形成以及心臟、胎盤發育密切相關[4]。張婷等[5]的研究表明：Ovol2作為骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路下游的一個重要靶基因，可以抑制神經分化和促進中內胚層的分化。
上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞在一些因素的作用下，細胞極性、細胞間緊密連接和黏附連接逐漸喪失，獲得侵襲性和遠處遷移能力，細胞凋亡被抑制，同時細胞分泌大量細胞外基質成分，具有間質細胞形態和特性的過程[6]。這一過程典型的變化是上調間充質細胞表型的標記如波形蛋白（vimentin），下調上皮細胞表型的標記如E-鈣粘蛋白（E-cadherin）[7]。研究指出，EMT能夠誘導極化的上皮細胞向間充質細胞轉化，在胚胎發育過程中具有重要作用[8]。同時，EMT在乳腺癌、肺癌、結腸癌及肝癌等多種腫瘤的原發性浸潤和繼發性遠處轉移中也發揮重要作用。Roca等[9]指出Ovol2基因作為一種轉錄抑制因子，在腫瘤細胞的間充質-上皮轉化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）中發揮重要作用，MET是EMT的逆反過程。因此，研究其在EMT中的作用及其機制將會對尋找惡性腫瘤潛在的治療靶點提供一定的理論依據[10-11]。根據現有研究報道，我們提出這樣的假設：肺癌細胞的轉移和侵襲能力可能與Ovol2的表達水平有關，Ovol2高表達的肺癌可能通過抑制EMT使腫瘤細胞的侵襲力和轉移力下降。因此，我們通過體外培養肺腺癌細胞株A549，研究Ovol2基因對肺腺癌侵襲及遠處轉移的影響。
1 材料和方法
1.1 材料
A549細胞購買自中國科學院上海細胞庫。PLV-BSD-Control和PLV-BSD-Ovol2質粒由實驗室保存提供。轉染試劑Lipofectamine 2000 Reagent購買自invitrogen公司。DMEM培養基購買自Hyclone公司。兔抗人Ovol2抗體購自abcam公司（貨號：ab101580），兔抗人E-鈣粘蛋白抗體購自CST公司（貨號3195P）、兔抗人N-鈣黏蛋白抗體購自Santa Cruz公司（貨號sc-7939），兔抗人波形蛋白抗體購自CST公司（貨號5741S）。RT-PCR引物序列如下：E-鈣粘蛋白F：5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3'，R：5'-CTTCCGAAAAGAAGG-CTGTCC-3'；N-鈣粘蛋白F：5'-GGAAGCCCAACTATAGCGAGC-3'，R：5'-CAGTTGAAGATCTTCCGCGAC-3'；波形蛋白F：5'-CACCCTGCAGTCATTCAGACA-3'；R：5'-GATT-CCACTTTCCGT-TCAAGGT-3'；Twist1 F：5'-CGGG-TCATGGCTAACGTG-3', R:5'-CAGCTTGCCATCTT-GGAGTC-3'。
1.2 慢病毒的構建和檢測
慢病毒構建采用人胚腎細胞293T（實驗室保留）、包裝質粒PSP和PMD（實驗室保留并轉化）及TurboFect轉染試劑購自Thermo Scientific公司。10 cm皿培養293T細胞至70%～80%細胞密度，提前更換無血清DMEM培養基，按照混合質粒（目的質粒10μg、PSP 7.5μg、PHR 5μg、Opti-MEM 1 000μl，Turbo 40～50μl）和Turbo轉染試劑，靜置20 min后，逐滴加入培養皿，16 h后更換含血清及雙抗培養基約15 ml。放入37℃，5%CO2培養箱36～48 h收取病毒并過濾分裝待用。
應用Real-time PCR及Western blot檢測病毒效率。用分裝好的病毒感染細胞（6孔板，1 ml/孔）后收取細胞，分別提取RNA和蛋白。檢測結果如圖 1。
圖1
通過Real-time PCR and Western免疫蛋白印跡檢測慢病毒有效性
1.3 細胞培養與處理
胞系A549應用加有10%胎牛血清（Hyclone公司產品）及雙抗（100×）的DMEM培養基，37℃，5% CO2。分組依據如下：①對照組：感染慢病毒LV-BSD-Control，不影響Ovol2表達水平。②實驗組：感染慢病毒LV-BSD-Ovol2，Ovol2基因過表達。
1.4 實時熒光定量PCR檢測EMT相關基因mRNA表達水平變化
實驗組和對照組總RNA采用TRIzol試劑（購自Invitrogen公司）提取，再反轉成cDNA（反轉試劑盒工購自北京全式金生物公司），采用25μl體系上機。真核生物核糖體RNA 18s基因作為內參基因，結果采用分析△△CT（CT值為PCR循環數）方法。
1.5 蛋白印跡檢測EMT相關蛋白表達水平
實驗組、對照組感染病毒后48 h，提取蛋白，按照實驗室操作指南檢測Ovol2、E-鈣粘蛋白及波形蛋白的表達水平。
1.6 肺癌細胞體外侵襲及轉移能力
劃痕實驗首先將25μl基質膠（100μlMatrigel+300μl無血清培養基）加入小室（Millipore公司8.0μm聚碳酸酯膜）的上室，培養箱30 min后凝結成膠，調整實驗組及對照組細胞懸液密度至1～10×105，接種至上室，48 h后顯微鏡下觀察通過聚碳酸酯膜的細胞數。侵襲實驗則是將相同密度實驗組及對照組細胞接種至3.5 cm皿，用槍頭從細胞中間垂直劃痕（可以平行劃痕幾條），更換無血清培養基，分別在1 d、2 d、3 d及4 d后觀察拍照。
2 結果
2.1 Ovol2抑制EMT相關基因的表達
2.1.1 Real-time PCR檢測EMT相關基因mRNA表達水平變化
研究Ovol2與肺癌細胞EMT過程的關系，首先提取實驗組和對照組細胞RNA，反轉成cDNA再通過Real-time PCR檢測E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、波形蛋白以及Twist 1的mRNA表達水平。其中，E-鈣粘蛋白是位于細胞膜上面的鈣黏蛋白，是EMT過程的重要標記蛋白。在上皮細胞發生間質細胞表型轉化以及癌癥發生過程中，經常會發現E-鈣粘蛋白表達的下調[12-13]。N-鈣粘蛋白、波形蛋白和Twist 1均是與EMT相關的重要轉錄因子。結果顯示，E-鈣粘蛋白表達上調，而N-鈣粘蛋白、波形蛋白和Twist 1的表達被抑制，見圖 2。
圖2
A549細胞被對照和慢病毒過表達Ovol2轉染后E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白和Twist 1的mRNA表達變化
2.1.2 Western蛋白印跡法檢測EMT相關蛋白表達
水平變化慢病毒感染肺腺癌細胞36～48 h后收取細胞、提取蛋白樣品，應用Western Blot實驗檢測E-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達水平。結果顯示，E-鈣粘蛋白的表達水平上升，波形蛋白的表達下降，與Real-time PCR結果一致，見圖 3。
圖3
蛋白質印跡法檢測慢病毒感染肺腺癌細胞的蛋白質表達水平
2.2 Ovol2抑制肺癌細胞的遷移和侵襲
劃痕實驗結果顯示：實驗組細胞的劃痕愈合被抑制、甚至不愈合；侵襲實驗結果顯示：實驗組穿過Matrigel基質膠的細胞數明顯少于對照組。因此，我們認為，過表達Ovol2可以抑制肺癌細胞的遷移和侵襲，見圖 4。
圖4
過表達Ovol2可以抑制肺癌細胞的遷移和侵襲
Figure4.
A為劃痕實驗結果; B為侵襲實驗結果
3 討論
肺癌發病率及死亡率均已上升為惡性腫瘤的第一位，其中非小細胞肺癌占80%～90%[14]。在過去的30年，肺癌的死亡率上升了465%；《2012中國腫瘤登記年報》顯示，我國每年新發腫瘤病例約312萬例，平均每天8 550例，其中發病第一位的就是肺癌[15]。近年來，對肺癌的研究逐漸深入、臨床治療策略在不斷發展，但是肺癌的預后依然不容樂觀。報道[16]顯示其5年生存率僅有11%。Gaorav等[17]指出：腫瘤相關的死亡病例中80%與其遠處轉移有關。目前大量的研究均指出：發生EMT現象是惡性腫瘤遠處轉移的關鍵步驟[18]。因此，研究肺腺癌EMT過程的影響因素及機制，將為其多元化治療帶來一定的理論基礎。
EMT作為一種在人體內普遍的、功能多樣的可逆過程，影響及調控的因素有很多。涉及的信號通路包括轉化生長因子-β（TGF-β）、Wnt、Hedgehog、Notch和NFkB[19]。同時，EMT的調控是一種涉及到腫瘤細胞外微環境的改變、腫瘤細胞快速生長導致缺氧等因素的瞬時調控，而不是永久的遺傳學改變[20]，機制更加復雜，也許會涉及到多種轉錄因子間的相互作用。Larue等[21]就曾指出轉錄因子Snail、Twist和ZEB-2是作用于基因CDH 1，從而抑制其表達E-鈣粘蛋白來促進EMT。而Ovol2作為一種參與多種基因調控的鋅指轉錄因子，在哺乳動物的生長發育過程中發揮著重要作用。研究表明，Ovol2是一些重要的調控生長發育的信號通路如Wnt、BMP和TGF-β的下游靶基因[22-23]。這些信號通路均與EMT的激活和調控有關[24]。但是關于Ovol2基因與惡性腫瘤EMT過程的相關研究依然較少。Watanabe等研究發現Ovol 2能通過抑制Zeb 1、Zeb 2、Twist 1和Snail 1來抑制乳腺細胞的EMT過程，并且可以促進乳腺癌細胞發生MET過程來繼續保持上皮細胞表型[25]。吳躍超等的研究發現Ovol 2能夠抑制TGF-β信號通路中重要成員Smad 4的表達，從而抑制大腸癌的EMT過程[26]。
現有研究結果[27-29]表明，肺腺癌也發生著EMT，也存在著標記蛋白的表達改變。進一步研究[30-31]表明：E-鈣粘蛋白的上調以及波形蛋白的下調與其淋巴結轉移和病理分期相關；而Twist 1和Snail 1的高表達則會促進其發生EMT，并在其遠處轉移和預后中發揮重要作用。但對于其機制的研究甚少。通過研究，我們初步明確了Ovol 2基因的高表達可使肺腺癌細胞的EMT過程受到抑制，細胞的侵襲力和轉移能力下降。對于Ovol 2基因抑制EMT的作用機制，我們將在后續的實驗中進一步研究，以期能為為肺腺癌的靶向治療提供一定的理論基礎。
Ovo基因編碼一組在進化上從果蠅、線蟲、斑馬魚到哺乳動物保守的蛋白家族，該蛋白家族為含有4個DNA結合的C2H2鋅指蛋白的轉錄因子。現已發現的Ovo基因家族中，老鼠的Ovol1基因在表皮分化和精子形成時發揮重要作用；Ovol2基因則在胚胎發育中發揮重要作用[1-2]。研究發現，Ovol2基因敲除小鼠會在胚胎第10 d死亡，表明其參與了更重要的發育過程。深入研究，發現Ovol2還參與胚胎早期神經管的發生[3]。在人體內含有3個Ovo基因（Ovol1、Ovol2和Ovol3)。研究發現，人體Ovol2基因與血管形成以及心臟、胎盤發育密切相關[4]。張婷等[5]的研究表明：Ovol2作為骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號通路下游的一個重要靶基因，可以抑制神經分化和促進中內胚層的分化。
上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞在一些因素的作用下，細胞極性、細胞間緊密連接和黏附連接逐漸喪失，獲得侵襲性和遠處遷移能力，細胞凋亡被抑制，同時細胞分泌大量細胞外基質成分，具有間質細胞形態和特性的過程[6]。這一過程典型的變化是上調間充質細胞表型的標記如波形蛋白（vimentin），下調上皮細胞表型的標記如E-鈣粘蛋白（E-cadherin）[7]。研究指出，EMT能夠誘導極化的上皮細胞向間充質細胞轉化，在胚胎發育過程中具有重要作用[8]。同時，EMT在乳腺癌、肺癌、結腸癌及肝癌等多種腫瘤的原發性浸潤和繼發性遠處轉移中也發揮重要作用。Roca等[9]指出Ovol2基因作為一種轉錄抑制因子，在腫瘤細胞的間充質-上皮轉化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）中發揮重要作用，MET是EMT的逆反過程。因此，研究其在EMT中的作用及其機制將會對尋找惡性腫瘤潛在的治療靶點提供一定的理論依據[10-11]。根據現有研究報道，我們提出這樣的假設：肺癌細胞的轉移和侵襲能力可能與Ovol2的表達水平有關，Ovol2高表達的肺癌可能通過抑制EMT使腫瘤細胞的侵襲力和轉移力下降。因此，我們通過體外培養肺腺癌細胞株A549，研究Ovol2基因對肺腺癌侵襲及遠處轉移的影響。
1 材料和方法
1.1 材料
A549細胞購買自中國科學院上海細胞庫。PLV-BSD-Control和PLV-BSD-Ovol2質粒由實驗室保存提供。轉染試劑Lipofectamine 2000 Reagent購買自invitrogen公司。DMEM培養基購買自Hyclone公司。兔抗人Ovol2抗體購自abcam公司（貨號：ab101580），兔抗人E-鈣粘蛋白抗體購自CST公司（貨號3195P）、兔抗人N-鈣黏蛋白抗體購自Santa Cruz公司（貨號sc-7939），兔抗人波形蛋白抗體購自CST公司（貨號5741S）。RT-PCR引物序列如下：E-鈣粘蛋白F：5'-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3'，R：5'-CTTCCGAAAAGAAGG-CTGTCC-3'；N-鈣粘蛋白F：5'-GGAAGCCCAACTATAGCGAGC-3'，R：5'-CAGTTGAAGATCTTCCGCGAC-3'；波形蛋白F：5'-CACCCTGCAGTCATTCAGACA-3'；R：5'-GATT-CCACTTTCCGT-TCAAGGT-3'；Twist1 F：5'-CGGG-TCATGGCTAACGTG-3', R:5'-CAGCTTGCCATCTT-GGAGTC-3'。
1.2 慢病毒的構建和檢測
慢病毒構建采用人胚腎細胞293T（實驗室保留）、包裝質粒PSP和PMD（實驗室保留并轉化）及TurboFect轉染試劑購自Thermo Scientific公司。10 cm皿培養293T細胞至70%～80%細胞密度，提前更換無血清DMEM培養基，按照混合質粒（目的質粒10μg、PSP 7.5μg、PHR 5μg、Opti-MEM 1 000μl，Turbo 40～50μl）和Turbo轉染試劑，靜置20 min后，逐滴加入培養皿，16 h后更換含血清及雙抗培養基約15 ml。放入37℃，5%CO2培養箱36～48 h收取病毒并過濾分裝待用。
應用Real-time PCR及Western blot檢測病毒效率。用分裝好的病毒感染細胞（6孔板，1 ml/孔）后收取細胞，分別提取RNA和蛋白。檢測結果如圖 1。
圖1
通過Real-time PCR and Western免疫蛋白印跡檢測慢病毒有效性
1.3 細胞培養與處理
胞系A549應用加有10%胎牛血清（Hyclone公司產品）及雙抗（100×）的DMEM培養基，37℃，5% CO2。分組依據如下：①對照組：感染慢病毒LV-BSD-Control，不影響Ovol2表達水平。②實驗組：感染慢病毒LV-BSD-Ovol2，Ovol2基因過表達。
1.4 實時熒光定量PCR檢測EMT相關基因mRNA表達水平變化
實驗組和對照組總RNA采用TRIzol試劑（購自Invitrogen公司）提取，再反轉成cDNA（反轉試劑盒工購自北京全式金生物公司），采用25μl體系上機。真核生物核糖體RNA 18s基因作為內參基因，結果采用分析△△CT（CT值為PCR循環數）方法。
1.5 蛋白印跡檢測EMT相關蛋白表達水平
實驗組、對照組感染病毒后48 h，提取蛋白，按照實驗室操作指南檢測Ovol2、E-鈣粘蛋白及波形蛋白的表達水平。
1.6 肺癌細胞體外侵襲及轉移能力
劃痕實驗首先將25μl基質膠（100μlMatrigel+300μl無血清培養基）加入小室（Millipore公司8.0μm聚碳酸酯膜）的上室，培養箱30 min后凝結成膠，調整實驗組及對照組細胞懸液密度至1～10×105，接種至上室，48 h后顯微鏡下觀察通過聚碳酸酯膜的細胞數。侵襲實驗則是將相同密度實驗組及對照組細胞接種至3.5 cm皿，用槍頭從細胞中間垂直劃痕（可以平行劃痕幾條），更換無血清培養基，分別在1 d、2 d、3 d及4 d后觀察拍照。
2 結果
2.1 Ovol2抑制EMT相關基因的表達
2.1.1 Real-time PCR檢測EMT相關基因mRNA表達水平變化
研究Ovol2與肺癌細胞EMT過程的關系，首先提取實驗組和對照組細胞RNA，反轉成cDNA再通過Real-time PCR檢測E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、波形蛋白以及Twist 1的mRNA表達水平。其中，E-鈣粘蛋白是位于細胞膜上面的鈣黏蛋白，是EMT過程的重要標記蛋白。在上皮細胞發生間質細胞表型轉化以及癌癥發生過程中，經常會發現E-鈣粘蛋白表達的下調[12-13]。N-鈣粘蛋白、波形蛋白和Twist 1均是與EMT相關的重要轉錄因子。結果顯示，E-鈣粘蛋白表達上調，而N-鈣粘蛋白、波形蛋白和Twist 1的表達被抑制，見圖 2。
圖2
A549細胞被對照和慢病毒過表達Ovol2轉染后E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白和Twist 1的mRNA表達變化
2.1.2 Western蛋白印跡法檢測EMT相關蛋白表達
水平變化慢病毒感染肺腺癌細胞36～48 h后收取細胞、提取蛋白樣品，應用Western Blot實驗檢測E-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達水平。結果顯示，E-鈣粘蛋白的表達水平上升，波形蛋白的表達下降，與Real-time PCR結果一致，見圖 3。
圖3
蛋白質印跡法檢測慢病毒感染肺腺癌細胞的蛋白質表達水平
2.2 Ovol2抑制肺癌細胞的遷移和侵襲
劃痕實驗結果顯示：實驗組細胞的劃痕愈合被抑制、甚至不愈合；侵襲實驗結果顯示：實驗組穿過Matrigel基質膠的細胞數明顯少于對照組。因此，我們認為，過表達Ovol2可以抑制肺癌細胞的遷移和侵襲，見圖 4。
圖4
過表達Ovol2可以抑制肺癌細胞的遷移和侵襲
Figure4.
A為劃痕實驗結果; B為侵襲實驗結果
3 討論
肺癌發病率及死亡率均已上升為惡性腫瘤的第一位，其中非小細胞肺癌占80%～90%[14]。在過去的30年，肺癌的死亡率上升了465%；《2012中國腫瘤登記年報》顯示，我國每年新發腫瘤病例約312萬例，平均每天8 550例，其中發病第一位的就是肺癌[15]。近年來，對肺癌的研究逐漸深入、臨床治療策略在不斷發展，但是肺癌的預后依然不容樂觀。報道[16]顯示其5年生存率僅有11%。Gaorav等[17]指出：腫瘤相關的死亡病例中80%與其遠處轉移有關。目前大量的研究均指出：發生EMT現象是惡性腫瘤遠處轉移的關鍵步驟[18]。因此，研究肺腺癌EMT過程的影響因素及機制，將為其多元化治療帶來一定的理論基礎。
EMT作為一種在人體內普遍的、功能多樣的可逆過程，影響及調控的因素有很多。涉及的信號通路包括轉化生長因子-β（TGF-β）、Wnt、Hedgehog、Notch和NFkB[19]。同時，EMT的調控是一種涉及到腫瘤細胞外微環境的改變、腫瘤細胞快速生長導致缺氧等因素的瞬時調控，而不是永久的遺傳學改變[20]，機制更加復雜，也許會涉及到多種轉錄因子間的相互作用。Larue等[21]就曾指出轉錄因子Snail、Twist和ZEB-2是作用于基因CDH 1，從而抑制其表達E-鈣粘蛋白來促進EMT。而Ovol2作為一種參與多種基因調控的鋅指轉錄因子，在哺乳動物的生長發育過程中發揮著重要作用。研究表明，Ovol2是一些重要的調控生長發育的信號通路如Wnt、BMP和TGF-β的下游靶基因[22-23]。這些信號通路均與EMT的激活和調控有關[24]。但是關于Ovol2基因與惡性腫瘤EMT過程的相關研究依然較少。Watanabe等研究發現Ovol 2能通過抑制Zeb 1、Zeb 2、Twist 1和Snail 1來抑制乳腺細胞的EMT過程，并且可以促進乳腺癌細胞發生MET過程來繼續保持上皮細胞表型[25]。吳躍超等的研究發現Ovol 2能夠抑制TGF-β信號通路中重要成員Smad 4的表達，從而抑制大腸癌的EMT過程[26]。
現有研究結果[27-29]表明，肺腺癌也發生著EMT，也存在著標記蛋白的表達改變。進一步研究[30-31]表明：E-鈣粘蛋白的上調以及波形蛋白的下調與其淋巴結轉移和病理分期相關；而Twist 1和Snail 1的高表達則會促進其發生EMT，并在其遠處轉移和預后中發揮重要作用。但對于其機制的研究甚少。通過研究，我們初步明確了Ovol 2基因的高表達可使肺腺癌細胞的EMT過程受到抑制，細胞的侵襲力和轉移能力下降。對于Ovol 2基因抑制EMT的作用機制，我們將在后續的實驗中進一步研究，以期能為為肺腺癌的靶向治療提供一定的理論基礎。
