引用本文： 劉宏, 闞閎, 張文峰, 李時捷, 唐懷好, 劉振波, 鄭志強. 犬急性心肌梗死早期冠狀動脈旁路移植術對梗死周邊區心肌離子通道蛋白表達的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(8): 778-782. doi: 10.7507/1007-4848.20150195 復制
目前對于心肌梗死（MI）后的猝死機制，主要認為與心肌重構及電重構有關。MI或其他心肌損傷在修復期發生室性心律失常及心臟性猝死與心臟的交感神經過度再生即神經重構有關[1-3]。包繞纖維瘢痕的梗死周邊區在心肌梗死后慢性期室上性心動過速、心室顫動的發生機制中起重要作用。本研究通過不同時間段急性心肌梗死冠狀動脈旁路移植術作為干預手段，探討犬急性心肌梗死早期冠狀動脈旁路移植術對梗死周邊區心肌離子通道蛋白表達的影響，應用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測離子通道蛋白Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平以闡述梗死周邊區心肌電重構的機制，為急性心肌梗死早期冠狀動脈旁路移植術提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 材料、儀器與試劑
選取由中國醫科大學動物實驗中心提供的健康雜種犬30只、體重16～26 kg，雌雄不拘。隨機分為心肌梗死搭橋實驗組和心肌梗死不搭橋對照組。實驗組分別在心肌梗死后1周、2周、4周、6周行冠狀動脈搭橋；對每個實驗組分別設立心肌梗死不搭橋對照組。取未結扎冠狀動脈相應區域的心肌組織作為正常組。PCR儀（Biometra Unio Ⅱ型，德國），多功能電泳儀（北京六一儀器廠），紫外分光光度計（UV-3000，英國），凝膠自動成像及分析系統（Chemi Imager 5500，美國）。RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司，PCR引物由大連寶生物公司合成。DNA分子量標準購自大連寶生物公司。TRIZOL試劑盒(Invitrogen公司)。
1.2 標本制備和實驗處理
實驗犬予戊巴比妥鈉30 mg/kg肌肉麻醉，四肢刺入針形電極行心電圖檢測，經左前胸第4肋間切口進胸，游離并結扎冠狀動脈前降支第7段制備心肌梗死模型。以心肌顏色明顯變暗或心電圖Ⅰ、Ⅱ、avL導聯ST段抬高0.2 mV、T波倒置或雙向、病理性Q波出現作為心肌梗死模型手術成功的標志。
實驗組分別在心肌梗死后第1周、2周、4周、6周行冠狀動脈搭橋，實驗組完全模仿患者非體外循環下冠狀動脈搭橋手術過程操作，暴露心臟靶血管前予肝素1 mg/kg體重，取經過深低溫處理的犬異體股動脈作為橋血管[4]，遠端吻合于心臟靶血管，近端吻合于胸部降主動脈，血管吻合畢予以魚精蛋白0.5～1.0 mg/kg中和。術后普通食物喂養。
實驗組在冠狀動脈搭橋8周后開胸切取梗死周邊區邊緣至外周3～5 mm心肌及正常心肌組織，對照組切取相應部位的心肌組織。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測梗死周邊區心肌樣本離子通道蛋白Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA的表達水平及其變化。本研究主要研究的是心肌缺血對離子通道蛋白表達的影響，如設假手術組主要評估手術創傷對離子通道蛋白表達的影響，而搭橋組和不搭橋組均包含有手術創傷，故綜合以上因素未設置假手術組（Sham組）。
1.3 梗死周邊區心肌標本的組織學檢查及RT-PCR 檢測
將一部分切取標本置于mRNA-locker中保存，另一部分經10%中性甲醛固定,常規石臘包埋，垂直于心外膜將石蠟切片切成4 μm的石蠟切片備用。常規伊紅-蘇木素（HE染色）染色光鏡觀察，以證實取材的準確性。
RT-PCR檢測離子通道蛋白Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA的表達水平：擬檢測離子通道蛋白mRNA引物序列及擴增長度見表 1，TRIZOL試劑盒（Invitrogen公司）提取RNA,應用紫外分光光度計（OD260/OD280）檢測目標mRNA的濃度。利用RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司）進行兩步法RT-PCR。
表1
離子通道mRNA引物序列及擴增長度
逆轉錄cDNA：其反應體系Buffer 10×RT 1 μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl，MgCl2 2 μl，RNase Free dH2O 3.75 μl，Random 9 mers 0.5 μl，dNTP Mixture （各10 mol/L） 1 μl，Positive Control RNA (1 μg） 1 μl，RNase Inhibitor 0.25 μl。將以上溶液快速混勻并離心，反應條件為30 ℃ 10 min、42 ℃ 30 min、99 ℃5 min、5 ℃ 5 min，最后于-20 ℃冰箱凍存。
PCR反應在94℃進行預變性2 min后，以94 ℃40 s、 65 ℃40 s、72 ℃1 min作為一個循環，反復達35個循環后予72 ℃進行延伸5 min，其產物保存于 -20 ℃待監測。進行PCR的產物分析時取PCR產物8 μl加入5×Loading Buffer 2 μl混勻，2%瓊脂糖凝膠電泳（120 V/100 mA），在30 min后予溴化乙錠進行染色，最后在凝膠成像系統進行GDS-8000自動成像。PCR產物定量分析時應用Scion Image 軟件測定凝膠電泳條帶像素比值。
1.4 統計學分析
計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 心肌梗死模型制備及冠狀動脈搭橋
心肌梗死模型制備過程中所有犬均存活。實驗組每時間段有4只存活至終點，對照組每時間段有2只存活至終點，均順利完成各項指標的測量。解剖心臟可見梗死區顏色蒼白，與非梗死區分界較為明顯。
2.2 梗死周邊區心肌中離子通道蛋白表達
正常組心肌及實驗組心肌中Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA表達均高于對照組心肌（P＜0.01），其中正常組心肌中Cav1.2 mRNA表達高于4周、6周實驗組心肌（P＜0.05），正常組心肌及1周、2周實驗組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達高于4周、6周實驗組心肌（P＜0.05，圖 1、2）。
圖1
正常心肌、實驗組及對照組心肌中Kv4.3、KchIP2及Cav1.2 mRNA的凝膠電泳條帶
圖2
Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平凝膠電泳條帶像素比值
注：**對照組心肌中離子通道與所有實驗組及正常組心肌比較
心肌梗死對照組心肌中Cav1.2m RNA表達水平減少的幅度均大于所有實驗組（P＜0.05），各實驗組之間差異無統計學意義。對照組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平減少的幅度均大于所有實驗組（P＜0.05）；其中實驗組中相對于1周、2周實驗組心肌，以4周、6周實驗組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平減少的幅度更大（P＜0.05，圖 1、3）。
圖3
Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平凝膠電泳條帶像素比值的變化
注：**對照組心肌中離子通道與所有實驗組比較
3 討論
心肌中交感神經及迷走神經分布不勻，心臟交感神經多分布于心房及心室表面的心外膜層，與冠狀動脈伴行并穿過心室壁分布于心內膜和心外膜下的心肌中[5]，在室間隔分布于靠近左右心室腔的心肌中。交感神經通過神經遞質和受體結合調節心肌細胞膜離子通道，從而實現對心臟的調控。分布于心臟的迷走神經在心室中分布較少，迷走神經心叢通過心內神經節突觸連接實現對心臟的調控。
心肌梗死和傳導阻滯造成結構和功能上的異質性為心肌梗塞死后發生室性心律失常的基本條件，心肌梗死后交感神經過度再生導致交感神經活性亢進，即心肌細胞自律性提高、早期后除極和延遲后除極的出現，從而改變梗死區及梗死周邊存活心肌細胞的電生理特性[6]，梗死周邊區心肌對兒茶酚胺的敏感性增強，心肌細胞的離子電流即外向鉀通道電流（Ito）、延遲整流性鉀電流（Ik）、L型鈣離子通道（Ica，L）等發生改變，相對于外層及內層心肌細胞，梗死周邊區的中層細胞Ito、Ica、Ik明顯縮小[7-8]，從而產生折返性室性心律失常，其折返環多位于梗死周邊區，該區細胞的電生理特性及對兒茶酚胺的敏感性與正常區和梗死區心肌存在明顯區別[9]，故心肌梗死后發生心律失常可能源于折返、心肌自律性改變及觸發性電活動。另外，在心肌梗死后的慢性期，心肌結構的病理改變、神經重構和電重構共同促進了室性心律失常和猝死的發生[10]。
心肌梗死后心臟神經纖維存在著變性、壞死、再生、重構的動態演變過程,神經再生和其他組織一樣，是人體對損傷后的一種修復反應，可能是一種保護性機制，但過度神經再生重構可能對機體有害[10-12]。急性心肌梗死后存在著交感神經重構現象，表現為交感神經再生和過度再生，以梗死周邊區最為明顯。交感神經重構可能與心肌梗死后慢性期室性心律失常和猝死的發生有關[10, 13-16]。研究神經重構的臨床意義大，如能在心肌梗死早期就采取積極的手段預防交感神經的過度再生，使其達到合理的再生狀態，就可能對防止室性心律失常和猝死的發生產生積極的作用[17-21]。另外，急性心肌梗死早期冠狀動脈旁路移植也可以減輕心肌局部腎素活性與血管緊張素對心肌的不利影響[22]，臨床上我們已經開展了急性心肌梗死冠狀動脈旁路移植術，并取得了良好療效[23]。
在犬的心室肌中存在豐富的Ito離子通道蛋白Kv4.3的表達，與其密切相關的KchIP2亞基在犬心肌中也有豐富的表達，由Kv4基因編碼的通道蛋白亞基與KchIP基因家族編碼的β亞基（KchIP2）有協同作用，二者結合導致電流的顯著增加，并且延遲通道的恢復。另外，犬心室肌中離子通道Cav1.2表達豐富，在受到交感神經刺激時增加ICa的作用相對增強[24]。本實驗研究利用RT-PCR方法檢測Cav1.2 mRNA、Kv4.3 mRNA及KchIP2 mRNA表達水平及其變化幅度，正常心肌及實驗組心肌中Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA表達均高于對照組心肌（P＜0.01），其中正常組心肌中Cav1.2 mRNA表達高于4周、6周實驗組心肌（P＜0.05），正常組心肌及1周、2周實驗組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達高于4周、6周實驗組心肌（P＜0.05）。心肌梗死對照組心肌中Cav1.2 mRNA表達水平減少的幅度均大于所有實驗組（P＜0.05），每個實驗組之間差異無統計學意義。對照組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平減少的幅度均大于所有實驗組（P＜0.05）；其中實驗組中相對于1周、2周實驗組心肌，以4周、6周實驗組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平減少的幅度更為明顯（P＜0.05）。實驗結果表明，心肌缺血時間越長，離子通道Kv4.3及KchIP2 mRNA雖然會呈現不同程度的絕對地減少，但離子通道的表達會出現相對地增加；外層心肌中離子通道Kv4.3及KchIP2 mRNA分布較廣、且對交感神經較為敏感；相反，Kv4.3及KchIP2 mRNA在中層心肌分布最少、對交感神經反應較差；而3層心肌中離子通道Cav1.2 mRNA分布均勻、且對交感神經不敏感[24-25]。心肌缺血后雖然離子通道蛋白表達發生改變，但在靜止狀態下沒有交感神經刺激時，這些離子通道仍處于相對穩態，不會發生室性心律失常，由此，我們推斷，如切斷支配心臟的交感神經，是否可以成為治療心肌梗死后室性心律失常的方法，還有待于進一步探索。
目前對于心肌梗死（MI）后的猝死機制，主要認為與心肌重構及電重構有關。MI或其他心肌損傷在修復期發生室性心律失常及心臟性猝死與心臟的交感神經過度再生即神經重構有關[1-3]。包繞纖維瘢痕的梗死周邊區在心肌梗死后慢性期室上性心動過速、心室顫動的發生機制中起重要作用。本研究通過不同時間段急性心肌梗死冠狀動脈旁路移植術作為干預手段，探討犬急性心肌梗死早期冠狀動脈旁路移植術對梗死周邊區心肌離子通道蛋白表達的影響，應用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測離子通道蛋白Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平以闡述梗死周邊區心肌電重構的機制，為急性心肌梗死早期冠狀動脈旁路移植術提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 材料、儀器與試劑
選取由中國醫科大學動物實驗中心提供的健康雜種犬30只、體重16～26 kg，雌雄不拘。隨機分為心肌梗死搭橋實驗組和心肌梗死不搭橋對照組。實驗組分別在心肌梗死后1周、2周、4周、6周行冠狀動脈搭橋；對每個實驗組分別設立心肌梗死不搭橋對照組。取未結扎冠狀動脈相應區域的心肌組織作為正常組。PCR儀（Biometra Unio Ⅱ型，德國），多功能電泳儀（北京六一儀器廠），紫外分光光度計（UV-3000，英國），凝膠自動成像及分析系統（Chemi Imager 5500，美國）。RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司，PCR引物由大連寶生物公司合成。DNA分子量標準購自大連寶生物公司。TRIZOL試劑盒(Invitrogen公司)。
1.2 標本制備和實驗處理
實驗犬予戊巴比妥鈉30 mg/kg肌肉麻醉，四肢刺入針形電極行心電圖檢測，經左前胸第4肋間切口進胸，游離并結扎冠狀動脈前降支第7段制備心肌梗死模型。以心肌顏色明顯變暗或心電圖Ⅰ、Ⅱ、avL導聯ST段抬高0.2 mV、T波倒置或雙向、病理性Q波出現作為心肌梗死模型手術成功的標志。
實驗組分別在心肌梗死后第1周、2周、4周、6周行冠狀動脈搭橋，實驗組完全模仿患者非體外循環下冠狀動脈搭橋手術過程操作，暴露心臟靶血管前予肝素1 mg/kg體重，取經過深低溫處理的犬異體股動脈作為橋血管[4]，遠端吻合于心臟靶血管，近端吻合于胸部降主動脈，血管吻合畢予以魚精蛋白0.5～1.0 mg/kg中和。術后普通食物喂養。
實驗組在冠狀動脈搭橋8周后開胸切取梗死周邊區邊緣至外周3～5 mm心肌及正常心肌組織，對照組切取相應部位的心肌組織。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測梗死周邊區心肌樣本離子通道蛋白Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA的表達水平及其變化。本研究主要研究的是心肌缺血對離子通道蛋白表達的影響，如設假手術組主要評估手術創傷對離子通道蛋白表達的影響，而搭橋組和不搭橋組均包含有手術創傷，故綜合以上因素未設置假手術組（Sham組）。
1.3 梗死周邊區心肌標本的組織學檢查及RT-PCR 檢測
將一部分切取標本置于mRNA-locker中保存，另一部分經10%中性甲醛固定,常規石臘包埋，垂直于心外膜將石蠟切片切成4 μm的石蠟切片備用。常規伊紅-蘇木素（HE染色）染色光鏡觀察，以證實取材的準確性。
RT-PCR檢測離子通道蛋白Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA的表達水平：擬檢測離子通道蛋白mRNA引物序列及擴增長度見表 1，TRIZOL試劑盒（Invitrogen公司）提取RNA,應用紫外分光光度計（OD260/OD280）檢測目標mRNA的濃度。利用RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司）進行兩步法RT-PCR。
表1
離子通道mRNA引物序列及擴增長度
逆轉錄cDNA：其反應體系Buffer 10×RT 1 μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl，MgCl2 2 μl，RNase Free dH2O 3.75 μl，Random 9 mers 0.5 μl，dNTP Mixture （各10 mol/L） 1 μl，Positive Control RNA (1 μg） 1 μl，RNase Inhibitor 0.25 μl。將以上溶液快速混勻并離心，反應條件為30 ℃ 10 min、42 ℃ 30 min、99 ℃5 min、5 ℃ 5 min，最后于-20 ℃冰箱凍存。
PCR反應在94℃進行預變性2 min后，以94 ℃40 s、 65 ℃40 s、72 ℃1 min作為一個循環，反復達35個循環后予72 ℃進行延伸5 min，其產物保存于 -20 ℃待監測。進行PCR的產物分析時取PCR產物8 μl加入5×Loading Buffer 2 μl混勻，2%瓊脂糖凝膠電泳（120 V/100 mA），在30 min后予溴化乙錠進行染色，最后在凝膠成像系統進行GDS-8000自動成像。PCR產物定量分析時應用Scion Image 軟件測定凝膠電泳條帶像素比值。
1.4 統計學分析
計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 心肌梗死模型制備及冠狀動脈搭橋
心肌梗死模型制備過程中所有犬均存活。實驗組每時間段有4只存活至終點，對照組每時間段有2只存活至終點，均順利完成各項指標的測量。解剖心臟可見梗死區顏色蒼白，與非梗死區分界較為明顯。
2.2 梗死周邊區心肌中離子通道蛋白表達
正常組心肌及實驗組心肌中Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA表達均高于對照組心肌（P＜0.01），其中正常組心肌中Cav1.2 mRNA表達高于4周、6周實驗組心肌（P＜0.05），正常組心肌及1周、2周實驗組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達高于4周、6周實驗組心肌（P＜0.05，圖 1、2）。
圖1
正常心肌、實驗組及對照組心肌中Kv4.3、KchIP2及Cav1.2 mRNA的凝膠電泳條帶
圖2
Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平凝膠電泳條帶像素比值
注：**對照組心肌中離子通道與所有實驗組及正常組心肌比較
心肌梗死對照組心肌中Cav1.2m RNA表達水平減少的幅度均大于所有實驗組（P＜0.05），各實驗組之間差異無統計學意義。對照組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平減少的幅度均大于所有實驗組（P＜0.05）；其中實驗組中相對于1周、2周實驗組心肌，以4周、6周實驗組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平減少的幅度更大（P＜0.05，圖 1、3）。
圖3
Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平凝膠電泳條帶像素比值的變化
注：**對照組心肌中離子通道與所有實驗組比較
3 討論
心肌中交感神經及迷走神經分布不勻，心臟交感神經多分布于心房及心室表面的心外膜層，與冠狀動脈伴行并穿過心室壁分布于心內膜和心外膜下的心肌中[5]，在室間隔分布于靠近左右心室腔的心肌中。交感神經通過神經遞質和受體結合調節心肌細胞膜離子通道，從而實現對心臟的調控。分布于心臟的迷走神經在心室中分布較少，迷走神經心叢通過心內神經節突觸連接實現對心臟的調控。
心肌梗死和傳導阻滯造成結構和功能上的異質性為心肌梗塞死后發生室性心律失常的基本條件，心肌梗死后交感神經過度再生導致交感神經活性亢進，即心肌細胞自律性提高、早期后除極和延遲后除極的出現，從而改變梗死區及梗死周邊存活心肌細胞的電生理特性[6]，梗死周邊區心肌對兒茶酚胺的敏感性增強，心肌細胞的離子電流即外向鉀通道電流（Ito）、延遲整流性鉀電流（Ik）、L型鈣離子通道（Ica，L）等發生改變，相對于外層及內層心肌細胞，梗死周邊區的中層細胞Ito、Ica、Ik明顯縮小[7-8]，從而產生折返性室性心律失常，其折返環多位于梗死周邊區，該區細胞的電生理特性及對兒茶酚胺的敏感性與正常區和梗死區心肌存在明顯區別[9]，故心肌梗死后發生心律失常可能源于折返、心肌自律性改變及觸發性電活動。另外，在心肌梗死后的慢性期，心肌結構的病理改變、神經重構和電重構共同促進了室性心律失常和猝死的發生[10]。
心肌梗死后心臟神經纖維存在著變性、壞死、再生、重構的動態演變過程,神經再生和其他組織一樣，是人體對損傷后的一種修復反應，可能是一種保護性機制，但過度神經再生重構可能對機體有害[10-12]。急性心肌梗死后存在著交感神經重構現象，表現為交感神經再生和過度再生，以梗死周邊區最為明顯。交感神經重構可能與心肌梗死后慢性期室性心律失常和猝死的發生有關[10, 13-16]。研究神經重構的臨床意義大，如能在心肌梗死早期就采取積極的手段預防交感神經的過度再生，使其達到合理的再生狀態，就可能對防止室性心律失常和猝死的發生產生積極的作用[17-21]。另外，急性心肌梗死早期冠狀動脈旁路移植也可以減輕心肌局部腎素活性與血管緊張素對心肌的不利影響[22]，臨床上我們已經開展了急性心肌梗死冠狀動脈旁路移植術，并取得了良好療效[23]。
在犬的心室肌中存在豐富的Ito離子通道蛋白Kv4.3的表達，與其密切相關的KchIP2亞基在犬心肌中也有豐富的表達，由Kv4基因編碼的通道蛋白亞基與KchIP基因家族編碼的β亞基（KchIP2）有協同作用，二者結合導致電流的顯著增加，并且延遲通道的恢復。另外，犬心室肌中離子通道Cav1.2表達豐富，在受到交感神經刺激時增加ICa的作用相對增強[24]。本實驗研究利用RT-PCR方法檢測Cav1.2 mRNA、Kv4.3 mRNA及KchIP2 mRNA表達水平及其變化幅度，正常心肌及實驗組心肌中Cav1.2、Kv4.3及KchIP2 mRNA表達均高于對照組心肌（P＜0.01），其中正常組心肌中Cav1.2 mRNA表達高于4周、6周實驗組心肌（P＜0.05），正常組心肌及1周、2周實驗組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達高于4周、6周實驗組心肌（P＜0.05）。心肌梗死對照組心肌中Cav1.2 mRNA表達水平減少的幅度均大于所有實驗組（P＜0.05），每個實驗組之間差異無統計學意義。對照組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平減少的幅度均大于所有實驗組（P＜0.05）；其中實驗組中相對于1周、2周實驗組心肌，以4周、6周實驗組心肌中Kv4.3及KchIP2 mRNA表達水平減少的幅度更為明顯（P＜0.05）。實驗結果表明，心肌缺血時間越長，離子通道Kv4.3及KchIP2 mRNA雖然會呈現不同程度的絕對地減少，但離子通道的表達會出現相對地增加；外層心肌中離子通道Kv4.3及KchIP2 mRNA分布較廣、且對交感神經較為敏感；相反，Kv4.3及KchIP2 mRNA在中層心肌分布最少、對交感神經反應較差；而3層心肌中離子通道Cav1.2 mRNA分布均勻、且對交感神經不敏感[24-25]。心肌缺血后雖然離子通道蛋白表達發生改變，但在靜止狀態下沒有交感神經刺激時，這些離子通道仍處于相對穩態，不會發生室性心律失常，由此，我們推斷，如切斷支配心臟的交感神經，是否可以成為治療心肌梗死后室性心律失常的方法，還有待于進一步探索。
