引用本文： 錢崇崴, 齊浩龍, 馮夢龍, 劉志蘇. 小干擾RNA沉默生長激素受體對肝癌細胞增殖及侵襲能力的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(2): 177-181. doi: 10.7507/1007-9424.20160047 復制
生長激素受體（GHR）與許多腫瘤細胞的增殖、凋亡、血管形成、轉移密切相關，但其在肝癌細胞中是否表達一直存在爭議。近年來有研究[1]表明，肝癌細胞中有一定的GHR表達。運用小干擾RNA （siRNA）技術下調基因的表達，在腫瘤的基礎研究中已廣泛開展[2]。因此，我們運用siRNA技術，沉默人肝癌細胞SMMC-7721的GHR基因后，觀察肝癌細胞的增殖及侵襲能力的變化，希望能在肝癌的基因治療方面提供一個新的方向。
1 材料與方法
1.1 主要材料
人肝癌細胞株SMMC-7721購于中國典型培養物保藏中心（武漢大學），胎牛血清、RPMI 1640培養液、胰蛋白酶-EDTA購于美國Gibco公司，兔抗人GAPDH多克隆抗體、兔抗人GHR單克隆抗體、羊抗兔IgG二抗均購于美國Abgent公司，GenMuteTM體外siRNA轉染試劑、CCK-8試劑盒、8 μm Transwell小室購自武漢博士德生物工程公司，Matrigel膠購自BD公司，逆轉錄試劑盒購于TaKaRa公司，SYBR Premix EX Taq（Perfect real time染料法實時熒光定量試劑盒） 購于Invitrogen公司。
1.2 細胞培養
SMMC-7721細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，37 ℃、5%體積分數的CO2條件下培養、胰蛋白酶-EDTA消化和傳代，取對數生長期細胞備用。
1.3 合成siRNA
根據相關文獻[3]，參考siRNA的設計方法，選擇特異性的針對GHR的siRNA序列：正義鏈為5＇-TG-CTGATGAATCCCAGTTAAACTGACGTTTTGGCC-ACTGACTGACGTCAGTTTCTGGGATTCAT-3＇，陰性對照的siRNA序列：正義鏈為5＇-TGCTGAAATG-TACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTG-ACGTCTCCACGCAGTACATTT-3＇，以上RNA序列由武漢擎科創新生物科技有限公司合成。
1.4 細胞分組及siRNA轉染
取對數生長期的SMMC-7721細胞，將其分為空白對照組（未轉染siRNA）、陰性對照組（轉染非特異性的siRNA）和特異轉染組（轉染特異性干擾GHR表達的siRNA） 3組。將細胞用胰蛋白酶-EDTA消化后轉至9.6 cm2面積的6孔板中，待細胞生長成密度約為70%左右的單層細胞后，依據GenMuteTM體外siRNA轉染試劑盒提供的說明書，按步驟進行轉染。轉染24 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，取胞質內熒光信號透亮的細胞進行下一步實驗。
1.5 real-time PCR法檢測SMMC-7721細胞中GHR mRNA的表達
SMMC-7721細胞總RNA提取采用Trizol法，按其步驟，提取總RNA。按從TaKaRa公司購入的Prime Script RT reagent Kit試劑盒進行逆轉錄，得到相應的cDNA。real-time PCR反應選用SYBR Premix EX Taq （Perfect real time染料法實時熒光定量試劑盒）。根據GeneBank中的SMMC-7721的完整RNA信息，應用Prime 5.0軟件，由武漢擎科創新生物科技有限公司設計并合成人GHR cDNA引物：上游引物為5＇-CTATATTGACAACATCAGTTCC-3＇，下游引物為5＇-CCTTCCTTGAGGAGATCTGG-3＇，擴增片段長度為330 bp；β-肌動蛋白（β-actin）cDNA引物：上游引物為5＇-GGGTCAGAAGGATTCCTA TG-3＇，下游引物為5＇-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3＇，擴增片段長度為237 bp [4]。反應條件為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin，再根據每組△Ct值分別求出均數。
1.6 免疫印跡（Western blot）法檢測SMMC-7721細胞中GHR蛋白的表達
離心收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，吸干洗滌液。按1×106個細胞加入100 μl蛋白裂解液裂解細胞，后置于冰上30 min，10 000 r/min（r=10 cm）離心10 min，取上清。用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。上樣后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳。轉膜后用5%脫脂牛奶封閉，再根據一抗的不同稀釋濃度孵育一抗，4 ℃搖床過夜。洗膜后孵育二抗，再進行顯色及曝光。應用Fluor-S Multimager Scanner掃描儀和Quantity One軟件掃描膠片，得到蛋白條帶的灰度值進行半定量比較分析。
1.7 采用CCK-8法檢測GHR對SMMC-7721細胞增殖能力的影響
在96孔板中分別鋪上3組細胞，每孔大約3×103個細胞，移除培養基后加入預先按體積比1:10（CCK-8:培養基）配置好混合液，37 ℃避光培養，分別于1 h、2 h、3 h、24 h測定細胞增殖能力，檢測波長450 nm處的吸光度值，參比波長630 nm。實驗重復3次，取其均值。
1.8 Transwell法檢測GHR對SMMC-7721細胞侵襲能力的影響
提前將Matrigel置于4 ℃冰箱中過夜，用無血清培養基稀釋后（無血清1640培養基:Matrigel為1:4），加入預冷的Transwell小室，每小室40 μL，置于37 ℃培養箱中孵育4 h。上室中加入300 μL約含2×105個細胞的無血清1640培養基，下室中加入含10%胎牛血清的完全培養基。37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h取出。用棉簽擦凈上室未穿透的細胞，在顯微鏡下隨機選取5個區域進行細胞計數，取其平均值。
1.9 統計學方法
應用SPSS 13.0統計軟件分析，實驗結果均以均數±標準差（
2 結果
2.1 real-time PCR法檢測各組SMMC-7721細胞中GHR mRNA的表達結果
與空白對照組及陰性對照組相比，轉染了siRNA干擾GHR后，SMMC-7721細胞中GHR mRNA的相對表達量明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）；而空白對照組及陰性對照組細胞中GHR mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。結果提示，特異性的siRNA干擾了GHR mRNA在SMMC-7721細胞中的表達。
圖1
RT-PCR法檢測各組細胞中GHR mRNA的表達結果。與空白對照組及陰性對照組比較，* P<0.05
2.2 Western blot法檢測各組SMMC-7721細胞中GHR蛋白的表達結果
空白對照組灰度值為0.99±1.98，陰性對照組灰度值為0.97±0.23，空白對照組及陰性對照組細胞中GHR蛋白表達灰度值比較差異無統計學意義（P>0.05）；而轉染了siRNA干擾GHR后，SMMC-7721細胞中GHR蛋白表達灰度值（0.32±0.15）較空白對照組及陰性對照組明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。結果提示，經過將siRNA轉染至SMMC-7721肝癌細胞后，GHR在蛋白質的表達水平明顯降低。
圖2
Western blot檢測siRNA干擾GHR后SMMC-7721細胞GHR蛋白的表達。1：空白對照組；2：陰性對照組；3：特異轉染組
2.3 CCK-8法檢測GHR對SMMC-7721細胞增殖能力的影響
結果見圖 3。從圖 3可見，在siRNA干擾GHR的表達后，SMMC-7721細胞的增殖能力與空白對照組和陰性對照組相應時相比較均明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），而空白對照組和陰性對照組的增殖能力比較差異無統計學意義（P<0.05）。結果提示，siRNA干擾GHR后SMMC-7721細胞的增殖能力明顯下降。
圖3
CCK-8法檢測GHR對SMMC-7721細胞增殖能力的影響。與空白對照組及陰性對照組比較，* P<0.05
2.4 Transwell法檢測細胞侵襲的能力
根據SMMC-7721細胞從上室穿過膜上的Matrigel到下室的數量，可以反映細胞的侵襲能力。空白對照組穿過膜的細胞數為（327±10）個，陰性對照組為（320±8）個，2組間比較差異無統計學意義（P=0.63）。特異轉染組的穿膜細胞數為（137±7）個，明顯少于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。結果提示，siRNA干擾GHR后SMMC-7721細胞的侵襲能力明顯減弱（圖 5），這與細胞增殖的實驗結果一致。
圖4
Transwell法檢測GHR對SMMC-7721細胞的侵襲能力的影響。與空白對照組及陰性對照組比較，* P<0.05
圖5
Transwell法檢測SMMC-7721細胞在體外的侵襲能力（Giemsa染色 ×200）。5A：空白對照組；5B：陰性對照組；5C：特異轉染組
3 討論
肝癌是我國常見的惡性腫瘤，其發病較為隱匿，多數患者就診時已是晚期，僅10%～30%的肝癌患者能接受根治性切除手術[5]。因此，從肝癌的基因靶向治療角度尋找到新的治療靶點、抑制肝癌細胞的增殖及遷移具有重要的意義。
關于肝癌組織是否含有GHR一直存在爭議。正是由于此原因，臨床工作者在原發性肝癌患者圍手術期是否使用重組人生長激素以增強機體的免疫功能一直比較慎重，對其是否會促進肝癌細胞的生長及侵襲沒有明確的結論[6-8]。GHR在乳腺癌、結腸癌等腫瘤細胞中具有較正常組織更高的表達量[9]，但不同的腫瘤細胞中GHR的表達存在較大差異。肝癌細胞中是否有GHR基因的表達，一直存在爭議。從1990年開始，Chang等[10]采用放射配體法檢測了正常肝組織、肝硬化組織及肝癌組織中GHR的表達，結果均未能發現GHR的表達。但近年來的研究[11]已經證實人肝癌細胞中已經檢測到GHR mRNA表達，且證實癌組織中GHR mRNA的水平較癌旁組織明顯降低。國內向春華等[12]的研究也表明，肝癌組織內有低表達的GHR，但較癌旁組織表達量低。Amit等[13]發現，并非所有肝癌細胞株表達的GHR都處于低結合活性，如在HepG2細胞中，GHR表現出高結合活性。盡管不同肝癌細胞株所表達的GHR結合活性不相同，但基本可以確定的是大多數肝癌細胞都有GHR的表達，這對于肝癌的基因靶向治療有著重要的意義。就本研究的結果來看，在肝癌SMMC-7721細胞被siRNA干擾GHR的表達后，GHR從mRNA水平及蛋白水平都有明顯下降，從側面也可以證明在肝癌細胞中GHR是有一定量的表達的。
siRNA已成為研究基因功能的重要工具，其主要是通過合成19～23個核苷酸對的siRNA，與Dicer酶和一些蛋白質構成RNA誘導復合物，根據堿基互補配對規律，特異性地降解與其同源的mRNA[14]。近年來，RNA干擾技術已廣泛運用在腫瘤的基因功能及基因治療的研究中。我們利用siRNA，成功地構建了干擾GHR表達的SMMC-7721細胞，通過CCK-8試驗及Transwell細胞遷移試驗證實了沉默GHR之后，肝癌細胞SMMC-7721的增殖及遷移侵襲的能力明顯受到抑制，這可能與細胞內JAK-STAT等信號通路有關[15]，此通路能激活c-fos [16]、c-jun [17-19]等基因發動細胞內的合成代謝并促進細胞增殖、誘導細胞分化成熟。GHR與生長激素結合后，形成同型二聚體，與之偶聯的JAK2被激活，通過轉磷酸作用，觸發多級信號級聯放大，通過Elk-1、STATs、PI3K等轉錄因子，誘導胰島素樣生長因子表達，進而促進細胞增殖[20-22]。此外，外源性生長激素與腫瘤細胞的GHR結合，通過腫瘤細胞內的生長激素-胰島素樣生長因子-Ⅰ軸發揮作用，產生胰島素樣生長因子-Ⅰ，此通路可直接刺激腫瘤細胞增殖[23-25]，而在生長激素作用的重要靶點GHR被siRNA干擾表達后，生長激素無法發揮其作用，直接導致本實驗的結果，即肝癌細胞的增殖及侵襲能力均明顯下降，但其具體的作用機制仍需進行進一步的研究。
生長激素受體（GHR）與許多腫瘤細胞的增殖、凋亡、血管形成、轉移密切相關，但其在肝癌細胞中是否表達一直存在爭議。近年來有研究[1]表明，肝癌細胞中有一定的GHR表達。運用小干擾RNA （siRNA）技術下調基因的表達，在腫瘤的基礎研究中已廣泛開展[2]。因此，我們運用siRNA技術，沉默人肝癌細胞SMMC-7721的GHR基因后，觀察肝癌細胞的增殖及侵襲能力的變化，希望能在肝癌的基因治療方面提供一個新的方向。
1 材料與方法
1.1 主要材料
人肝癌細胞株SMMC-7721購于中國典型培養物保藏中心（武漢大學），胎牛血清、RPMI 1640培養液、胰蛋白酶-EDTA購于美國Gibco公司，兔抗人GAPDH多克隆抗體、兔抗人GHR單克隆抗體、羊抗兔IgG二抗均購于美國Abgent公司，GenMuteTM體外siRNA轉染試劑、CCK-8試劑盒、8 μm Transwell小室購自武漢博士德生物工程公司，Matrigel膠購自BD公司，逆轉錄試劑盒購于TaKaRa公司，SYBR Premix EX Taq（Perfect real time染料法實時熒光定量試劑盒） 購于Invitrogen公司。
1.2 細胞培養
SMMC-7721細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，37 ℃、5%體積分數的CO2條件下培養、胰蛋白酶-EDTA消化和傳代，取對數生長期細胞備用。
1.3 合成siRNA
根據相關文獻[3]，參考siRNA的設計方法，選擇特異性的針對GHR的siRNA序列：正義鏈為5＇-TG-CTGATGAATCCCAGTTAAACTGACGTTTTGGCC-ACTGACTGACGTCAGTTTCTGGGATTCAT-3＇，陰性對照的siRNA序列：正義鏈為5＇-TGCTGAAATG-TACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTG-ACGTCTCCACGCAGTACATTT-3＇，以上RNA序列由武漢擎科創新生物科技有限公司合成。
1.4 細胞分組及siRNA轉染
取對數生長期的SMMC-7721細胞，將其分為空白對照組（未轉染siRNA）、陰性對照組（轉染非特異性的siRNA）和特異轉染組（轉染特異性干擾GHR表達的siRNA） 3組。將細胞用胰蛋白酶-EDTA消化后轉至9.6 cm2面積的6孔板中，待細胞生長成密度約為70%左右的單層細胞后，依據GenMuteTM體外siRNA轉染試劑盒提供的說明書，按步驟進行轉染。轉染24 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，取胞質內熒光信號透亮的細胞進行下一步實驗。
1.5 real-time PCR法檢測SMMC-7721細胞中GHR mRNA的表達
SMMC-7721細胞總RNA提取采用Trizol法，按其步驟，提取總RNA。按從TaKaRa公司購入的Prime Script RT reagent Kit試劑盒進行逆轉錄，得到相應的cDNA。real-time PCR反應選用SYBR Premix EX Taq （Perfect real time染料法實時熒光定量試劑盒）。根據GeneBank中的SMMC-7721的完整RNA信息，應用Prime 5.0軟件，由武漢擎科創新生物科技有限公司設計并合成人GHR cDNA引物：上游引物為5＇-CTATATTGACAACATCAGTTCC-3＇，下游引物為5＇-CCTTCCTTGAGGAGATCTGG-3＇，擴增片段長度為330 bp；β-肌動蛋白（β-actin）cDNA引物：上游引物為5＇-GGGTCAGAAGGATTCCTA TG-3＇，下游引物為5＇-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3＇，擴增片段長度為237 bp [4]。反應條件為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin，再根據每組△Ct值分別求出均數。
1.6 免疫印跡（Western blot）法檢測SMMC-7721細胞中GHR蛋白的表達
離心收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，吸干洗滌液。按1×106個細胞加入100 μl蛋白裂解液裂解細胞，后置于冰上30 min，10 000 r/min（r=10 cm）離心10 min，取上清。用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。上樣后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳。轉膜后用5%脫脂牛奶封閉，再根據一抗的不同稀釋濃度孵育一抗，4 ℃搖床過夜。洗膜后孵育二抗，再進行顯色及曝光。應用Fluor-S Multimager Scanner掃描儀和Quantity One軟件掃描膠片，得到蛋白條帶的灰度值進行半定量比較分析。
1.7 采用CCK-8法檢測GHR對SMMC-7721細胞增殖能力的影響
在96孔板中分別鋪上3組細胞，每孔大約3×103個細胞，移除培養基后加入預先按體積比1:10（CCK-8:培養基）配置好混合液，37 ℃避光培養，分別于1 h、2 h、3 h、24 h測定細胞增殖能力，檢測波長450 nm處的吸光度值，參比波長630 nm。實驗重復3次，取其均值。
1.8 Transwell法檢測GHR對SMMC-7721細胞侵襲能力的影響
提前將Matrigel置于4 ℃冰箱中過夜，用無血清培養基稀釋后（無血清1640培養基:Matrigel為1:4），加入預冷的Transwell小室，每小室40 μL，置于37 ℃培養箱中孵育4 h。上室中加入300 μL約含2×105個細胞的無血清1640培養基，下室中加入含10%胎牛血清的完全培養基。37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h取出。用棉簽擦凈上室未穿透的細胞，在顯微鏡下隨機選取5個區域進行細胞計數，取其平均值。
1.9 統計學方法
應用SPSS 13.0統計軟件分析，實驗結果均以均數±標準差（
2 結果
2.1 real-time PCR法檢測各組SMMC-7721細胞中GHR mRNA的表達結果
與空白對照組及陰性對照組相比，轉染了siRNA干擾GHR后，SMMC-7721細胞中GHR mRNA的相對表達量明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）；而空白對照組及陰性對照組細胞中GHR mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。結果提示，特異性的siRNA干擾了GHR mRNA在SMMC-7721細胞中的表達。
圖1
RT-PCR法檢測各組細胞中GHR mRNA的表達結果。與空白對照組及陰性對照組比較，* P<0.05
2.2 Western blot法檢測各組SMMC-7721細胞中GHR蛋白的表達結果
空白對照組灰度值為0.99±1.98，陰性對照組灰度值為0.97±0.23，空白對照組及陰性對照組細胞中GHR蛋白表達灰度值比較差異無統計學意義（P>0.05）；而轉染了siRNA干擾GHR后，SMMC-7721細胞中GHR蛋白表達灰度值（0.32±0.15）較空白對照組及陰性對照組明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。結果提示，經過將siRNA轉染至SMMC-7721肝癌細胞后，GHR在蛋白質的表達水平明顯降低。
圖2
Western blot檢測siRNA干擾GHR后SMMC-7721細胞GHR蛋白的表達。1：空白對照組；2：陰性對照組；3：特異轉染組
2.3 CCK-8法檢測GHR對SMMC-7721細胞增殖能力的影響
結果見圖 3。從圖 3可見，在siRNA干擾GHR的表達后，SMMC-7721細胞的增殖能力與空白對照組和陰性對照組相應時相比較均明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），而空白對照組和陰性對照組的增殖能力比較差異無統計學意義（P<0.05）。結果提示，siRNA干擾GHR后SMMC-7721細胞的增殖能力明顯下降。
圖3
CCK-8法檢測GHR對SMMC-7721細胞增殖能力的影響。與空白對照組及陰性對照組比較，* P<0.05
2.4 Transwell法檢測細胞侵襲的能力
根據SMMC-7721細胞從上室穿過膜上的Matrigel到下室的數量，可以反映細胞的侵襲能力。空白對照組穿過膜的細胞數為（327±10）個，陰性對照組為（320±8）個，2組間比較差異無統計學意義（P=0.63）。特異轉染組的穿膜細胞數為（137±7）個，明顯少于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。結果提示，siRNA干擾GHR后SMMC-7721細胞的侵襲能力明顯減弱（圖 5），這與細胞增殖的實驗結果一致。
圖4
Transwell法檢測GHR對SMMC-7721細胞的侵襲能力的影響。與空白對照組及陰性對照組比較，* P<0.05
圖5
Transwell法檢測SMMC-7721細胞在體外的侵襲能力（Giemsa染色 ×200）。5A：空白對照組；5B：陰性對照組；5C：特異轉染組
3 討論
肝癌是我國常見的惡性腫瘤，其發病較為隱匿，多數患者就診時已是晚期，僅10%～30%的肝癌患者能接受根治性切除手術[5]。因此，從肝癌的基因靶向治療角度尋找到新的治療靶點、抑制肝癌細胞的增殖及遷移具有重要的意義。
關于肝癌組織是否含有GHR一直存在爭議。正是由于此原因，臨床工作者在原發性肝癌患者圍手術期是否使用重組人生長激素以增強機體的免疫功能一直比較慎重，對其是否會促進肝癌細胞的生長及侵襲沒有明確的結論[6-8]。GHR在乳腺癌、結腸癌等腫瘤細胞中具有較正常組織更高的表達量[9]，但不同的腫瘤細胞中GHR的表達存在較大差異。肝癌細胞中是否有GHR基因的表達，一直存在爭議。從1990年開始，Chang等[10]采用放射配體法檢測了正常肝組織、肝硬化組織及肝癌組織中GHR的表達，結果均未能發現GHR的表達。但近年來的研究[11]已經證實人肝癌細胞中已經檢測到GHR mRNA表達，且證實癌組織中GHR mRNA的水平較癌旁組織明顯降低。國內向春華等[12]的研究也表明，肝癌組織內有低表達的GHR，但較癌旁組織表達量低。Amit等[13]發現，并非所有肝癌細胞株表達的GHR都處于低結合活性，如在HepG2細胞中，GHR表現出高結合活性。盡管不同肝癌細胞株所表達的GHR結合活性不相同，但基本可以確定的是大多數肝癌細胞都有GHR的表達，這對于肝癌的基因靶向治療有著重要的意義。就本研究的結果來看，在肝癌SMMC-7721細胞被siRNA干擾GHR的表達后，GHR從mRNA水平及蛋白水平都有明顯下降，從側面也可以證明在肝癌細胞中GHR是有一定量的表達的。
siRNA已成為研究基因功能的重要工具，其主要是通過合成19～23個核苷酸對的siRNA，與Dicer酶和一些蛋白質構成RNA誘導復合物，根據堿基互補配對規律，特異性地降解與其同源的mRNA[14]。近年來，RNA干擾技術已廣泛運用在腫瘤的基因功能及基因治療的研究中。我們利用siRNA，成功地構建了干擾GHR表達的SMMC-7721細胞，通過CCK-8試驗及Transwell細胞遷移試驗證實了沉默GHR之后，肝癌細胞SMMC-7721的增殖及遷移侵襲的能力明顯受到抑制，這可能與細胞內JAK-STAT等信號通路有關[15]，此通路能激活c-fos [16]、c-jun [17-19]等基因發動細胞內的合成代謝并促進細胞增殖、誘導細胞分化成熟。GHR與生長激素結合后，形成同型二聚體，與之偶聯的JAK2被激活，通過轉磷酸作用，觸發多級信號級聯放大，通過Elk-1、STATs、PI3K等轉錄因子，誘導胰島素樣生長因子表達，進而促進細胞增殖[20-22]。此外，外源性生長激素與腫瘤細胞的GHR結合，通過腫瘤細胞內的生長激素-胰島素樣生長因子-Ⅰ軸發揮作用，產生胰島素樣生長因子-Ⅰ，此通路可直接刺激腫瘤細胞增殖[23-25]，而在生長激素作用的重要靶點GHR被siRNA干擾表達后，生長激素無法發揮其作用，直接導致本實驗的結果，即肝癌細胞的增殖及侵襲能力均明顯下降，但其具體的作用機制仍需進行進一步的研究。
