引用本文： 扶志敏, 劉建新, 李名鵬, 羅濱. 雷洛昔芬對人主動脈瓣間質細胞增殖和凋亡的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(2): 143-146. doi: 10.7507/1007-4848.201507053 復制
隨著我國人口老齡化趨勢的加劇，心臟瓣膜病的發病率逐年增加，其中主動脈瓣病變在心臟瓣膜病變中占很大比例[1-2]。主動脈瓣間質細胞（AVICs）是構成主動脈瓣膜的主要成分，其生物學功能的改變對主動脈瓣膜病變的發生起著重要的作用[3]。雷洛昔芬（raloxifene，RAL）屬于第二代選擇性雌激素受體調節劑（selective estrogen receptor modulation，SERM），表現出對心血管和骨組織的雌激素樣作用，對子宮和乳腺組織則有抗雌激素作用，具有明顯的組織選擇性，有望成為一種治療心血管疾病的新型藥物[4-5]。本實驗應用Ⅱ型膠原酶分離出人的 AVICs，并進行體外培養，用不同濃度的 RAL 作用后，檢測 RAL 對 AVICs 增殖和凋亡的影響，為進一步研究 RAL 對主動脈瓣病變的作用奠定了基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
試劑和儀器主要包括雷洛昔芬（Sigma），DMEM 高糖型基礎培養基（Hyclone），胎牛血清（Hyclone），青霉素和鏈霉素（Hyclone），谷氨酰胺（Beyotime），Ⅱ型膠原酶（Worthington），磷酸鹽緩沖液（PBS，Hyclone），細胞增殖與毒性檢測試劑盒（MTS，promega），全自動酶標儀（BIO-RAD），0.22 μm 一次性過濾器（Millipore），50 ml 離心管（Corning），100 ml 燒瓶附錫箔紙做蓋，眼科剪，細胞刮（Corning），細胞培養箱（Thermo），60 mm、100 mm培養皿，6 孔、96 孔板（Corning），超凈工作臺（BAKER SterilGARD）。
1.2 AVICs 原代與傳代培養
人主動脈瓣取材于郴州市第一人民醫院心胸外科心臟移植且無心臟瓣膜病變的 45 歲女性患者，術前簽署知情同意書。小心沿主動脈瓣膜根部取下瓣膜，低溫帶回實驗室。依次用 1 000 U/ml 抗生素洗滌 30 s，500 U/ml、200 U/ml、100 U/ml 的抗生素洗滌 3 min。將瓣膜組織放入 60 mm 培養皿，加入含 600 U/mlⅡ型膠原酶的細胞培養基，放入37 °C、5% CO2 培養箱內消化 15 min。細胞刮刮去瓣膜組織表面內皮細胞，在 100 mm 含消化液培養皿用無菌顯微剪剪成 1 mm×1 mm 的小塊，移至 100 ml 燒瓶中，37 °C、5% CO2 培養箱內消化 6 h，離心得到原代 AVICs，待其達到 90% 融合度時，按 1:3 進行傳代培養[6]。
1.3 MTS 檢測
按 300 個/孔將 AVICs 接種至 5 塊 96 孔板中，每組設 3 個平行復孔，待細胞完全貼壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，其中 0 nmol/L RAL 組作為對照組，其余為實驗組，分別在加藥后的 0 d、3 d、5 d、7 d、9 d，按每孔 20 μl 量加入 MTS 反應液，放入 37 °C、5% CO2 的培養箱中孵育 2 h，用全自動酶標儀檢測 490 nm 波長處的吸光度值（OD值），描繪出生長曲線。
1.4 流式細胞儀檢測
1.4.1 檢測細胞周期 將 AVICs 按 2×104 個/孔接種于 6 孔板中，待細胞完全貼壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，37 °C、5% CO2 的培養箱中培養 7 d 后，收集細胞，PBS 漂洗，離心，加入 1 ml –20 °C 預冷的 75% 乙醇，重懸樣本，做好標記，碘化丙啶（PI）染色，流式細胞儀檢測細胞周期。
1.4.2 檢測細胞凋亡 將主動脈瓣間質細胞按 8×104 個/孔接種于 6 孔板中。細胞完全貼壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，用無血清培養基誘導凋亡培養 7 d 后，離心，去除上清液，加入 100 μl 的 1× 結合緩沖液（binding buffer，BD）重懸細胞。加入 5 μl APC Annexin-V 細胞凋亡檢測試劑盒和 5 μl PI（BD），室溫避光染色 15 min，上機檢測。
1.5 統計學分析
采用 SPSS 17.0 進行統計分析，計量資料以均數 ± 標準差（ ）表示，RAL 不同濃度實驗組和對照組之間的比較采用兩組間的非配對t 檢驗，P＜0.05為有差異有統計學意義。
2 結果
2.1 分離得到的 AVICs
用含 10% 胎牛血清的培養基培養分離得到的 AVICs，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁后呈現出狹長條形樣改變，主要表現為梭形和多角形（圖 1），該細胞生長較為緩慢，每 3 d 更換一次培養基，每 7～10 d 傳代。
圖1
人主動脈瓣間質細胞 a. ×100；b. ×400
2.2 RAL 對 AVICs 增殖的影響
酶標儀檢測第 0 d、3 d、5 d、7 d、9 d 各個 RAL 濃度作用下 490 nm 波長處 OD 值。與對照組相比，10 nmol/L 和 100 nmol/L RAL 在第 5、7、9 d 時顯著抑制 AVICs 增殖（P＜0.05），盡管 1 000 nmol/L RAL 在第 5 d 時也表現出了明顯的抑制 AVICs 增殖的作用（P＜0.05，圖 2），但這種抑制作用在第 7 d 時表現為 OD 值降低為 0.196±0.029，此時在倒置顯微鏡下可觀察到出現了部分細胞飄落死亡，隨著時間的增加，到第 9 d 時 OD 值進一步降為 0.145±0.017，觀察細胞發現，此時已有大量細胞死亡。
圖2
MTS 檢測不同濃度 RAL 對 AVICs 增殖的影響
流式細胞儀檢測第 7 d 時不同濃度 RAL 作用下 AVICs 周期，結果顯示：0.1 nmol/L 和 1 nmol/L RAL 組分別與對照組相比，細胞的 S 期細胞比例無明顯差異。10 nmol/L RAL 組，100 nmol/L RAL 組和 1 000 nmol/L RAL 組 S 期細胞比例明顯低于對照組（29.85%±1.61% vs. 45.83%±1.45%，21.67%±2.16% vs. 45.83%±1.45%，4.67%±1.34% vs. 45.83%±1.45%，n=6，P＜0.001，圖 3），但結合 MTS 檢測結果，考慮 1 000 nmol/L RAL 組 S 期細胞比例的降低（4.67%±1.34%）是由于細胞的死亡所致。
圖3
不同濃度 RAL 對 AVICs S 期細胞比例的影響 * 與對照組相比，P＜0.001
2.3 AVICs 凋亡比例的變化
結果顯示饑餓處理誘導凋亡成功，0.1 nmol/L RAL 組，1 nmol/L RAL 組和 1 000 nmol/L RAL 組分別與對照組相比，細胞凋亡率（早期凋亡率與晚期凋亡率之和）無明顯差異（圖 4），10 nmol/L 和 100 mol/L RAL 組細胞凋亡率與對照組相比明顯降低（49.34%±2.16% vs. 59.67%±2.81%，41.50%±2.24% vs. 59.67%±2.81%，n=6，P＜0.05）。流式細胞儀結果顯示 1 000 nmol/L RAL 組的細胞的凋亡率為 57.43%±4.45%，同時細胞的死亡率高達 41.26%±3.21%。
圖4
不同濃度 RAL 對 AVICs 細胞凋亡率的影響 * 與對照組相比，P＜0.05
3 討論
主動脈瓣病變是一個復雜的病理過程，過去主動脈瓣膜的病變被普遍認為是一種長期機械壓力誘導下的被動的、非調控的過程[7-8]。而近 10 余年一系列研究表明，心臟瓣膜的病變不僅僅是一個單純的被動過程，而是一個受到活躍調控的主動的生物學過程，在這個復雜的調控過程中，瓣膜間質細胞的增殖和凋亡參與了瓣膜病變和鈣化形成[9-10]。有研究發現，由高脂飲食所致的高脂血癥可誘導新西蘭大白兔的瓣膜出現病變，而在病變的瓣膜中細胞凋亡的數目明顯增加[11-12]，Jian等[13]發現通過誘導羊 AVICs 的凋亡可促進瓣葉鈣化的發生。
RAL 作為新一代 SERM，目前主要用于女性絕經期后骨質疏松癥的治療[14-15]。在心血管方面的作用，研究表明，RAL 和其他一些 SERM 均具有改善血管內皮細胞功能[16-17]、擴張冠狀動脈[5,18]、調節血脂[19]等功能，但 RAL 對心臟瓣膜病變的基礎和臨床研究鮮有報道[20]。
本實驗采用不同濃度的 RAL 作用于 AVICs，我們發現 10 nmol/L 和 100 nmol/L RAL 具有明顯抑制 AVICs 增殖的作用，這表明 RAL 對 AVICs 的作用具有明顯的濃度依賴性，并且這種抑制細胞增殖的作用在第 7 d 最為明顯，因此我們采用流式細胞儀檢測該時間點時不同濃度下的細胞 S 期的比例，進一步驗證 RAL 具有濃度依賴性，然而，隨著藥物濃度進一步增加為 1 000 nmol/L，AVICs 出現了飄落死亡現象，這可能與藥物濃度過高而導致的細胞毒性作用有關。值得重視的是，RAL 對無血清培養基誘導的 AVICs 的凋亡具有抗凋亡的作用，有效濃度仍然為 10 nmol/L、100 nmol/L，而在 1 000 nmol/L 時，流式細胞檢測表明，死亡和凋亡的 AVICs 的總比例占具 98% 以上，再次驗證了過高濃度的 RAL 具有細胞毒性。鑒于前述，瓣膜間質細胞的增殖和凋亡參與了瓣膜病變和鈣化形成，那么我們有理由相信體內合適的有效血藥濃度的 RAL 可通過抑制 AVICs 的增殖和抗凋亡的作用，可能具有改善主動脈瓣膜病變的作用。
隨著我國人口老齡化趨勢的加劇，心臟瓣膜病的發病率逐年增加，其中主動脈瓣病變在心臟瓣膜病變中占很大比例[1-2]。主動脈瓣間質細胞（AVICs）是構成主動脈瓣膜的主要成分，其生物學功能的改變對主動脈瓣膜病變的發生起著重要的作用[3]。雷洛昔芬（raloxifene，RAL）屬于第二代選擇性雌激素受體調節劑（selective estrogen receptor modulation，SERM），表現出對心血管和骨組織的雌激素樣作用，對子宮和乳腺組織則有抗雌激素作用，具有明顯的組織選擇性，有望成為一種治療心血管疾病的新型藥物[4-5]。本實驗應用Ⅱ型膠原酶分離出人的 AVICs，并進行體外培養，用不同濃度的 RAL 作用后，檢測 RAL 對 AVICs 增殖和凋亡的影響，為進一步研究 RAL 對主動脈瓣病變的作用奠定了基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
試劑和儀器主要包括雷洛昔芬（Sigma），DMEM 高糖型基礎培養基（Hyclone），胎牛血清（Hyclone），青霉素和鏈霉素（Hyclone），谷氨酰胺（Beyotime），Ⅱ型膠原酶（Worthington），磷酸鹽緩沖液（PBS，Hyclone），細胞增殖與毒性檢測試劑盒（MTS，promega），全自動酶標儀（BIO-RAD），0.22 μm 一次性過濾器（Millipore），50 ml 離心管（Corning），100 ml 燒瓶附錫箔紙做蓋，眼科剪，細胞刮（Corning），細胞培養箱（Thermo），60 mm、100 mm培養皿，6 孔、96 孔板（Corning），超凈工作臺（BAKER SterilGARD）。
1.2 AVICs 原代與傳代培養
人主動脈瓣取材于郴州市第一人民醫院心胸外科心臟移植且無心臟瓣膜病變的 45 歲女性患者，術前簽署知情同意書。小心沿主動脈瓣膜根部取下瓣膜，低溫帶回實驗室。依次用 1 000 U/ml 抗生素洗滌 30 s，500 U/ml、200 U/ml、100 U/ml 的抗生素洗滌 3 min。將瓣膜組織放入 60 mm 培養皿，加入含 600 U/mlⅡ型膠原酶的細胞培養基，放入37 °C、5% CO2 培養箱內消化 15 min。細胞刮刮去瓣膜組織表面內皮細胞，在 100 mm 含消化液培養皿用無菌顯微剪剪成 1 mm×1 mm 的小塊，移至 100 ml 燒瓶中，37 °C、5% CO2 培養箱內消化 6 h，離心得到原代 AVICs，待其達到 90% 融合度時，按 1:3 進行傳代培養[6]。
1.3 MTS 檢測
按 300 個/孔將 AVICs 接種至 5 塊 96 孔板中，每組設 3 個平行復孔，待細胞完全貼壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，其中 0 nmol/L RAL 組作為對照組，其余為實驗組，分別在加藥后的 0 d、3 d、5 d、7 d、9 d，按每孔 20 μl 量加入 MTS 反應液，放入 37 °C、5% CO2 的培養箱中孵育 2 h，用全自動酶標儀檢測 490 nm 波長處的吸光度值（OD值），描繪出生長曲線。
1.4 流式細胞儀檢測
1.4.1 檢測細胞周期 將 AVICs 按 2×104 個/孔接種于 6 孔板中，待細胞完全貼壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，37 °C、5% CO2 的培養箱中培養 7 d 后，收集細胞，PBS 漂洗，離心，加入 1 ml –20 °C 預冷的 75% 乙醇，重懸樣本，做好標記，碘化丙啶（PI）染色，流式細胞儀檢測細胞周期。
1.4.2 檢測細胞凋亡 將主動脈瓣間質細胞按 8×104 個/孔接種于 6 孔板中。細胞完全貼壁后，依次加入 0 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L 的 RAL，用無血清培養基誘導凋亡培養 7 d 后，離心，去除上清液，加入 100 μl 的 1× 結合緩沖液（binding buffer，BD）重懸細胞。加入 5 μl APC Annexin-V 細胞凋亡檢測試劑盒和 5 μl PI（BD），室溫避光染色 15 min，上機檢測。
1.5 統計學分析
采用 SPSS 17.0 進行統計分析，計量資料以均數 ± 標準差（ ）表示，RAL 不同濃度實驗組和對照組之間的比較采用兩組間的非配對t 檢驗，P＜0.05為有差異有統計學意義。
2 結果
2.1 分離得到的 AVICs
用含 10% 胎牛血清的培養基培養分離得到的 AVICs，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁后呈現出狹長條形樣改變，主要表現為梭形和多角形（圖 1），該細胞生長較為緩慢，每 3 d 更換一次培養基，每 7～10 d 傳代。
圖1
人主動脈瓣間質細胞 a. ×100；b. ×400
2.2 RAL 對 AVICs 增殖的影響
酶標儀檢測第 0 d、3 d、5 d、7 d、9 d 各個 RAL 濃度作用下 490 nm 波長處 OD 值。與對照組相比，10 nmol/L 和 100 nmol/L RAL 在第 5、7、9 d 時顯著抑制 AVICs 增殖（P＜0.05），盡管 1 000 nmol/L RAL 在第 5 d 時也表現出了明顯的抑制 AVICs 增殖的作用（P＜0.05，圖 2），但這種抑制作用在第 7 d 時表現為 OD 值降低為 0.196±0.029，此時在倒置顯微鏡下可觀察到出現了部分細胞飄落死亡，隨著時間的增加，到第 9 d 時 OD 值進一步降為 0.145±0.017，觀察細胞發現，此時已有大量細胞死亡。
圖2
MTS 檢測不同濃度 RAL 對 AVICs 增殖的影響
流式細胞儀檢測第 7 d 時不同濃度 RAL 作用下 AVICs 周期，結果顯示：0.1 nmol/L 和 1 nmol/L RAL 組分別與對照組相比，細胞的 S 期細胞比例無明顯差異。10 nmol/L RAL 組，100 nmol/L RAL 組和 1 000 nmol/L RAL 組 S 期細胞比例明顯低于對照組（29.85%±1.61% vs. 45.83%±1.45%，21.67%±2.16% vs. 45.83%±1.45%，4.67%±1.34% vs. 45.83%±1.45%，n=6，P＜0.001，圖 3），但結合 MTS 檢測結果，考慮 1 000 nmol/L RAL 組 S 期細胞比例的降低（4.67%±1.34%）是由于細胞的死亡所致。
圖3
不同濃度 RAL 對 AVICs S 期細胞比例的影響 * 與對照組相比，P＜0.001
2.3 AVICs 凋亡比例的變化
結果顯示饑餓處理誘導凋亡成功，0.1 nmol/L RAL 組，1 nmol/L RAL 組和 1 000 nmol/L RAL 組分別與對照組相比，細胞凋亡率（早期凋亡率與晚期凋亡率之和）無明顯差異（圖 4），10 nmol/L 和 100 mol/L RAL 組細胞凋亡率與對照組相比明顯降低（49.34%±2.16% vs. 59.67%±2.81%，41.50%±2.24% vs. 59.67%±2.81%，n=6，P＜0.05）。流式細胞儀結果顯示 1 000 nmol/L RAL 組的細胞的凋亡率為 57.43%±4.45%，同時細胞的死亡率高達 41.26%±3.21%。
圖4
不同濃度 RAL 對 AVICs 細胞凋亡率的影響 * 與對照組相比，P＜0.05
3 討論
主動脈瓣病變是一個復雜的病理過程，過去主動脈瓣膜的病變被普遍認為是一種長期機械壓力誘導下的被動的、非調控的過程[7-8]。而近 10 余年一系列研究表明，心臟瓣膜的病變不僅僅是一個單純的被動過程，而是一個受到活躍調控的主動的生物學過程，在這個復雜的調控過程中，瓣膜間質細胞的增殖和凋亡參與了瓣膜病變和鈣化形成[9-10]。有研究發現，由高脂飲食所致的高脂血癥可誘導新西蘭大白兔的瓣膜出現病變，而在病變的瓣膜中細胞凋亡的數目明顯增加[11-12]，Jian等[13]發現通過誘導羊 AVICs 的凋亡可促進瓣葉鈣化的發生。
RAL 作為新一代 SERM，目前主要用于女性絕經期后骨質疏松癥的治療[14-15]。在心血管方面的作用，研究表明，RAL 和其他一些 SERM 均具有改善血管內皮細胞功能[16-17]、擴張冠狀動脈[5,18]、調節血脂[19]等功能，但 RAL 對心臟瓣膜病變的基礎和臨床研究鮮有報道[20]。
本實驗采用不同濃度的 RAL 作用于 AVICs，我們發現 10 nmol/L 和 100 nmol/L RAL 具有明顯抑制 AVICs 增殖的作用，這表明 RAL 對 AVICs 的作用具有明顯的濃度依賴性，并且這種抑制細胞增殖的作用在第 7 d 最為明顯，因此我們采用流式細胞儀檢測該時間點時不同濃度下的細胞 S 期的比例，進一步驗證 RAL 具有濃度依賴性，然而，隨著藥物濃度進一步增加為 1 000 nmol/L，AVICs 出現了飄落死亡現象，這可能與藥物濃度過高而導致的細胞毒性作用有關。值得重視的是，RAL 對無血清培養基誘導的 AVICs 的凋亡具有抗凋亡的作用，有效濃度仍然為 10 nmol/L、100 nmol/L，而在 1 000 nmol/L 時，流式細胞檢測表明，死亡和凋亡的 AVICs 的總比例占具 98% 以上，再次驗證了過高濃度的 RAL 具有細胞毒性。鑒于前述，瓣膜間質細胞的增殖和凋亡參與了瓣膜病變和鈣化形成，那么我們有理由相信體內合適的有效血藥濃度的 RAL 可通過抑制 AVICs 的增殖和抗凋亡的作用，可能具有改善主動脈瓣膜病變的作用。
