引用本文： 袁浩, 閔志均, 陳進宏, 蔣曉飛, 徐衛燕, 鳳茂華. 甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中FoxM1的表達對Ras及CDK1的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(2): 172-176. doi: 10.7507/1007-9424.20160046 復制
甲狀腺乳頭狀癌是一種常見的惡性腫瘤，且近年來發病率持續上升。研究[1-2]證明，甲狀腺乳頭狀癌的發生與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路密切相關。人叉頭框蛋白M1 （forkhead box M1，FoxM1）基因定位于12p13，是一個典型的增生相關的轉錄因子，通過對多種基因的轉錄調控，實現G1/S期、G2/M期轉換，推動有絲分裂的進行[3-5]。已有研究[6-8]證實，FoxM1與乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌等多種腫瘤的發生、發展有關。FoxM1的激活是一個多因子、多細胞信號通路共同參與的復雜過程，而其中最主要的就是Ras-MAPK信號通路。在筆者前期的研究[9]中已證實了FoxM1基因與甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展有密切聯系。在本研究中，通過RNA干擾技術抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中FoxM1基因的表達后，再用實時熒光定量PCR法檢測MAPK信號通路中Ras及CDK1基因的表達，探討FoxM1基因在甲狀腺乳頭狀癌發生、發展中的作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要材料
小質粒抽提試劑盒，Trans2K PlusⅡDNA Marker，北京全式金生物技術有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Omega公司。JM109感受態，深圳百恩維生物科技有限公司。DNA引物合成、DNA測序、DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin）、0.25% EDTA，美國Invitrogen公司。限制性內切酶XhoⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase，美國NEB公司。Qiagen大規模質粒抽提試劑盒，德國Qiagen公司。HET kit，深圳百恩維生物科技有限公司。Millex-HV 0.45 μm PVDF filters，0.22 μm針頭濾器，Millipore公司。引物合成，金斯瑞公司。甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞，中科院上海細胞所。FoxM1抗體、Ras抗體、CDK1抗體，美國Santa Cruz生物科技有限公司。
1.2 pLVX-shRNA2-puro-hFoxM1-1載體構建、干擾效率檢測及慢病毒包裝
根據hFoxM1基因序列設計shRNA，在3’端引入XhoⅠ酶切位點，從Invitrogen公司合成shRNA片段。載體pLVX-shRNA2-puro用限制性內切酶EcoRⅠ+BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠回收酶切大片段，將回收大片段與shRNA-hFoxM1的稀釋退火產物連接，然后用連接產物轉化100 μL JM109感受態細胞。用小質粒抽提試劑盒抽提質粒，并用XhoⅠ做酶切鑒定，最后挑取酶切鑒定正確的陽性菌測序。將篩選后干擾效率最佳的重組質粒pLVX-shRNA2-puro-hFoxM1-1導入293T細胞，產生高滴度含目的基因的慢病毒（以下簡稱慢病毒rLv-hFoxM1）。詳細方法參考筆者前期實驗[9]及論文。
1.3 實驗用TPC-1細胞準備
于液氮罐中取出凍存的TPC-1細胞，37 ℃水浴快速融化；然后將其接種于25 cm2培養瓶中，加入DMEM培養基（含10%胎牛血清），置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。待細胞生長成均勻單層細胞并達90%以上聚集度時傳代，將培養基吸出加入5 mL的磷酸鹽緩沖液清洗細胞，去掉磷酸鹽緩沖液，加入500 μL 0.25%胰蛋白酶室溫下短暫消化，于顯微鏡下觀察當細胞皺縮變圓時立即加入DMEM培養基，反復吹打成細胞懸液；以含10%胎牛血清的DMEM調整細胞密度后重新接種于6孔板中，密度為8×105個/孔。將rLv-hFoxM1轉染復合物逐滴加入到含有細胞和完全培養基的6孔板中（TPC-1-shRNA-hFoxM1組），輕柔混勻；另取一組未轉染的6孔板作為對照（TPC-1-control組），置于37 ℃、5% CO2培養箱培養。
1.4 實時熒光定量PCR樣品制備
培養48 h后，從培養箱分別取出2組6孔板，吸盡培養基，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入5 mL Trizol后，靜置2 min，然后反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞。將2組細胞的Trizol裂解液分別轉入EP管中，在室溫15～30 ℃下放置5 min。在EP管中加入1 mL氯仿，蓋上EP管蓋子，顛倒混勻15 min，在室溫下（15～30 ℃）放置2～3 min后，12 000×g （2～8 ℃）離心15 min。取上層水相置于新離心管中，按照1 mL Trizol加0.5 mL異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15～30 ℃）放置10 min，12 000×g （2～8 ℃）離心10 min。棄上清，按照1 mL Trizol加1 mL 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7 500×g （2～8 ℃）離心5 min，棄上清。讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用Rnase-free water溶解RNA沉淀。紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測所得RNA的純度和完整性，-80 ℃超低溫冰箱保存備用。
1.5 cDNA模板的合成
將oligo （dT） 12-18 （500 μg/mL）、總RNA、dNTP混合物、滅菌蒸餾水加入無核酸酶的微量離心管中，混合物在65 ℃加熱5 min，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后，加入以下組分：5×第一鏈合成緩沖液、0.1 mol/L DTT。再輕輕將各種成分混合，并在37 ℃下孵育2 min。在室溫下加入1 μL （200 U）M-MLV逆轉錄酶，輕輕地吹打混勻。如果使用隨機引物，需要將離心管在25 ℃孵育10 min。在37 ℃孵育50 min。在70 ℃加熱15 min以終止反應。cDNA產物直接作為實時熒光定量PCR法的模板。
1.6 實時熒光定量PCR法檢測FoxM1、Ras和CDK1基因的表達
1.6.1 引物設計
分別設計內參β-actin和目的基因擴增引物，引物序列如下：①人β-actin上游引物為5＇-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3＇，下游引物為5＇-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3＇，擴增片段長度為284 bp。②人Ras上游引物為5＇-GGACGAATAC-GACCCCACTA-3＇，下游引物為5＇-ATGGCAAACAC-ACACAGGAA-3＇，擴增片段長度為165 bp。③人FoxM1上游引物為5＇-ATACGTGGATTGAGGACCACT-3＇，下游引物為5＇-TCCAATGTCAAGTAGCGGTTG-3＇，擴增片段長度為175 bp。④人CDK1上游引物為5＇-CTGGGGTCAGCTCGTTACTC-3＇，下游引物為5＇-AGGCTTCCTGGTTTCCATTT-3＇，擴增片段長度為221 bp。
1.6.2 實時熒光定量PCR法反應體系及反應條件
①反應體系：cDNA、引物、SYBR Green/Fluorescent、qPCR Master Mix （2X）。②反應條件：95 ℃ 10 min，以95 ℃ 30 s和60 ℃ 30 s擴增40個循環。
1.6.3 Ct值計算
記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的閾值時所經歷的循環數即Ct值，以β-actin作為對照，采用實時熒光定量PCR法中的相對定量法，以2△△t表示經處理的TPC-1細胞中目的基因的表達相對于未經處理TPC-1細胞的變化倍數，其中△t=Ct目的基因-Ctβ-actin，△△t即以TPC-1-control為標準，△△t樣品=△t樣品-△tTPC-1-control。以2△△t的平均值作為最終結果。
1.7 統計學方法
采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行分析。采用配對t檢驗比較2組細胞中各基因水平的表達差異。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實時熒光定量PCR法檢測FoxM1 mRNA在TPC-1細胞中的表達結果
實時熒光定量PCR法檢測FoxM1 mRNA表達的定性和半定量結果見圖 1。
圖1
2組細胞中FoxM1 mRNA表達的定性結果及半定量結果。1A：定性結果。1：TPC-1-shRNA-hFoxM1組；2：TPC-1-control組；3：DL2000。1B：半定量結果。1：TPC-1-control組；2：TPC-1-shRNA-hFoxM1組。與TPC-1-control組比較，* P<0.01
2.1.1 β-actin mRNA表達結果
β-actin mRNA在TPC-1-control組為18.611 9，在TPC-1-shRNA-hFoxM1組為18.628 3，2組間比較差異無統計學意義（t=0.515 0，P>0.05），結果提示β-actin基因作為內參是可靠的。
2.1.2 Foxm1 mRNA表達結果
FoxM1基因表達在TPC-1-shRNA-hFoxm1組為0.452 9，明顯低于其在TPC-1-control組的1.005 0，2組比較差異有統計學意義（t=24.692 9，P<0.01），結果提示，經hFoxM1-RNA干擾處理后，TPC-1細胞中FoxM1 mRNA表達明顯降低。
2.2 實時熒光定量PCR法檢測Ras mRNA表達結果
Ras mRNA表達的定性和半定量結果見圖 2。Ras mRNA表達在TPC-1-shRNA-hFoxM1組為1.319 0，明顯高于其在TPC-1-control組的1.001 2，2組間比較差異有統計學意義（t=14.218 5，P<0.01）。結果提示，經hFoxM1-RNA干擾處理后，隨著FoxM1 mRNA表達的降低，TPC-1細胞中Ras mRNA的表達增強。
圖2
2組細胞中Ras mRNA表達的定性結果及半定量結果。2A：定性結果。1：TPC-1-shRNA-hFoxM1組；2：TPC-1-control組；3：DL2000。 2B：半定量結果。 1：TPC-1-control組；2：TPC-1-shRNA-hFoxM1組。與TPC-1-control組比較，* P<0.01
2.3 實時熒光定量PCR法檢測CDK1基因表達結果
CDK1基因表達的定性和半定量結果見圖 3。CDK1基因表達在TPC-1-shRNA-hFoxm1組為0.767 5，明顯低于其在TPC-1-control組的1.008 1，2組間比較差異有統計學意義（t=10.763 4，P<0.01），結果提示，經hFoxM1-RNA干擾處理后，隨著FoxM1的表達降低，TPC-1細胞中CDK1 mRNA的表達也降低。
圖3
2組細胞中CDK1 mRNA表達的定性結果及半定量結果。3A：定性結果。1：DL2000；2：TPC-1-control組；3：TPC-1-shRNA-hFoxM1組。3B：半定量結果。1：TPC-1-control組；2：TPC-1-shRNA-hFoxM1組。與TPC-1-control組比較，* P<0.01
3 討論
近年來，甲狀腺乳頭狀癌相關基因研究很多，其中BRAFT1799A和Ret基因是比較得到公認的甲狀腺乳頭狀癌相關基因[10-13]，二者均是通過MAPK通路的持續活化造成細胞異常增殖和腫瘤生成。也有研究[14-15]直接證實，甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展與MAPK信號通路密切相關。而Ras是MAPK信號通路中的重要基因，在腫瘤細胞中，其可以通過形成二聚體的方式來激活MAPK信號通路[16]。在肝細胞癌HepG2?細胞系中，Ras表達水平的變化可以影響MAPK信號通路，從而誘發G2/M期細胞周期阻滯和細胞凋亡[17]。CDK1也與MAPK信號通路密切相關，MAPK信號通路調節細胞有絲分裂的過程中，CDK1的活性穩定是不可或缺的因素[18]。因此，在MAPK信號通路中，Ras和CDK1均是不可或缺的重要基因。
人的FoxM1基因通過對多種基因的轉錄調控推動有絲分裂的進行。FoxM1的激活是一個多因子、多細胞信號通路共同參與的復雜過程，而其中最主要的就是Ras-MAPK信號通路，激活的Ras可以引發MAPK的磷酸化級聯反應，經Ras活化后的Raf-1可使MAPK激活，進而使細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK） 1、2磷酸活化，活化的ERK轉位進入細胞核，調節其下游FoxM1等轉錄因子及基因的活性[19]。FoxM1轉錄因子是ERK主要的效應因子，在許多腫瘤中均有高表達。有研究[20]證實，FoxM1的核轉位需要Ras-MAPK信號通路的參與，在細胞有絲分裂的過程中，FoxM1與CDK1可相互影響。在正常的細胞周期中，FoxM1在G1/S期時通過C-末端自抑制結構域保持低活性，在G2期時需要通過磷酸化保持高活性以促進細胞周期的進行，而在這過程必須有CDK1的參與[21]。在DNA損傷導致細胞周期停滯于G2期時，FoxM1的轉錄活性增強以恢復細胞周期，但是這一過程離不開CDK1的支持，只有CDK1的表達水平和活性達到一定程度時，FoxM1的作用才能得以發揮[22]。
甲狀腺乳頭狀癌的發生與MAPK通路密切相關，而FoxM1的激活又與MAPK信號通路密切相關，由此推測，FoxM1應與甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展有密切關系，而且可能也是通過MAPK通路發揮作用。在筆者的前期研究[9]中發現，在甲狀腺乳頭狀癌細胞中FoxM1表達水平與腫瘤細胞活性、轉移、侵襲能力的關系中發現，使用RNA干擾抑制FoxM1基因的表達后，TPC-1細胞的活性、轉移及侵襲能力均明顯下降，與國外文獻[23]報道一致。有學者在甲狀腺未分化癌中，也獲得了類似的結果[24]。在本研究中我們證實了FoxM1與MAPK信號通路中的重要基因Ras及CDK1均有密切關系，抑制FoxM1基因表達后，上游基因Ras的表達升高，下游基因CDK1的表達降低。在Kopanja等[25]的體外實驗中也證實了在肝細胞癌模型中敲除FoxM1基因后，雖然Ras基因過度表達，但肝癌的進展仍然受到限制。下游基因CDK1的表達受FoxM1調控，FoxM1表達水平降低后CDK1的表達相應降低。在細胞實驗[22]中，如DNA損傷導致細胞有絲分裂停滯在G2期時，FoxM1可通過CDK1的激活，使有絲分裂恢復正常。
Ras與CDK1均是MAPK信號通路中的重要基因，而二者的表達水平均與FoxM1有關，因此，FoxM1在甲狀腺乳頭狀癌中可能是通過MAPK信號通路發揮作用，具體作用機制需進一步研究。
甲狀腺乳頭狀癌是一種常見的惡性腫瘤，且近年來發病率持續上升。研究[1-2]證明，甲狀腺乳頭狀癌的發生與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路密切相關。人叉頭框蛋白M1 （forkhead box M1，FoxM1）基因定位于12p13，是一個典型的增生相關的轉錄因子，通過對多種基因的轉錄調控，實現G1/S期、G2/M期轉換，推動有絲分裂的進行[3-5]。已有研究[6-8]證實，FoxM1與乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌等多種腫瘤的發生、發展有關。FoxM1的激活是一個多因子、多細胞信號通路共同參與的復雜過程，而其中最主要的就是Ras-MAPK信號通路。在筆者前期的研究[9]中已證實了FoxM1基因與甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展有密切聯系。在本研究中，通過RNA干擾技術抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中FoxM1基因的表達后，再用實時熒光定量PCR法檢測MAPK信號通路中Ras及CDK1基因的表達，探討FoxM1基因在甲狀腺乳頭狀癌發生、發展中的作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要材料
小質粒抽提試劑盒，Trans2K PlusⅡDNA Marker，北京全式金生物技術有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Omega公司。JM109感受態，深圳百恩維生物科技有限公司。DNA引物合成、DNA測序、DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin）、0.25% EDTA，美國Invitrogen公司。限制性內切酶XhoⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase，美國NEB公司。Qiagen大規模質粒抽提試劑盒，德國Qiagen公司。HET kit，深圳百恩維生物科技有限公司。Millex-HV 0.45 μm PVDF filters，0.22 μm針頭濾器，Millipore公司。引物合成，金斯瑞公司。甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞，中科院上海細胞所。FoxM1抗體、Ras抗體、CDK1抗體，美國Santa Cruz生物科技有限公司。
1.2 pLVX-shRNA2-puro-hFoxM1-1載體構建、干擾效率檢測及慢病毒包裝
根據hFoxM1基因序列設計shRNA，在3’端引入XhoⅠ酶切位點，從Invitrogen公司合成shRNA片段。載體pLVX-shRNA2-puro用限制性內切酶EcoRⅠ+BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠回收酶切大片段，將回收大片段與shRNA-hFoxM1的稀釋退火產物連接，然后用連接產物轉化100 μL JM109感受態細胞。用小質粒抽提試劑盒抽提質粒，并用XhoⅠ做酶切鑒定，最后挑取酶切鑒定正確的陽性菌測序。將篩選后干擾效率最佳的重組質粒pLVX-shRNA2-puro-hFoxM1-1導入293T細胞，產生高滴度含目的基因的慢病毒（以下簡稱慢病毒rLv-hFoxM1）。詳細方法參考筆者前期實驗[9]及論文。
1.3 實驗用TPC-1細胞準備
于液氮罐中取出凍存的TPC-1細胞，37 ℃水浴快速融化；然后將其接種于25 cm2培養瓶中，加入DMEM培養基（含10%胎牛血清），置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。待細胞生長成均勻單層細胞并達90%以上聚集度時傳代，將培養基吸出加入5 mL的磷酸鹽緩沖液清洗細胞，去掉磷酸鹽緩沖液，加入500 μL 0.25%胰蛋白酶室溫下短暫消化，于顯微鏡下觀察當細胞皺縮變圓時立即加入DMEM培養基，反復吹打成細胞懸液；以含10%胎牛血清的DMEM調整細胞密度后重新接種于6孔板中，密度為8×105個/孔。將rLv-hFoxM1轉染復合物逐滴加入到含有細胞和完全培養基的6孔板中（TPC-1-shRNA-hFoxM1組），輕柔混勻；另取一組未轉染的6孔板作為對照（TPC-1-control組），置于37 ℃、5% CO2培養箱培養。
1.4 實時熒光定量PCR樣品制備
培養48 h后，從培養箱分別取出2組6孔板，吸盡培養基，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入5 mL Trizol后，靜置2 min，然后反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞。將2組細胞的Trizol裂解液分別轉入EP管中，在室溫15～30 ℃下放置5 min。在EP管中加入1 mL氯仿，蓋上EP管蓋子，顛倒混勻15 min，在室溫下（15～30 ℃）放置2～3 min后，12 000×g （2～8 ℃）離心15 min。取上層水相置于新離心管中，按照1 mL Trizol加0.5 mL異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15～30 ℃）放置10 min，12 000×g （2～8 ℃）離心10 min。棄上清，按照1 mL Trizol加1 mL 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7 500×g （2～8 ℃）離心5 min，棄上清。讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用Rnase-free water溶解RNA沉淀。紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測所得RNA的純度和完整性，-80 ℃超低溫冰箱保存備用。
1.5 cDNA模板的合成
將oligo （dT） 12-18 （500 μg/mL）、總RNA、dNTP混合物、滅菌蒸餾水加入無核酸酶的微量離心管中，混合物在65 ℃加熱5 min，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后，加入以下組分：5×第一鏈合成緩沖液、0.1 mol/L DTT。再輕輕將各種成分混合，并在37 ℃下孵育2 min。在室溫下加入1 μL （200 U）M-MLV逆轉錄酶，輕輕地吹打混勻。如果使用隨機引物，需要將離心管在25 ℃孵育10 min。在37 ℃孵育50 min。在70 ℃加熱15 min以終止反應。cDNA產物直接作為實時熒光定量PCR法的模板。
1.6 實時熒光定量PCR法檢測FoxM1、Ras和CDK1基因的表達
1.6.1 引物設計
分別設計內參β-actin和目的基因擴增引物，引物序列如下：①人β-actin上游引物為5＇-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3＇，下游引物為5＇-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3＇，擴增片段長度為284 bp。②人Ras上游引物為5＇-GGACGAATAC-GACCCCACTA-3＇，下游引物為5＇-ATGGCAAACAC-ACACAGGAA-3＇，擴增片段長度為165 bp。③人FoxM1上游引物為5＇-ATACGTGGATTGAGGACCACT-3＇，下游引物為5＇-TCCAATGTCAAGTAGCGGTTG-3＇，擴增片段長度為175 bp。④人CDK1上游引物為5＇-CTGGGGTCAGCTCGTTACTC-3＇，下游引物為5＇-AGGCTTCCTGGTTTCCATTT-3＇，擴增片段長度為221 bp。
1.6.2 實時熒光定量PCR法反應體系及反應條件
①反應體系：cDNA、引物、SYBR Green/Fluorescent、qPCR Master Mix （2X）。②反應條件：95 ℃ 10 min，以95 ℃ 30 s和60 ℃ 30 s擴增40個循環。
1.6.3 Ct值計算
記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的閾值時所經歷的循環數即Ct值，以β-actin作為對照，采用實時熒光定量PCR法中的相對定量法，以2△△t表示經處理的TPC-1細胞中目的基因的表達相對于未經處理TPC-1細胞的變化倍數，其中△t=Ct目的基因-Ctβ-actin，△△t即以TPC-1-control為標準，△△t樣品=△t樣品-△tTPC-1-control。以2△△t的平均值作為最終結果。
1.7 統計學方法
采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行分析。采用配對t檢驗比較2組細胞中各基因水平的表達差異。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實時熒光定量PCR法檢測FoxM1 mRNA在TPC-1細胞中的表達結果
實時熒光定量PCR法檢測FoxM1 mRNA表達的定性和半定量結果見圖 1。
圖1
2組細胞中FoxM1 mRNA表達的定性結果及半定量結果。1A：定性結果。1：TPC-1-shRNA-hFoxM1組；2：TPC-1-control組；3：DL2000。1B：半定量結果。1：TPC-1-control組；2：TPC-1-shRNA-hFoxM1組。與TPC-1-control組比較，* P<0.01
2.1.1 β-actin mRNA表達結果
β-actin mRNA在TPC-1-control組為18.611 9，在TPC-1-shRNA-hFoxM1組為18.628 3，2組間比較差異無統計學意義（t=0.515 0，P>0.05），結果提示β-actin基因作為內參是可靠的。
2.1.2 Foxm1 mRNA表達結果
FoxM1基因表達在TPC-1-shRNA-hFoxm1組為0.452 9，明顯低于其在TPC-1-control組的1.005 0，2組比較差異有統計學意義（t=24.692 9，P<0.01），結果提示，經hFoxM1-RNA干擾處理后，TPC-1細胞中FoxM1 mRNA表達明顯降低。
2.2 實時熒光定量PCR法檢測Ras mRNA表達結果
Ras mRNA表達的定性和半定量結果見圖 2。Ras mRNA表達在TPC-1-shRNA-hFoxM1組為1.319 0，明顯高于其在TPC-1-control組的1.001 2，2組間比較差異有統計學意義（t=14.218 5，P<0.01）。結果提示，經hFoxM1-RNA干擾處理后，隨著FoxM1 mRNA表達的降低，TPC-1細胞中Ras mRNA的表達增強。
圖2
2組細胞中Ras mRNA表達的定性結果及半定量結果。2A：定性結果。1：TPC-1-shRNA-hFoxM1組；2：TPC-1-control組；3：DL2000。 2B：半定量結果。 1：TPC-1-control組；2：TPC-1-shRNA-hFoxM1組。與TPC-1-control組比較，* P<0.01
2.3 實時熒光定量PCR法檢測CDK1基因表達結果
CDK1基因表達的定性和半定量結果見圖 3。CDK1基因表達在TPC-1-shRNA-hFoxm1組為0.767 5，明顯低于其在TPC-1-control組的1.008 1，2組間比較差異有統計學意義（t=10.763 4，P<0.01），結果提示，經hFoxM1-RNA干擾處理后，隨著FoxM1的表達降低，TPC-1細胞中CDK1 mRNA的表達也降低。
圖3
2組細胞中CDK1 mRNA表達的定性結果及半定量結果。3A：定性結果。1：DL2000；2：TPC-1-control組；3：TPC-1-shRNA-hFoxM1組。3B：半定量結果。1：TPC-1-control組；2：TPC-1-shRNA-hFoxM1組。與TPC-1-control組比較，* P<0.01
3 討論
近年來，甲狀腺乳頭狀癌相關基因研究很多，其中BRAFT1799A和Ret基因是比較得到公認的甲狀腺乳頭狀癌相關基因[10-13]，二者均是通過MAPK通路的持續活化造成細胞異常增殖和腫瘤生成。也有研究[14-15]直接證實，甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展與MAPK信號通路密切相關。而Ras是MAPK信號通路中的重要基因，在腫瘤細胞中，其可以通過形成二聚體的方式來激活MAPK信號通路[16]。在肝細胞癌HepG2?細胞系中，Ras表達水平的變化可以影響MAPK信號通路，從而誘發G2/M期細胞周期阻滯和細胞凋亡[17]。CDK1也與MAPK信號通路密切相關，MAPK信號通路調節細胞有絲分裂的過程中，CDK1的活性穩定是不可或缺的因素[18]。因此，在MAPK信號通路中，Ras和CDK1均是不可或缺的重要基因。
人的FoxM1基因通過對多種基因的轉錄調控推動有絲分裂的進行。FoxM1的激活是一個多因子、多細胞信號通路共同參與的復雜過程，而其中最主要的就是Ras-MAPK信號通路，激活的Ras可以引發MAPK的磷酸化級聯反應，經Ras活化后的Raf-1可使MAPK激活，進而使細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK） 1、2磷酸活化，活化的ERK轉位進入細胞核，調節其下游FoxM1等轉錄因子及基因的活性[19]。FoxM1轉錄因子是ERK主要的效應因子，在許多腫瘤中均有高表達。有研究[20]證實，FoxM1的核轉位需要Ras-MAPK信號通路的參與，在細胞有絲分裂的過程中，FoxM1與CDK1可相互影響。在正常的細胞周期中，FoxM1在G1/S期時通過C-末端自抑制結構域保持低活性，在G2期時需要通過磷酸化保持高活性以促進細胞周期的進行，而在這過程必須有CDK1的參與[21]。在DNA損傷導致細胞周期停滯于G2期時，FoxM1的轉錄活性增強以恢復細胞周期，但是這一過程離不開CDK1的支持，只有CDK1的表達水平和活性達到一定程度時，FoxM1的作用才能得以發揮[22]。
甲狀腺乳頭狀癌的發生與MAPK通路密切相關，而FoxM1的激活又與MAPK信號通路密切相關，由此推測，FoxM1應與甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展有密切關系，而且可能也是通過MAPK通路發揮作用。在筆者的前期研究[9]中發現，在甲狀腺乳頭狀癌細胞中FoxM1表達水平與腫瘤細胞活性、轉移、侵襲能力的關系中發現，使用RNA干擾抑制FoxM1基因的表達后，TPC-1細胞的活性、轉移及侵襲能力均明顯下降，與國外文獻[23]報道一致。有學者在甲狀腺未分化癌中，也獲得了類似的結果[24]。在本研究中我們證實了FoxM1與MAPK信號通路中的重要基因Ras及CDK1均有密切關系，抑制FoxM1基因表達后，上游基因Ras的表達升高，下游基因CDK1的表達降低。在Kopanja等[25]的體外實驗中也證實了在肝細胞癌模型中敲除FoxM1基因后，雖然Ras基因過度表達，但肝癌的進展仍然受到限制。下游基因CDK1的表達受FoxM1調控，FoxM1表達水平降低后CDK1的表達相應降低。在細胞實驗[22]中，如DNA損傷導致細胞有絲分裂停滯在G2期時，FoxM1可通過CDK1的激活，使有絲分裂恢復正常。
Ras與CDK1均是MAPK信號通路中的重要基因，而二者的表達水平均與FoxM1有關，因此，FoxM1在甲狀腺乳頭狀癌中可能是通過MAPK信號通路發揮作用，具體作用機制需進一步研究。
