肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是我國目前的第一大癌。肺癌不僅發病率高，居惡性腫瘤首位，其死亡率也位列第一[
引用本文： 張峰懿, 李定彪. C4.4A在非小細胞肺癌中的研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(12): 1152-1156. doi: 10.7507/1007-4848.20150286 復制
肺癌是全球癌癥相關死亡的最常見原因,居惡性腫瘤死亡率首位[1]。在我國肺癌發病率呈逐年上升趨勢，且年均增長1.63% [2]。其中,約85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），NSCLC總體的相對5年生存率卻只有約15% [3]。肺癌的發生是環境與自身因素相互作用的結果，但具體發病機制至今尚未完全闡明。由于其具有高度侵襲性的生物學特性和顯著異質性，目前傾向于肺癌是由于多基因多信號通路改變而發生。肺癌生存率高度依賴于腫瘤的早期發現和早期治療。在早期疾病中運用生物標志物，有針對性的預測療效和預后，是改善患者生存率的有效途徑[4]。隨著腫瘤生物學和細胞生物學的不斷發展，新的腫瘤靶點的發現，以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）為代表的靶向治療藥物問世，使晚期NSCLC的運用靶向化治療成為可能。近來有諸多研究發現C4.4A與抑癌基因LKB1有間接負向調控作用[5]，推測C4.4A與肺腺癌患者預后有關，并可能被用于預測C4.4A介導的LKB1途徑靶向治療的療效。本文主要就C4.4A對非小細胞肺癌的發生，發展，預后進行總結，以及通過C4.4A對LKB1途徑進行干預治療非小細胞肺癌展望。
1 C4.4A結構及生物學特性
1.1 C4.4A是一種糖脂錨定的膜蛋白
C4.4A蛋白第一次是Rosel 等[6]在檢測小鼠胰腺腫瘤亞克隆細胞株的抗原性時發現的，因其能被單克隆抗體 C4.4 特異性識別，而命名為C4.4A。C4.4A蛋白是uPAR的3三鋅指結構域一部分[7]，其COOH 末端通過糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinosi-tol，GPI）錨定于細胞表面膜通道，由三至六對特征性S-S橋連接[8-9]。Jacobsen等[10]對C4.4A進行蛋白分析顯示其有兩個比較保守的信號域：其中一個信號域為TGF受體，擁有85個氨基酸；另一個信號域由兩個半胱氨酸環串聯而成，具有100個氨基酸。C4.4A蛋白中的半胱氨酸環信號域與LY-6家族成員可識別部分相同的蛋白，因此，其可以預測同源性結構的LY6/尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase-type PA，uPAR）蛋白家族，即：uPAR、haldisin、TEX101、177和lypd4。
1.2 C4.4A基因定位與腫瘤相關性
C4.4A由lypd3基因編碼，它的cDNA序列測量工作已完成，分子量在94～98 kd之間，長約1 637 bp，可編碼蛋白與細胞膜結合的唯一分子結構——糖基磷酯酰肌醇錨鏈分子，其基因組結構分析顯示與uPAR結構相似度達46.9%，且基因定位于人類腫瘤相關基因突變最活躍的19q13.1-13.2[6]，見圖 1。
圖1
編碼C4.4A蛋白的基因及其外顯子組成結構示意圖
1.3 人體C4.4A蛋白分布
在正常的生理條件下，C4.4A主要分布于皮膚的毛囊、食管、口腔和鼻腔、陰道和角膜基底層的復層鱗狀上皮細胞[11-13]，但其他組織的上皮細胞，如正常肺的肺泡和支氣管室則缺乏C4.4A。但最近有研究發現在肺癌[14]、食管癌[15]、惡性黑色素瘤[16]、結腸癌[17]等腫瘤中出現C4.4A的調節異常和過度表達情況。
1.4 C4.4A與腫瘤轉移
在研究早期Smith等[18]就推測C4.4A相關基因的表達可能與細胞膜蛋白質粘附有關。C4.4A可能通過連接層粘連蛋白（laminin，LN）的方式促使腫瘤細胞獲得遷徙的能力。層粘連蛋白（LN）是細胞基底膜上的非膠原黏附糖蛋白，具有與多種基底膜成分結合，從而調節細胞生長和分化的作用。后來Paret等[19]證實了該觀點，Paret及實驗小組將C4.4A的cDNA轉染到BSp73AS腫瘤細胞中，發現經轉染后的BSp73AS腫瘤細胞會長出板狀偽足，這種偽足增加了腫瘤細胞的遷徙能力，促進細胞的擴散，這種能力的獲得與轉染后腫瘤細胞加強了LN1及LN5的綁定有關。同時,該研究還發現C4.4A同樣與半乳糖凝集素3有關，而且由于半乳膠凝集素與α3β1競爭LN1等結合位點，C4.4A與半乳糖凝集素3的鏈接會影響其與層粘連蛋白原（LN）的粘附。
在早期對層粘連蛋白（LN）研究就發現角質細胞將LN5作為臨時基質而擁有遷移能力[20]；在惡性腫瘤中檢測到LN5的分泌標志著細胞具有侵襲轉移的能力[21]。后來研究發現經C4.4A 轉染陽性的非轉移腫瘤細胞可以獲得穿透基底膜的能力，而且穿透細胞膜的能力可以隨著C4.4 A沉默而終止[22]。這些研究結果間接證明C4.4A有可能與惡性腫瘤侵襲轉移有關。
2 C4.4A表達調節
C4.4A蛋白的表達被一種嚴格的調控機制所控制。Smith等[18]研究小組發現在正常的上皮細胞中幾乎不表達該蛋白，但當上皮細胞擁有腫瘤特異性轉移能力時C4.4A蛋白的轉錄表達會上調，而且在正常上皮細胞參與組織修復時，該蛋白的轉錄表達會也會升高。Fries等[23]在對同系但轉移潛能不同的細胞研究時發現，C4.4A雖然存在于具有轉移潛能的細胞基因中，但C4.4A蛋白只會在具有高度轉移潛能的細胞中表達。隨后的一系列研究發現當JunD或C-Jun所在信號通路激活時，C4.4A可表達于原先表達陰性的細胞中。研究人員懷疑C4.4A這種特殊的表達可能是因為JunD或C-Jun信號通路與該蛋白共轉染發生強化所致。同時，發現在腫瘤細胞及創傷修復中C/EBPβ的表達上調也可能為C4.4A 表達提供條件[24-26]。
近期研究數據間接表明，C4.4A可能通過腫瘤抑制基因LKB1或STK lI進行負向調控。在Gu等的試驗中可以看到當抑癌基因LKB1失活時，編碼C4.4A的lypd3基因在食管癌細胞表達上調，在lypd3被敲除情況下，食管癌細胞系的遷移和侵襲潛力明顯降低[27]。Ji等把重組LKB1基因整合到缺失LKB1的人肺癌h2126細胞株中，在mRNA水平可以觀察到C4.4A表達下調[28]。隨后一系列的研究數據表明大概有17%～54%肺腺癌患者的LKB1基因發生了突變失活[29-31]。Ghaffar等發現肺不典型腺瘤樣增生(atypical adenomatous hyperplasia，AAH)中LKB1基因處于不表達狀態[32]。基于以上實驗證據，我們可以間接證明LKB1基因與C4.4A在肺腺癌發生機制中具有一定的負向調控作用。這就可以給肺腺癌病人在LKB1基因失活情況下，C4.4A出現高表達提供一個合理的解釋。這將意味著C4.4A可能被用來作為通過LKB1途徑或者mTOR信號通路進行靶向治療的生物標志物。
3 C4.4A在NSCLC研究中的進展
近年來,研究發現在多種侵襲性腫瘤中C4.4A呈現高表達狀態，例如肺癌、食管癌、結腸癌等，但是C4.4A在NSCLC中具體的作用機制還不夠明確。目前,很多研究表明C4.4A與腫瘤的浸潤、轉移有關，如最早Seiter [33]通過定量聚合酶鏈反應和原位雜交技術在黑色素瘤中證明C4.4A的mRNA呈表達狀態，且與腫瘤的分化和惡性程度有關。Paret等[34]發現C4.4A表達于80%以上的原發性結腸癌細胞及肝轉移灶，提出C4.4A是一個候選的標志物用于大腸癌的診斷。Jacobsen等[35]在研究非小細胞肺癌患者生存率影響差異時發現，C4.4A可能是非小細胞肺癌患者總體生存率和腫瘤復發的一個可靠預后標志物。
在對NSCLC研究中，Hanahan等[22]發現C4.4A 可能通過金屬基質蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在腫瘤侵襲中起關鍵性作用，參與細胞信號傳導和轉移。MMPs能降解多種細胞外基質中成分,從而破壞正常的組織學屏障，為腫瘤細胞轉移提供條件。Esselen等[36]通過細胞培養穩定同位素標記技術(stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）技術確定C4.4A可做為金屬蛋白酶ADAM10和ADAM17的底物降解基質，ADAM10和ADAM 17通過降解底物基質C4.4A促進腫瘤轉移，從而與腫瘤進展有關。
Travis等[37]在切除的肺腫瘤組織中利用免疫組織化學染色C4.4A評分發現C4.4A在肺腺癌高表達。同時，Jacobsen等[35]運用C4.4A評分（強度×頻率）在肺腺癌中針對C4.4A對非小細胞肺癌患者生存率的影響分析時，也發現C4.4A在肺腺癌中的高表達。
另外，Jacobsen[38]通過抗體染色免疫反應發現在正常肺組織中未見C4.4A表達，而不典型腺瘤樣增生(AAH)、原位癌、浸潤性癌表達依次升高。盡管C4.4A功能尚不完全清楚，但C4.4A蛋白具有一種前端表達的特性，這種特性在食管癌[15]、結腸癌[17]都有發現，這些研究提示C4.4A蛋白為可做為潛在肺癌早期診斷標志物。
最近一系列研究間接證明了抑癌基因LKB1與C4.4A在肺腺癌發生機制中存在一定的負向調控作用。研究[39]顯示，LKB1通過2種方式進行調節。首先，LKB1抑制癌促活化因子3抗體（polymoma virus enhancer-3，PEA3）的表達，促使環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）mRNA合成和蛋白表達減少；第二種方式LKB1通過磷酸化蛋白激酶（AMP activatedprotein kinase，AMPK），激活AMPK，實現對mTOR活性的負向調控，進而逐級調控其下游缺氧誘導因子HIF1（hypoxiainducible factor 1，HIF1）、賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）和局部粘著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）。由于LKB1是一個抑癌基因，所以其本身并不是一個理想的藥物靶點，但是如果我們能直接證明C4.4A與LKB1的負向調控關系，這將意味著C4.4A可能與LKB1信號通路的下游蛋白一起成為治療的潛在靶點，見圖 2。
圖2
LKB1及其下游相關靶點信號通路結構示意圖
4 結語
目前，就NSCLC患者而言，大部分患者在明確診斷時已處于晚期。我們對其采取傳統的低劑量放療加新輔助化療的方法，治療效果并不能令人滿意，患者生活質量及生存率并無顯著改善，所以在NSCLC患者治療上，早期發現、早期診斷、早期治療顯得尤為重要。隨著分子生物學不斷發展和基因組學日益完善，新的靶點基因的發現，腫瘤標志物檢測將是肺癌診斷的重要措施。目前，關于C4.4A的研究較少，但比較肯定的是C4.4A與肺癌的轉移密切相關，尤其C4.4A是否通過抑癌基因LKB1信號通路參與肺癌演變過程備受關注，以及能否用C4.4A表達程度預測LKB1途徑介導的靶向治療療效將是今后肺癌研究的重要內容。
肺癌是全球癌癥相關死亡的最常見原因,居惡性腫瘤死亡率首位[1]。在我國肺癌發病率呈逐年上升趨勢，且年均增長1.63% [2]。其中,約85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），NSCLC總體的相對5年生存率卻只有約15% [3]。肺癌的發生是環境與自身因素相互作用的結果，但具體發病機制至今尚未完全闡明。由于其具有高度侵襲性的生物學特性和顯著異質性，目前傾向于肺癌是由于多基因多信號通路改變而發生。肺癌生存率高度依賴于腫瘤的早期發現和早期治療。在早期疾病中運用生物標志物，有針對性的預測療效和預后，是改善患者生存率的有效途徑[4]。隨著腫瘤生物學和細胞生物學的不斷發展，新的腫瘤靶點的發現，以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）為代表的靶向治療藥物問世，使晚期NSCLC的運用靶向化治療成為可能。近來有諸多研究發現C4.4A與抑癌基因LKB1有間接負向調控作用[5]，推測C4.4A與肺腺癌患者預后有關，并可能被用于預測C4.4A介導的LKB1途徑靶向治療的療效。本文主要就C4.4A對非小細胞肺癌的發生，發展，預后進行總結，以及通過C4.4A對LKB1途徑進行干預治療非小細胞肺癌展望。
1 C4.4A結構及生物學特性
1.1 C4.4A是一種糖脂錨定的膜蛋白
C4.4A蛋白第一次是Rosel 等[6]在檢測小鼠胰腺腫瘤亞克隆細胞株的抗原性時發現的，因其能被單克隆抗體 C4.4 特異性識別，而命名為C4.4A。C4.4A蛋白是uPAR的3三鋅指結構域一部分[7]，其COOH 末端通過糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinosi-tol，GPI）錨定于細胞表面膜通道，由三至六對特征性S-S橋連接[8-9]。Jacobsen等[10]對C4.4A進行蛋白分析顯示其有兩個比較保守的信號域：其中一個信號域為TGF受體，擁有85個氨基酸；另一個信號域由兩個半胱氨酸環串聯而成，具有100個氨基酸。C4.4A蛋白中的半胱氨酸環信號域與LY-6家族成員可識別部分相同的蛋白，因此，其可以預測同源性結構的LY6/尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase-type PA，uPAR）蛋白家族，即：uPAR、haldisin、TEX101、177和lypd4。
1.2 C4.4A基因定位與腫瘤相關性
C4.4A由lypd3基因編碼，它的cDNA序列測量工作已完成，分子量在94～98 kd之間，長約1 637 bp，可編碼蛋白與細胞膜結合的唯一分子結構——糖基磷酯酰肌醇錨鏈分子，其基因組結構分析顯示與uPAR結構相似度達46.9%，且基因定位于人類腫瘤相關基因突變最活躍的19q13.1-13.2[6]，見圖 1。
圖1
編碼C4.4A蛋白的基因及其外顯子組成結構示意圖
1.3 人體C4.4A蛋白分布
在正常的生理條件下，C4.4A主要分布于皮膚的毛囊、食管、口腔和鼻腔、陰道和角膜基底層的復層鱗狀上皮細胞[11-13]，但其他組織的上皮細胞，如正常肺的肺泡和支氣管室則缺乏C4.4A。但最近有研究發現在肺癌[14]、食管癌[15]、惡性黑色素瘤[16]、結腸癌[17]等腫瘤中出現C4.4A的調節異常和過度表達情況。
1.4 C4.4A與腫瘤轉移
在研究早期Smith等[18]就推測C4.4A相關基因的表達可能與細胞膜蛋白質粘附有關。C4.4A可能通過連接層粘連蛋白（laminin，LN）的方式促使腫瘤細胞獲得遷徙的能力。層粘連蛋白（LN）是細胞基底膜上的非膠原黏附糖蛋白，具有與多種基底膜成分結合，從而調節細胞生長和分化的作用。后來Paret等[19]證實了該觀點，Paret及實驗小組將C4.4A的cDNA轉染到BSp73AS腫瘤細胞中，發現經轉染后的BSp73AS腫瘤細胞會長出板狀偽足，這種偽足增加了腫瘤細胞的遷徙能力，促進細胞的擴散，這種能力的獲得與轉染后腫瘤細胞加強了LN1及LN5的綁定有關。同時,該研究還發現C4.4A同樣與半乳糖凝集素3有關，而且由于半乳膠凝集素與α3β1競爭LN1等結合位點，C4.4A與半乳糖凝集素3的鏈接會影響其與層粘連蛋白原（LN）的粘附。
在早期對層粘連蛋白（LN）研究就發現角質細胞將LN5作為臨時基質而擁有遷移能力[20]；在惡性腫瘤中檢測到LN5的分泌標志著細胞具有侵襲轉移的能力[21]。后來研究發現經C4.4A 轉染陽性的非轉移腫瘤細胞可以獲得穿透基底膜的能力，而且穿透細胞膜的能力可以隨著C4.4 A沉默而終止[22]。這些研究結果間接證明C4.4A有可能與惡性腫瘤侵襲轉移有關。
2 C4.4A表達調節
C4.4A蛋白的表達被一種嚴格的調控機制所控制。Smith等[18]研究小組發現在正常的上皮細胞中幾乎不表達該蛋白，但當上皮細胞擁有腫瘤特異性轉移能力時C4.4A蛋白的轉錄表達會上調，而且在正常上皮細胞參與組織修復時，該蛋白的轉錄表達會也會升高。Fries等[23]在對同系但轉移潛能不同的細胞研究時發現，C4.4A雖然存在于具有轉移潛能的細胞基因中，但C4.4A蛋白只會在具有高度轉移潛能的細胞中表達。隨后的一系列研究發現當JunD或C-Jun所在信號通路激活時，C4.4A可表達于原先表達陰性的細胞中。研究人員懷疑C4.4A這種特殊的表達可能是因為JunD或C-Jun信號通路與該蛋白共轉染發生強化所致。同時，發現在腫瘤細胞及創傷修復中C/EBPβ的表達上調也可能為C4.4A 表達提供條件[24-26]。
近期研究數據間接表明，C4.4A可能通過腫瘤抑制基因LKB1或STK lI進行負向調控。在Gu等的試驗中可以看到當抑癌基因LKB1失活時，編碼C4.4A的lypd3基因在食管癌細胞表達上調，在lypd3被敲除情況下，食管癌細胞系的遷移和侵襲潛力明顯降低[27]。Ji等把重組LKB1基因整合到缺失LKB1的人肺癌h2126細胞株中，在mRNA水平可以觀察到C4.4A表達下調[28]。隨后一系列的研究數據表明大概有17%～54%肺腺癌患者的LKB1基因發生了突變失活[29-31]。Ghaffar等發現肺不典型腺瘤樣增生(atypical adenomatous hyperplasia，AAH)中LKB1基因處于不表達狀態[32]。基于以上實驗證據，我們可以間接證明LKB1基因與C4.4A在肺腺癌發生機制中具有一定的負向調控作用。這就可以給肺腺癌病人在LKB1基因失活情況下，C4.4A出現高表達提供一個合理的解釋。這將意味著C4.4A可能被用來作為通過LKB1途徑或者mTOR信號通路進行靶向治療的生物標志物。
3 C4.4A在NSCLC研究中的進展
近年來,研究發現在多種侵襲性腫瘤中C4.4A呈現高表達狀態，例如肺癌、食管癌、結腸癌等，但是C4.4A在NSCLC中具體的作用機制還不夠明確。目前,很多研究表明C4.4A與腫瘤的浸潤、轉移有關，如最早Seiter [33]通過定量聚合酶鏈反應和原位雜交技術在黑色素瘤中證明C4.4A的mRNA呈表達狀態，且與腫瘤的分化和惡性程度有關。Paret等[34]發現C4.4A表達于80%以上的原發性結腸癌細胞及肝轉移灶，提出C4.4A是一個候選的標志物用于大腸癌的診斷。Jacobsen等[35]在研究非小細胞肺癌患者生存率影響差異時發現，C4.4A可能是非小細胞肺癌患者總體生存率和腫瘤復發的一個可靠預后標志物。
在對NSCLC研究中，Hanahan等[22]發現C4.4A 可能通過金屬基質蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在腫瘤侵襲中起關鍵性作用，參與細胞信號傳導和轉移。MMPs能降解多種細胞外基質中成分,從而破壞正常的組織學屏障，為腫瘤細胞轉移提供條件。Esselen等[36]通過細胞培養穩定同位素標記技術(stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）技術確定C4.4A可做為金屬蛋白酶ADAM10和ADAM17的底物降解基質，ADAM10和ADAM 17通過降解底物基質C4.4A促進腫瘤轉移，從而與腫瘤進展有關。
Travis等[37]在切除的肺腫瘤組織中利用免疫組織化學染色C4.4A評分發現C4.4A在肺腺癌高表達。同時，Jacobsen等[35]運用C4.4A評分（強度×頻率）在肺腺癌中針對C4.4A對非小細胞肺癌患者生存率的影響分析時，也發現C4.4A在肺腺癌中的高表達。
另外，Jacobsen[38]通過抗體染色免疫反應發現在正常肺組織中未見C4.4A表達，而不典型腺瘤樣增生(AAH)、原位癌、浸潤性癌表達依次升高。盡管C4.4A功能尚不完全清楚，但C4.4A蛋白具有一種前端表達的特性，這種特性在食管癌[15]、結腸癌[17]都有發現，這些研究提示C4.4A蛋白為可做為潛在肺癌早期診斷標志物。
最近一系列研究間接證明了抑癌基因LKB1與C4.4A在肺腺癌發生機制中存在一定的負向調控作用。研究[39]顯示，LKB1通過2種方式進行調節。首先，LKB1抑制癌促活化因子3抗體（polymoma virus enhancer-3，PEA3）的表達，促使環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）mRNA合成和蛋白表達減少；第二種方式LKB1通過磷酸化蛋白激酶（AMP activatedprotein kinase，AMPK），激活AMPK，實現對mTOR活性的負向調控，進而逐級調控其下游缺氧誘導因子HIF1（hypoxiainducible factor 1，HIF1）、賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）和局部粘著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）。由于LKB1是一個抑癌基因，所以其本身并不是一個理想的藥物靶點，但是如果我們能直接證明C4.4A與LKB1的負向調控關系，這將意味著C4.4A可能與LKB1信號通路的下游蛋白一起成為治療的潛在靶點，見圖 2。
圖2
LKB1及其下游相關靶點信號通路結構示意圖
4 結語
目前，就NSCLC患者而言，大部分患者在明確診斷時已處于晚期。我們對其采取傳統的低劑量放療加新輔助化療的方法，治療效果并不能令人滿意，患者生活質量及生存率并無顯著改善，所以在NSCLC患者治療上，早期發現、早期診斷、早期治療顯得尤為重要。隨著分子生物學不斷發展和基因組學日益完善，新的靶點基因的發現，腫瘤標志物檢測將是肺癌診斷的重要措施。目前，關于C4.4A的研究較少，但比較肯定的是C4.4A與肺癌的轉移密切相關，尤其C4.4A是否通過抑癌基因LKB1信號通路參與肺癌演變過程備受關注，以及能否用C4.4A表達程度預測LKB1途徑介導的靶向治療療效將是今后肺癌研究的重要內容。
