引用本文： 王小勇, 廖斌, 于海清, 劉高華, 李多, 肖琳琳, 唐小軍. 腫瘤特異性結核抗原Ag85A基因慢病毒表達載體構建. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(11): 1050-1055. doi: 10.7507/1007-4848.20150260 復制
免疫基因治療是近年來腫瘤研究的熱點領域、也是最值得期待的腫瘤治療新方法之一。引進外源性抗原基因、使其在腫瘤細胞中表達，從而激活宿主免疫系統，對腫瘤細胞產生免疫應答，是腫瘤免疫基因治療的重要策略[1-2]。目前，來自于一些細菌的抗原基因是腫瘤免疫基因治療研究中最常用的目的基因，如結核桿菌的Ag85抗原復合物、金黃色葡萄球菌腸毒素A （staphylococcal enterotoxin A，SEA）、金黃色葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）等，國內外多項研究證實了這種治療方法的可能行和美好前景[3-5]。然而，這些外源性抗原基因的表達，必須局限在腫瘤細胞，才能避免產生廣泛、過度的免疫反應而導致嚴重毒副作用。也就是說，基因治療效應必須具有腫瘤靶向性。實現腫瘤基因治療的靶向性，有兩條途徑：一是目的基因靶向性轉導，二是目的基因靶向性表達。用腫瘤特異性啟動子對基因轉錄進行調控，使其只在腫瘤細胞中表達，是實現目的基因靶向性表達的主要方法[6]。端粒酶催化亞單位（telomerase catalytic subunit，TERT）啟動子具有腫瘤特異性高、轉錄活性強和適用范圍廣的特點，是近年來腫瘤靶向性基因治療研究中應用最為廣泛的基因表達調控元件。已有研究表明，TERT啟動子能驅動多種治療基因，在肝癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤細胞中表達，獲得對這些腫瘤細胞選擇性殺傷[7-9]。本研究克隆了小鼠的TERT啟動子，研究了它在小鼠肺癌細胞、小鼠正常細胞，人肺癌細胞、食管癌細胞以及人正常細胞中的轉錄活性，并構建了以小鼠TERT啟動子作為基因轉錄調控元件的結核桿菌Ag85A基因慢病毒載體，為進一步的腫瘤靶向性免疫基因治療奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 細胞株
小鼠Lewis肺癌細胞株、小鼠成纖維細胞NIH3T3、人肺腺癌細胞株A549、人食管癌細胞株EC-109和正常人胚肺成纖維細MRC-5，均購自中國典型培養物保藏中心。用含10%小牛血清（Hyclone公司產品）的dulbecco′s modified eagle medium（DMEM）培養基（Gibco公司產品），于5%CO2，37℃細胞培養箱中培養。
1.1.2 細菌和質粒
大腸桿菌DH5a為本實驗室保存，無啟動子的熒光素酶報告質粒pGL3- Basic、含SV40啟動子的熒光素酶報告質粒pGL3-promoter、含巨細胞病毒（Cytomegalo virus，CMV）啟動子和海腎熒光素酶的內對照質粒pRL-CMV 均為Promeaga產品，由四川大學華西醫院腫瘤分子診斷研究室王艷萍教授惠贈，慢病毒載體質粒pLVX-EGFP-3FLAG-Puro購自上海生博公司。
1.1.3 主要試劑和儀器
基因組DNA提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自碧云天公司；限制性內切酶，LA-Taq DNA 聚合酶、GC Buffer及DNA連接試劑盒購自Takara公司；熒光素酶檢測試劑盒Dual-Glo Luciferase Assy System 購自Promega公司，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海生工有限公司合成。脂質體lipofectamine2000購自Invitrogen公司。PCR擴增儀為Thermo Hybaid公司PX2型；酶標儀550型、凝膠成像分析儀Gen Doc 2000型為Bio-Rad公司產品，化學發光1420 VICTOR2TM平板讀數器為芬蘭Wallac 公司產品。
1.2 方法
1.2.1 小鼠TERT啟動子（PmTERT）的克隆及其在不同細胞中轉錄活性的檢測
以小鼠Lewis肺癌細胞提取的基因組DNA為模板，PCR 擴增小鼠TERT 啟動子片段PmTERT。PCR引物序列為：上游引物 5′- AAA ACG CGT aaa gga agc ccg aga agc at-3，下游引物 5′- AAA AGA TCT TGT GCT CAA GGC CGG GAT-3，5'端分別設計有限制性內切酶Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位點（下劃線標記）。然后將PCR擴增獲得的PmTERT 插入到無啟動子的熒光素酶表達載體pGL3-Basic多克隆位點的Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ之間，構建PmTERT 驅動的熒光素酶報告質粒pGL3-PmTERT，將連接反應液轉化感受態細胞DH5α，在含100 mg/L的氨芐青霉素LB瓊脂平板上篩選，挑取陽性菌落作菌落PCR進行驗證，正向引物序列為：5′- CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC-，反向引物序列為：5′- CCT TAT GCA GTT GCT CTC C-，該引物位于多克隆位點的下游luciferase基因中，陽性克隆應得到553 bp的片段，陰性克隆應得到231 bp的片段。接種陽性克隆保種，分裝100 μl送測序，測序完全正確的克隆，再接種，用質粒小抽試劑盒抽提質粒，所獲得的質粒就是pGL3-PmTERT ，用Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切再次驗證。
1.2.2 PmTERT 在不同細胞中轉錄活性的檢測
將細胞按70%的匯合度接種到24孔板，24 h后用脂質體Lipofectamine 2000分別將待測質粒（pGL3-Basic、pGL3-promoter和pGL3-PmTERT）與內對照質粒pRL-CMV共轉染各種細胞。48 h后，棄去培養基，用200 μl 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗1遍，吸盡PBS，每孔加100 μl Passive Lysis Buffer（PLB）裂解液，搖床常溫條件下搖15 min，進行裂解，反復吹吸后將裂解好的細胞和PLB并收到無菌EP管，12 000×g，15 s，4℃ 離心后，將上清液吸到另一個無菌EP管中，放到冰里，黑色不透光的96孔板中每孔加50 μl預先混好的LAR Ⅱ，每孔加上清液5 μl，用化學發光儀中檢測螢火蟲熒光索酶（firefly luciferase）活性，然后每孔加Stop & Glo試劑，混勻，l0 min后檢測海腎熒光紊酶(Renilla Luciferase)活性，每組重復4孔，每孔細胞Firefly luciferase的數據除以Renilla luciferase的數據，為轉染質粒細胞Luciferase的相對活性。以陽性對照質粒pGL3-promoter組細胞的Luciferase相對活性為1，以pGL3-PmTERT與pGL3-promoter組細胞Luciferase相對活性比值作為評價PmTERT在相應細胞中轉錄活性的指標，本實驗重復3次，取3次實驗的平均值作為最終結果。
1.2.3 Ag85A基因慢病毒載體的構建及鑒定
1.2.3.1 CMV啟動子驅動的Ag85A基因慢病毒載體pLVx-Ag85A-CMV構建及鑒定
用EcoR和Xba Ⅰ內切酶將慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro的EGFP-3FLAG片段（810 bp）切掉，電泳回收長約8.1 kb的載體片段；并與EcoR和Xba Ⅰ雙酶切的Ag85基因作連接，將連接反應液轉化感受態細胞DH5α，在100 mg/L的氨芐青霉素LB瓊脂平板上篩選，挑取陽性菌落作菌落PCR，正向測序引物序列為：5′- CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-，反向引物序列為5′-CAG CGG GGC TGC TAA AGC GCA TGC-，陽性克隆應得到1 307 bp條帶，陰性克隆得到1 056 bp條帶。接種陽性克隆保種，分裝100 μl送測序，測序完全正確的克隆，再接種，用質粒小抽試劑盒抽提質粒，所獲質粒就是pLVX-Ag85A-CMV慢病毒載體，-20℃保存備用。
1.2.3.2 PmTERT驅動的Ag85A基因慢病毒載體pLVX-Ag85A-PmTERT構建及鑒定
用Mlu Ⅰ和EcoR Ⅰ切去pLVX-Ag85A-CMV慢病毒載體的CMV啟動子片段，插入PmTERT就獲得pLVX-Ag85A-PmTERT慢病毒載體。載體重組、篩選和鑒定與1.2.3.1相同。
1.2.4 Western
blot鑒定重組慢病毒質粒pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A- PmTERT
1.2.4.1 質粒轉染及細胞總蛋白質提取
轉染前一天在六孔板中分別接種小鼠Lewis肺癌細胞和小鼠胚胎成纖維NIH3T3細胞（1×105/孔），24 h后用脂質體分別將重組慢病毒載體pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A-PmTERT轉染上述細胞，6 h后，用新鮮培養基更換轉染液，繼續培養3 d后，提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度后，-80℃深低溫冰箱保存備用。
1.2.4.2 Western
blot實驗每個蛋白樣品取40 μg，體積用上樣緩沖液補至30 μl，100℃水浴5 min后，置4℃存放備用。蛋白樣品加在SDS-PAGE膠上電泳后，電轉至硝酸纖維素膜（NC膜）上，經5%脫脂牛奶加Tween的Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）室溫封閉1 h，分別與一抗和二抗孵育后，顯色。
2 結果
2.1 重組質粒pGL3-PmTERT鑒定結果
DNA測序顯示，重組質粒的多克隆位點Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ之間有與Genebank中小鼠TERT啟動子序列完全一致DNA片段；Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切獲得與預期相似的兩條DNA條帶（圖 1）。
圖1
重組質粒pGL3-PmTERT的Mlu I和Xho I雙酶切鑒定結果
2.2 PmTERT在小鼠及人腫瘤細胞和正常細胞中的轉錄活性
PmTERT 在小鼠Lewis肺癌細胞中的轉錄活性為陽性對照的CMV啟動子的1.72倍，PmTERT在小鼠成纖維細胞NIH3T3中無轉錄活性；PmTERT在在人肺腺癌細胞A549和人食管癌細胞EC-109有轉錄活性，與陽性對照的CMV啟動子活性的比值分別為0.71和0.23，PmTERT在人胚腎成纖維細胞MRC-5細胞中無轉錄活性（圖 2）。
圖2
轉染pGL3-Basic、pGL3-PmTERT和pGL3-promoter的不同細胞Luciferase活性檢測結果
2.3 重組慢病毒載體的鑒定
2.3.1 pLVX-Ag85A-CMV菌落PCR實驗結果
所挑取的8個重組質粒轉化的陽性菌落，PCR有5個獲得預期大小一致的DNA片段圖(3)；陽性克隆測序結果表明，和預期的序列完全一致。
圖3
菌落PCR結果
注：1為空白對照（蒸餾水為模板）；2為陰性對照（空載體為模板）；3為NA Marker：由大至小分別為2 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp； 4～11為挑取的8個轉化子
2.3.2 pLVX-Ag85A-PmTERT菌落PCR實驗結果
所挑取的8個重組質粒轉化的陽性菌落，PCR均獲得與預期大小一致的DNA片段（圖 4）。重組質粒pLVX-Ag85A-PmTERT的多克隆位點Mlu和EcoR Ⅰ 之間有與Genebank中小鼠TERT啟動子序列完全一致DNA片段。
圖4
菌落PCR結果
注： 1為空白對照（蒸餾水為模板）；2為陰性對照（空載體為模板）；3為DNA Marker：由大至小分別為2 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp； 4～11為挑取的8個轉化子
2.4 Western blot鑒定結果
用pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A-PmTERT兩種慢病毒載體分別感染NIH3T3及Lewis肺癌細胞。結果顯示，感染pLVX-Ag85A-CMV的Lewis細胞和NIH3T3細胞均有Ag85A蛋白表達，感染pLVX-Ag85A-PmTERT的Lewis細胞有Ag85A表達，感染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3細胞無g85A表達（圖 5）。
圖5
Western blot檢測Ag85A表達
注：1為陰性對照（感染空病毒載體的Lewis細胞）； 2、3為感染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3細胞和Lewis細胞；4、5為感染pLVX-Ag85A-CMV的NIH3T3細胞和Lewis細胞
3 討論
抗原85復合體（Ag85）是存在于各種分枝桿菌中的分泌性蛋白，由A、B、C 三個組分構成，具有分枝菌酸轉移酶活性，在分枝桿菌細胞壁合成中有重要作用。已有的研究顯示，Ag85復合物具有較強細胞及體液免疫活性，其中以Ag85A的免疫活性最強，能誘導T細胞增殖、刺激機體產生大量的INF-γ和IL-2 [10-11]。從上世紀90年代中后期開始，有研究者將Ag85A及其他結核桿菌抗原基因用于構建預防結核的新型疫苗，取得引人注目的成果[12-13]。近年來，Ag85A基因也被嘗試用于腫瘤基因治療。Zlotta 等[14]的研究顯示，曾經患過結核病的膀胱癌患者體內存在能識別Ag85A蛋白的記憶免疫細胞，膀胱腔內灌注卡介苗后Ag85A進入體內可以激活這些記憶細胞，產生強烈免疫反應。Tarrant等[15]用Ag85A基因轉染黑色素瘤細胞B16-F10，發現轉基因細胞在小鼠體內的成瘤性顯著降低，病理檢查顯示在腫瘤組織中有大量炎性白細胞浸潤。Lee等[16]分別構建了結核桿菌Ag85A、Ag85B、Mpt64、PstS3與ESAT6融合基因的表達載體，這些重組載體與IL-12共同應用，能顯著抑制膀胱癌細胞MBT-2在小鼠體內的生長。在本研究中，我們也構建了CMV啟動子驅動的Ag85A的慢病毒表達載體pLVX-Ag85A-CMV，將其轉染小鼠Lewis肺癌細胞和小鼠成纖維細胞NIH3T3，用Western blot方法均檢測到Ag85A表達。
在基因治療中，如果引入的目的基因在機體內無差別的表達，就可能使正常細胞受到基因治療效應的損傷，從而發生嚴重的不良反應。用腫瘤特異性啟動子對治療基因進行轉錄調控，使其表達局限在腫瘤細胞，是實現腫瘤基因治療腫瘤靶向性的有效方法之一。一些腫瘤標志物基因啟動子，如甲胎球蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、前列腺特異性抗原（PSA）啟動子以及端粒酶催化亞單位（TERT）啟動子都可以用于腫瘤靶向性基因治療的研究[17-19]。端粒酶（telomerase）是一種廣譜腫瘤標志物，在85% 以上的腫瘤細胞中呈現陽性表達，而在正常細胞中，除了生殖細胞和某些干細胞以外，幾乎均無表達[20]。因此TERT啟動子轉錄具有高度的腫瘤特異性，是近年來腫瘤靶向性基因治療研究中應用最為廣泛的基因轉錄元件[21-22]。在以往的研究中，我們克隆了人TERT啟動子序列，發現它在多種肺癌細胞中具有轉錄活性，其調控的自殺基因HSV-TK/GCV治療系統能夠特異性抑制肺癌細胞A549的體外增殖和在裸鼠體內的生長[23-24]。由于小鼠是腫瘤基因治療研究中最常使用的實驗動物，小鼠TERT啟動子（PmTERT）轉錄活性的研究具有重要意義。Si等[25]克隆了不同長度的PmTERT片段，并檢測了這些PmTERT在不同細胞中的轉錄活性。研究顯示，PmTERT的核心區域位于ATG位點上游333 bp內。本研究中，我們克隆了ATG上游331 bp大小的PmTERT片段，Luciferase實驗顯示，PmTERT在小鼠Lewis肺癌細胞中具有良好的轉錄活性，其活性還稍強于陽性對照SV40啟動子，而在小鼠成纖維細胞NIH3T3中無明顯轉錄活性。由于在人類腫瘤研究中，常常將人類腫瘤細胞移植到實驗動物體內，建立各種腫瘤動物模型。因此，有必要明確TERT啟動子在不同種屬的細胞中，是否有相似的轉錄特性。Arendt等[26]的研究顯示，人TERT啟動子在人和犬的腫瘤細胞中有相似的轉錄活性。本研究顯示，PmTERT在人肺腺癌細胞A549和人食管癌細胞EC-109中也有轉錄活性，但活性明顯低于PmTERT在Lewis細胞中的轉錄活性；PmTERT在人類成纖維細胞MRC-5中無明顯轉錄活性。上述結果提示，PmTERT在人細胞中也具有腫瘤特異性的轉錄活性。在本研究中，我們還用PmTERT代替CMV啟動子，構建了PmTERT驅動的腫瘤特異性Ag85A慢病毒載體pLVX-Ag85A-PmTERT，發現轉染pLVX-Ag85A-PmTERT的小鼠Lewis肺癌細胞有Ag85A表達，而轉染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3小鼠成纖維細胞無Ag85A表達，提示以PmTERT驅動的Ag85A基因可以在小鼠肺癌細胞中選擇性表達，這為肺癌的靶向性免疫基因治療的深入研究奠定了基礎。
免疫基因治療是近年來腫瘤研究的熱點領域、也是最值得期待的腫瘤治療新方法之一。引進外源性抗原基因、使其在腫瘤細胞中表達，從而激活宿主免疫系統，對腫瘤細胞產生免疫應答，是腫瘤免疫基因治療的重要策略[1-2]。目前，來自于一些細菌的抗原基因是腫瘤免疫基因治療研究中最常用的目的基因，如結核桿菌的Ag85抗原復合物、金黃色葡萄球菌腸毒素A （staphylococcal enterotoxin A，SEA）、金黃色葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）等，國內外多項研究證實了這種治療方法的可能行和美好前景[3-5]。然而，這些外源性抗原基因的表達，必須局限在腫瘤細胞，才能避免產生廣泛、過度的免疫反應而導致嚴重毒副作用。也就是說，基因治療效應必須具有腫瘤靶向性。實現腫瘤基因治療的靶向性，有兩條途徑：一是目的基因靶向性轉導，二是目的基因靶向性表達。用腫瘤特異性啟動子對基因轉錄進行調控，使其只在腫瘤細胞中表達，是實現目的基因靶向性表達的主要方法[6]。端粒酶催化亞單位（telomerase catalytic subunit，TERT）啟動子具有腫瘤特異性高、轉錄活性強和適用范圍廣的特點，是近年來腫瘤靶向性基因治療研究中應用最為廣泛的基因表達調控元件。已有研究表明，TERT啟動子能驅動多種治療基因，在肝癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤細胞中表達，獲得對這些腫瘤細胞選擇性殺傷[7-9]。本研究克隆了小鼠的TERT啟動子，研究了它在小鼠肺癌細胞、小鼠正常細胞，人肺癌細胞、食管癌細胞以及人正常細胞中的轉錄活性，并構建了以小鼠TERT啟動子作為基因轉錄調控元件的結核桿菌Ag85A基因慢病毒載體，為進一步的腫瘤靶向性免疫基因治療奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 細胞株
小鼠Lewis肺癌細胞株、小鼠成纖維細胞NIH3T3、人肺腺癌細胞株A549、人食管癌細胞株EC-109和正常人胚肺成纖維細MRC-5，均購自中國典型培養物保藏中心。用含10%小牛血清（Hyclone公司產品）的dulbecco′s modified eagle medium（DMEM）培養基（Gibco公司產品），于5%CO2，37℃細胞培養箱中培養。
1.1.2 細菌和質粒
大腸桿菌DH5a為本實驗室保存，無啟動子的熒光素酶報告質粒pGL3- Basic、含SV40啟動子的熒光素酶報告質粒pGL3-promoter、含巨細胞病毒（Cytomegalo virus，CMV）啟動子和海腎熒光素酶的內對照質粒pRL-CMV 均為Promeaga產品，由四川大學華西醫院腫瘤分子診斷研究室王艷萍教授惠贈，慢病毒載體質粒pLVX-EGFP-3FLAG-Puro購自上海生博公司。
1.1.3 主要試劑和儀器
基因組DNA提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自碧云天公司；限制性內切酶，LA-Taq DNA 聚合酶、GC Buffer及DNA連接試劑盒購自Takara公司；熒光素酶檢測試劑盒Dual-Glo Luciferase Assy System 購自Promega公司，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海生工有限公司合成。脂質體lipofectamine2000購自Invitrogen公司。PCR擴增儀為Thermo Hybaid公司PX2型；酶標儀550型、凝膠成像分析儀Gen Doc 2000型為Bio-Rad公司產品，化學發光1420 VICTOR2TM平板讀數器為芬蘭Wallac 公司產品。
1.2 方法
1.2.1 小鼠TERT啟動子（PmTERT）的克隆及其在不同細胞中轉錄活性的檢測
以小鼠Lewis肺癌細胞提取的基因組DNA為模板，PCR 擴增小鼠TERT 啟動子片段PmTERT。PCR引物序列為：上游引物 5′- AAA ACG CGT aaa gga agc ccg aga agc at-3，下游引物 5′- AAA AGA TCT TGT GCT CAA GGC CGG GAT-3，5'端分別設計有限制性內切酶Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位點（下劃線標記）。然后將PCR擴增獲得的PmTERT 插入到無啟動子的熒光素酶表達載體pGL3-Basic多克隆位點的Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ之間，構建PmTERT 驅動的熒光素酶報告質粒pGL3-PmTERT，將連接反應液轉化感受態細胞DH5α，在含100 mg/L的氨芐青霉素LB瓊脂平板上篩選，挑取陽性菌落作菌落PCR進行驗證，正向引物序列為：5′- CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC-，反向引物序列為：5′- CCT TAT GCA GTT GCT CTC C-，該引物位于多克隆位點的下游luciferase基因中，陽性克隆應得到553 bp的片段，陰性克隆應得到231 bp的片段。接種陽性克隆保種，分裝100 μl送測序，測序完全正確的克隆，再接種，用質粒小抽試劑盒抽提質粒，所獲得的質粒就是pGL3-PmTERT ，用Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切再次驗證。
1.2.2 PmTERT 在不同細胞中轉錄活性的檢測
將細胞按70%的匯合度接種到24孔板，24 h后用脂質體Lipofectamine 2000分別將待測質粒（pGL3-Basic、pGL3-promoter和pGL3-PmTERT）與內對照質粒pRL-CMV共轉染各種細胞。48 h后，棄去培養基，用200 μl 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗1遍，吸盡PBS，每孔加100 μl Passive Lysis Buffer（PLB）裂解液，搖床常溫條件下搖15 min，進行裂解，反復吹吸后將裂解好的細胞和PLB并收到無菌EP管，12 000×g，15 s，4℃ 離心后，將上清液吸到另一個無菌EP管中，放到冰里，黑色不透光的96孔板中每孔加50 μl預先混好的LAR Ⅱ，每孔加上清液5 μl，用化學發光儀中檢測螢火蟲熒光索酶（firefly luciferase）活性，然后每孔加Stop & Glo試劑，混勻，l0 min后檢測海腎熒光紊酶(Renilla Luciferase)活性，每組重復4孔，每孔細胞Firefly luciferase的數據除以Renilla luciferase的數據，為轉染質粒細胞Luciferase的相對活性。以陽性對照質粒pGL3-promoter組細胞的Luciferase相對活性為1，以pGL3-PmTERT與pGL3-promoter組細胞Luciferase相對活性比值作為評價PmTERT在相應細胞中轉錄活性的指標，本實驗重復3次，取3次實驗的平均值作為最終結果。
1.2.3 Ag85A基因慢病毒載體的構建及鑒定
1.2.3.1 CMV啟動子驅動的Ag85A基因慢病毒載體pLVx-Ag85A-CMV構建及鑒定
用EcoR和Xba Ⅰ內切酶將慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro的EGFP-3FLAG片段（810 bp）切掉，電泳回收長約8.1 kb的載體片段；并與EcoR和Xba Ⅰ雙酶切的Ag85基因作連接，將連接反應液轉化感受態細胞DH5α，在100 mg/L的氨芐青霉素LB瓊脂平板上篩選，挑取陽性菌落作菌落PCR，正向測序引物序列為：5′- CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-，反向引物序列為5′-CAG CGG GGC TGC TAA AGC GCA TGC-，陽性克隆應得到1 307 bp條帶，陰性克隆得到1 056 bp條帶。接種陽性克隆保種，分裝100 μl送測序，測序完全正確的克隆，再接種，用質粒小抽試劑盒抽提質粒，所獲質粒就是pLVX-Ag85A-CMV慢病毒載體，-20℃保存備用。
1.2.3.2 PmTERT驅動的Ag85A基因慢病毒載體pLVX-Ag85A-PmTERT構建及鑒定
用Mlu Ⅰ和EcoR Ⅰ切去pLVX-Ag85A-CMV慢病毒載體的CMV啟動子片段，插入PmTERT就獲得pLVX-Ag85A-PmTERT慢病毒載體。載體重組、篩選和鑒定與1.2.3.1相同。
1.2.4 Western
blot鑒定重組慢病毒質粒pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A- PmTERT
1.2.4.1 質粒轉染及細胞總蛋白質提取
轉染前一天在六孔板中分別接種小鼠Lewis肺癌細胞和小鼠胚胎成纖維NIH3T3細胞（1×105/孔），24 h后用脂質體分別將重組慢病毒載體pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A-PmTERT轉染上述細胞，6 h后，用新鮮培養基更換轉染液，繼續培養3 d后，提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度后，-80℃深低溫冰箱保存備用。
1.2.4.2 Western
blot實驗每個蛋白樣品取40 μg，體積用上樣緩沖液補至30 μl，100℃水浴5 min后，置4℃存放備用。蛋白樣品加在SDS-PAGE膠上電泳后，電轉至硝酸纖維素膜（NC膜）上，經5%脫脂牛奶加Tween的Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）室溫封閉1 h，分別與一抗和二抗孵育后，顯色。
2 結果
2.1 重組質粒pGL3-PmTERT鑒定結果
DNA測序顯示，重組質粒的多克隆位點Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ之間有與Genebank中小鼠TERT啟動子序列完全一致DNA片段；Mlu Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切獲得與預期相似的兩條DNA條帶（圖 1）。
圖1
重組質粒pGL3-PmTERT的Mlu I和Xho I雙酶切鑒定結果
2.2 PmTERT在小鼠及人腫瘤細胞和正常細胞中的轉錄活性
PmTERT 在小鼠Lewis肺癌細胞中的轉錄活性為陽性對照的CMV啟動子的1.72倍，PmTERT在小鼠成纖維細胞NIH3T3中無轉錄活性；PmTERT在在人肺腺癌細胞A549和人食管癌細胞EC-109有轉錄活性，與陽性對照的CMV啟動子活性的比值分別為0.71和0.23，PmTERT在人胚腎成纖維細胞MRC-5細胞中無轉錄活性（圖 2）。
圖2
轉染pGL3-Basic、pGL3-PmTERT和pGL3-promoter的不同細胞Luciferase活性檢測結果
2.3 重組慢病毒載體的鑒定
2.3.1 pLVX-Ag85A-CMV菌落PCR實驗結果
所挑取的8個重組質粒轉化的陽性菌落，PCR有5個獲得預期大小一致的DNA片段圖(3)；陽性克隆測序結果表明，和預期的序列完全一致。
圖3
菌落PCR結果
注：1為空白對照（蒸餾水為模板）；2為陰性對照（空載體為模板）；3為NA Marker：由大至小分別為2 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp； 4～11為挑取的8個轉化子
2.3.2 pLVX-Ag85A-PmTERT菌落PCR實驗結果
所挑取的8個重組質粒轉化的陽性菌落，PCR均獲得與預期大小一致的DNA片段（圖 4）。重組質粒pLVX-Ag85A-PmTERT的多克隆位點Mlu和EcoR Ⅰ 之間有與Genebank中小鼠TERT啟動子序列完全一致DNA片段。
圖4
菌落PCR結果
注： 1為空白對照（蒸餾水為模板）；2為陰性對照（空載體為模板）；3為DNA Marker：由大至小分別為2 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp； 4～11為挑取的8個轉化子
2.4 Western blot鑒定結果
用pLVX-Ag85A-CMV和pLVX-Ag85A-PmTERT兩種慢病毒載體分別感染NIH3T3及Lewis肺癌細胞。結果顯示，感染pLVX-Ag85A-CMV的Lewis細胞和NIH3T3細胞均有Ag85A蛋白表達，感染pLVX-Ag85A-PmTERT的Lewis細胞有Ag85A表達，感染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3細胞無g85A表達（圖 5）。
圖5
Western blot檢測Ag85A表達
注：1為陰性對照（感染空病毒載體的Lewis細胞）； 2、3為感染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3細胞和Lewis細胞；4、5為感染pLVX-Ag85A-CMV的NIH3T3細胞和Lewis細胞
3 討論
抗原85復合體（Ag85）是存在于各種分枝桿菌中的分泌性蛋白，由A、B、C 三個組分構成，具有分枝菌酸轉移酶活性，在分枝桿菌細胞壁合成中有重要作用。已有的研究顯示，Ag85復合物具有較強細胞及體液免疫活性，其中以Ag85A的免疫活性最強，能誘導T細胞增殖、刺激機體產生大量的INF-γ和IL-2 [10-11]。從上世紀90年代中后期開始，有研究者將Ag85A及其他結核桿菌抗原基因用于構建預防結核的新型疫苗，取得引人注目的成果[12-13]。近年來，Ag85A基因也被嘗試用于腫瘤基因治療。Zlotta 等[14]的研究顯示，曾經患過結核病的膀胱癌患者體內存在能識別Ag85A蛋白的記憶免疫細胞，膀胱腔內灌注卡介苗后Ag85A進入體內可以激活這些記憶細胞，產生強烈免疫反應。Tarrant等[15]用Ag85A基因轉染黑色素瘤細胞B16-F10，發現轉基因細胞在小鼠體內的成瘤性顯著降低，病理檢查顯示在腫瘤組織中有大量炎性白細胞浸潤。Lee等[16]分別構建了結核桿菌Ag85A、Ag85B、Mpt64、PstS3與ESAT6融合基因的表達載體，這些重組載體與IL-12共同應用，能顯著抑制膀胱癌細胞MBT-2在小鼠體內的生長。在本研究中，我們也構建了CMV啟動子驅動的Ag85A的慢病毒表達載體pLVX-Ag85A-CMV，將其轉染小鼠Lewis肺癌細胞和小鼠成纖維細胞NIH3T3，用Western blot方法均檢測到Ag85A表達。
在基因治療中，如果引入的目的基因在機體內無差別的表達，就可能使正常細胞受到基因治療效應的損傷，從而發生嚴重的不良反應。用腫瘤特異性啟動子對治療基因進行轉錄調控，使其表達局限在腫瘤細胞，是實現腫瘤基因治療腫瘤靶向性的有效方法之一。一些腫瘤標志物基因啟動子，如甲胎球蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、前列腺特異性抗原（PSA）啟動子以及端粒酶催化亞單位（TERT）啟動子都可以用于腫瘤靶向性基因治療的研究[17-19]。端粒酶（telomerase）是一種廣譜腫瘤標志物，在85% 以上的腫瘤細胞中呈現陽性表達，而在正常細胞中，除了生殖細胞和某些干細胞以外，幾乎均無表達[20]。因此TERT啟動子轉錄具有高度的腫瘤特異性，是近年來腫瘤靶向性基因治療研究中應用最為廣泛的基因轉錄元件[21-22]。在以往的研究中，我們克隆了人TERT啟動子序列，發現它在多種肺癌細胞中具有轉錄活性，其調控的自殺基因HSV-TK/GCV治療系統能夠特異性抑制肺癌細胞A549的體外增殖和在裸鼠體內的生長[23-24]。由于小鼠是腫瘤基因治療研究中最常使用的實驗動物，小鼠TERT啟動子（PmTERT）轉錄活性的研究具有重要意義。Si等[25]克隆了不同長度的PmTERT片段，并檢測了這些PmTERT在不同細胞中的轉錄活性。研究顯示，PmTERT的核心區域位于ATG位點上游333 bp內。本研究中，我們克隆了ATG上游331 bp大小的PmTERT片段，Luciferase實驗顯示，PmTERT在小鼠Lewis肺癌細胞中具有良好的轉錄活性，其活性還稍強于陽性對照SV40啟動子，而在小鼠成纖維細胞NIH3T3中無明顯轉錄活性。由于在人類腫瘤研究中，常常將人類腫瘤細胞移植到實驗動物體內，建立各種腫瘤動物模型。因此，有必要明確TERT啟動子在不同種屬的細胞中，是否有相似的轉錄特性。Arendt等[26]的研究顯示，人TERT啟動子在人和犬的腫瘤細胞中有相似的轉錄活性。本研究顯示，PmTERT在人肺腺癌細胞A549和人食管癌細胞EC-109中也有轉錄活性，但活性明顯低于PmTERT在Lewis細胞中的轉錄活性；PmTERT在人類成纖維細胞MRC-5中無明顯轉錄活性。上述結果提示，PmTERT在人細胞中也具有腫瘤特異性的轉錄活性。在本研究中，我們還用PmTERT代替CMV啟動子，構建了PmTERT驅動的腫瘤特異性Ag85A慢病毒載體pLVX-Ag85A-PmTERT，發現轉染pLVX-Ag85A-PmTERT的小鼠Lewis肺癌細胞有Ag85A表達，而轉染pLVX-Ag85A-PmTERT的NIH3T3小鼠成纖維細胞無Ag85A表達，提示以PmTERT驅動的Ag85A基因可以在小鼠肺癌細胞中選擇性表達，這為肺癌的靶向性免疫基因治療的深入研究奠定了基礎。
