引用本文： 王曉龍, 陳新濤, 曲戈, 馬海波, 李印, 秦建軍. 微小RNA-155在M1型、M2型巨噬細胞及腫瘤相關巨噬細胞中的表達差異. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(5): 476-480. doi: 10.7507/1007-4848.20150124 復制
微小RNA（microRNA）通過調控免疫相關基因的表達影響免疫系統的發育和功能，進而參與諸如自身免疫性疾病、炎癥及腫瘤等免疫相關疾病的發生發展[1]。近來有關微小RNA-155（miR-155）的研究顯示其在炎癥、免疫及腫瘤的病理生理過程中發揮重要作用[2]，其表達缺失可導致相關炎癥、免疫等相關功能的缺失[3-6]。同時有研究報道miR-155具有抑制腫瘤的作用，其表達缺失可能引起腫瘤進展[7]。機體多種不同的生命活動（例如：組織重塑、炎癥、免疫調節、清除凋亡細胞等）均有巨噬細胞的參與。巨噬細胞在不同微環境影響下可向不同類型分化且功能各異。根據活化的狀態和發揮的作用不同將其分為M1型（經典活化的巨噬細胞）和M2型（替代性活化的巨噬細胞）[8]；同時腫瘤間質中存在著大量的巨噬細胞，稱為腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）。目前在不同類型巨噬細胞及TAMs中miR-155的表達情況尚不清楚。我們的實驗通過誘導單核細胞系（THP-1）分別向巨噬細胞M1型、M2型及TAMs分化，采用熒光染料法實時定量PCR（SYBR Green qRT-PCR）技術，分別檢測miR-155的表達情況，探討miR-155在巨噬細胞M1型、M2型及TAMs中表達的差異。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑
RPMI1640培養基（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），佛波酯（PMA）（P1585，Sigma），重組人白細胞介素-4（IL-4，PEPROTECH），脂多糖（LPS，Sigma），重組人干擾素-γ（IFN-γ，PEPROTECH）；抗體PE-Cy5 CD11b（eBioscience），抗體FITC CD206（BioLegend），抗體PE CD16（BioLegend）。miRNA提取試劑盒（miRNeasy Mini kit）、反轉錄試劑盒（miScript Reverse Transcription Kit）及熒光實時定量試劑盒（miScript SYBR Green PCR Kit）、引物Hs_miR-155*_1 miScript Primer Assay、Hs_miR-15a均是購自Qiagen公司的成品。
1.1.2 細胞株
THP-1購自ATCC，EC9706獲贈于鄭州大學第一附屬醫院。
1.2 方法
1.2.1 巨噬細胞體外誘導
將50 ng/ml PMA刺激培養THP-1，并接種在6孔板中，培養基培養24 h，獲得未分化巨噬細胞M0[9]；收集THP-1來源經PMA誘導刺激24 h的貼壁細胞（M0），采用流式細胞儀檢測細胞膜蛋白表達，確定為巨噬細胞后，將M0進一步誘導，采用20 ng/mL IFN-γ和100 ng/mL LPS刺激培養48 h，誘導出M1型巨噬細胞；采用100 ng/mL IL-4刺激培養48 h，誘導出M2型巨噬細胞[10-11]；使用EC9706上清液間接共培養M0 48 h，獲得TAMs。
1.2.2 流式細胞儀檢測細胞膜蛋白表達
分別收集THP-1來源經PMA誘導刺激24 h的貼壁細胞（M0），及后續經誘導獲得的貼壁細胞（M1），調整M2及TAMs細胞至5×105/管，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1次，50μl RPMI1640+1%FCS重懸，向M0中加入PE-Cy5 CD11b，向經誘導刺激后的M0中加入FITC CD206及PE CD16，避光室溫孵育30 min，PBS洗2遍，再用PBS 400μl重懸后用BD FACS Calibur流式細胞儀檢測[12-15]。
1.2.3 檢測不同類型巨噬細胞miR-155表達的差異性
參照miRNeasy Mini kit（QIAGEN）的說明書提取細胞總RNA，對總RNA進行質量檢測，再按照miScript Reverse Transcription Kit（QIAGEN）說明書進行反轉錄，在冰上配制逆轉錄反應液，反應循環參數：37℃60 min，95℃5 min，4℃forever；使用SYBR Green qRT-PCR方法對cDNA進行擴增，檢測miR-155的相對表達情況；以15a為內參。按照miScript SYBR Green PCR Kit（QIAGEN）說明書在冰上配置20μL real-time PCR反應液；反應條件為：95℃15 min；94℃15 s，57℃30 s，70℃34 s，40個循環。所有反應設立3個復孔。
1.3 統計學分析
用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。各組數據結果采用均數±標準差（
2 結果
2.1 THP-1細胞來源巨噬細胞的誘導和鑒定
THP-1細胞呈類圓形，在培養液懸浮生長（圖 1），經PMA誘導后細胞形態逐漸變不規則，胞體增大，包漿出現空泡，細胞表面伸出偽足，2 h后開始逐漸貼壁，12 h后基本貼壁，24 h后完全貼壁生長成巨噬細胞（M0，圖 2）。流式細胞儀檢測顯示巨噬細胞分化純度達93%以上（圖 3）。IFN-γ+LPS刺激M0向M1型分化比例達到96%以上（圖 4A）；IL-4刺激M0細胞向M2型分化比例經達93%以上（圖 4B）。M0與EC9706間接共培養獲得TAMs，90%的細胞表型與M2型分化類似（圖 4C）。
圖1
THP-1細胞（未誘導）??圖 2 PMA誘導后的THP-1
圖3
THP-1來源巨噬細胞的鑒定
圖4
不同分型巨噬細胞的鑒定
注：A為M1型；B為M2型；C為TAMs
2.2 miR-155的SYBR Green qRT-PCR檢測結果
miR-155（圖 5A）擴增曲線顯示重復性良好。miR-155基因PCR產物的溶解曲線峰值約在75.2℃（圖 5B），15a基因擴增曲線良好（圖 5C），PCR產物的溶解曲線約在75.4℃（圖 5D），溶解溫度均較為均一，峰的形態明顯，顯示擴增的為特異性序列。
圖5
SYBR Green qRT-PCR結果
注：A為miR-155擴增曲線良好；B為miR-155基因PCR產物的溶解曲線峰值約在75.2℃；C為15a擴增曲線良好；D為15a基因PCR產物的溶解曲線峰值約在75.4℃
2.3 miR-155在巨噬細胞M1型、M2型及TAMs中的表達
miR-155在巨噬細胞M1型中的表達量為6.580±0.637，在巨噬細胞M2型中的表達量為1.830±0.337，miR-155在TAMs中的表達量為1.600±0.233。單因素方差分析結果顯示組間差異有統計學意義（F=1.238，P=0.000）。其中M2型（P=0.000）及TAMs（P=0.000）巨噬細胞中miR-155的表達量顯著低于M1型；TAMs與巨噬細胞M2型中間miR-155的表達差異無統計學意義（P=0.546）。
3 討論
miRNA是近年來發現于真核細胞中的一類長21～22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA的3-末端的非翻譯區近乎完全互補結合在轉錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而實現了對靶基因的轉錄后調控，參與多種病理生理過程[16]。Has-miR-155位于染色體21q21.3，定位于GRCh37。miR-155由一個非編碼基因BIC（B-cell integration cluster，BIC）轉錄而成，位于BIC的第3個外顯子[17]。
巨噬細胞作為一種具有較強可塑性和多能性的細胞群體，在體內外不同的微環境影響下，可表現出明顯的功能性差異[14, 18]；根據活化狀態和發揮功能的不同，巨噬細胞主要可分為M1型即經典活化的巨噬細胞（classically activated macrophage）及M2型即替代性活化的巨噬細胞（alternatively activated macrophage）[8, 19]。M1型巨噬細胞通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子，并專職提呈抗原，參與正向免疫應答，發揮免疫監視的功能，具有殺菌、抗腫瘤作用；M2型巨噬細胞可分泌IL-10、CCL2、CCL17、CCL22及TGF-β等，僅有較弱抗原提呈能力，并通過分泌抑制性細胞因子IL-10和/或TGF-β等對免疫應答進行負向調節[15, 20]。
本實驗結果發現巨噬細胞M1型中miR-155高表達，miR-155在巨噬細胞M2型中的表達顯著低于巨噬細胞M1型中的表達。miR-155在巨噬細胞M1型及M2型中表達的差異可能與其不同的細胞功能有關。研究發現，miR-155在炎癥及免疫的病理生理過程中發揮著重要的作用，多種炎癥遞質可誘導使巨噬細胞中miRNA-155表達增加[21]。Vigorito等[4]證實miRNA-155在淋巴細胞免疫反應及生發中心的形成中發揮重要作用。Rodriguez等[5]發現miRNA-155基因敲除鼠樹突狀細胞的抗原提呈功能受限。另外，miRNA-155基因敲除鼠生發中心的功能、T細胞依賴的抗體反應及細胞因子產生均減低[6]。
TAMs是浸潤至腫瘤組織內的巨噬細胞，目前研究顯示TAMs可以促進腫瘤發生、生長、侵襲和轉移[22]。有學者將TAMs與部分腫瘤細胞進行共培養，發現TAMs可分泌多種細胞因子，如表皮生長因子（EGF）、血小板源性生長因子（PDGF）、肝細胞生長因子（HGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和重組人轉錄生長因子B（TGFB）等，這些生長因子能明顯促進腫瘤細胞增殖，同時已在多種腫瘤中證實TAMs與腫瘤血管生成和淋巴管生成密切相關[23]。
Dorsett等[7]證實miRNA-155是通過減少AID（activation-induced cytidine deaminase）產生的潛在癌基因轉位從而起到抑制腫瘤的作用，miR-155的表達缺失可能引起腫瘤的進展。本實驗結果發現TAMs中的miR-155表達較巨噬細胞M1型顯著降低；TAMs表型與巨噬細胞M2型表型相似；TAMs與巨噬細胞M2型中間miR-155的表達差異無統計學意義。我們推測TAMs與巨噬細胞M2型具有相同的細胞功能，這與Murray等[24]研究結果相同。
綜上所述，我們推測miR-155在巨噬細胞M1型、M2型中的差異性表達可能與其分化和/或細胞功能相關；TAMs的表型特征可能向巨噬細胞M2型轉化，同時可能具有與巨噬細胞M2型相同的細胞功能。至于miR-155在不同巨噬細胞中發揮作用的詳細機制，還需要進一步研究。
微小RNA（microRNA）通過調控免疫相關基因的表達影響免疫系統的發育和功能，進而參與諸如自身免疫性疾病、炎癥及腫瘤等免疫相關疾病的發生發展[1]。近來有關微小RNA-155（miR-155）的研究顯示其在炎癥、免疫及腫瘤的病理生理過程中發揮重要作用[2]，其表達缺失可導致相關炎癥、免疫等相關功能的缺失[3-6]。同時有研究報道miR-155具有抑制腫瘤的作用，其表達缺失可能引起腫瘤進展[7]。機體多種不同的生命活動（例如：組織重塑、炎癥、免疫調節、清除凋亡細胞等）均有巨噬細胞的參與。巨噬細胞在不同微環境影響下可向不同類型分化且功能各異。根據活化的狀態和發揮的作用不同將其分為M1型（經典活化的巨噬細胞）和M2型（替代性活化的巨噬細胞）[8]；同時腫瘤間質中存在著大量的巨噬細胞，稱為腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）。目前在不同類型巨噬細胞及TAMs中miR-155的表達情況尚不清楚。我們的實驗通過誘導單核細胞系（THP-1）分別向巨噬細胞M1型、M2型及TAMs分化，采用熒光染料法實時定量PCR（SYBR Green qRT-PCR）技術，分別檢測miR-155的表達情況，探討miR-155在巨噬細胞M1型、M2型及TAMs中表達的差異。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑
RPMI1640培養基（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），佛波酯（PMA）（P1585，Sigma），重組人白細胞介素-4（IL-4，PEPROTECH），脂多糖（LPS，Sigma），重組人干擾素-γ（IFN-γ，PEPROTECH）；抗體PE-Cy5 CD11b（eBioscience），抗體FITC CD206（BioLegend），抗體PE CD16（BioLegend）。miRNA提取試劑盒（miRNeasy Mini kit）、反轉錄試劑盒（miScript Reverse Transcription Kit）及熒光實時定量試劑盒（miScript SYBR Green PCR Kit）、引物Hs_miR-155*_1 miScript Primer Assay、Hs_miR-15a均是購自Qiagen公司的成品。
1.1.2 細胞株
THP-1購自ATCC，EC9706獲贈于鄭州大學第一附屬醫院。
1.2 方法
1.2.1 巨噬細胞體外誘導
將50 ng/ml PMA刺激培養THP-1，并接種在6孔板中，培養基培養24 h，獲得未分化巨噬細胞M0[9]；收集THP-1來源經PMA誘導刺激24 h的貼壁細胞（M0），采用流式細胞儀檢測細胞膜蛋白表達，確定為巨噬細胞后，將M0進一步誘導，采用20 ng/mL IFN-γ和100 ng/mL LPS刺激培養48 h，誘導出M1型巨噬細胞；采用100 ng/mL IL-4刺激培養48 h，誘導出M2型巨噬細胞[10-11]；使用EC9706上清液間接共培養M0 48 h，獲得TAMs。
1.2.2 流式細胞儀檢測細胞膜蛋白表達
分別收集THP-1來源經PMA誘導刺激24 h的貼壁細胞（M0），及后續經誘導獲得的貼壁細胞（M1），調整M2及TAMs細胞至5×105/管，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1次，50μl RPMI1640+1%FCS重懸，向M0中加入PE-Cy5 CD11b，向經誘導刺激后的M0中加入FITC CD206及PE CD16，避光室溫孵育30 min，PBS洗2遍，再用PBS 400μl重懸后用BD FACS Calibur流式細胞儀檢測[12-15]。
1.2.3 檢測不同類型巨噬細胞miR-155表達的差異性
參照miRNeasy Mini kit（QIAGEN）的說明書提取細胞總RNA，對總RNA進行質量檢測，再按照miScript Reverse Transcription Kit（QIAGEN）說明書進行反轉錄，在冰上配制逆轉錄反應液，反應循環參數：37℃60 min，95℃5 min，4℃forever；使用SYBR Green qRT-PCR方法對cDNA進行擴增，檢測miR-155的相對表達情況；以15a為內參。按照miScript SYBR Green PCR Kit（QIAGEN）說明書在冰上配置20μL real-time PCR反應液；反應條件為：95℃15 min；94℃15 s，57℃30 s，70℃34 s，40個循環。所有反應設立3個復孔。
1.3 統計學分析
用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。各組數據結果采用均數±標準差（
2 結果
2.1 THP-1細胞來源巨噬細胞的誘導和鑒定
THP-1細胞呈類圓形，在培養液懸浮生長（圖 1），經PMA誘導后細胞形態逐漸變不規則，胞體增大，包漿出現空泡，細胞表面伸出偽足，2 h后開始逐漸貼壁，12 h后基本貼壁，24 h后完全貼壁生長成巨噬細胞（M0，圖 2）。流式細胞儀檢測顯示巨噬細胞分化純度達93%以上（圖 3）。IFN-γ+LPS刺激M0向M1型分化比例達到96%以上（圖 4A）；IL-4刺激M0細胞向M2型分化比例經達93%以上（圖 4B）。M0與EC9706間接共培養獲得TAMs，90%的細胞表型與M2型分化類似（圖 4C）。
圖1
THP-1細胞（未誘導）??圖 2 PMA誘導后的THP-1
圖3
THP-1來源巨噬細胞的鑒定
圖4
不同分型巨噬細胞的鑒定
注：A為M1型；B為M2型；C為TAMs
2.2 miR-155的SYBR Green qRT-PCR檢測結果
miR-155（圖 5A）擴增曲線顯示重復性良好。miR-155基因PCR產物的溶解曲線峰值約在75.2℃（圖 5B），15a基因擴增曲線良好（圖 5C），PCR產物的溶解曲線約在75.4℃（圖 5D），溶解溫度均較為均一，峰的形態明顯，顯示擴增的為特異性序列。
圖5
SYBR Green qRT-PCR結果
注：A為miR-155擴增曲線良好；B為miR-155基因PCR產物的溶解曲線峰值約在75.2℃；C為15a擴增曲線良好；D為15a基因PCR產物的溶解曲線峰值約在75.4℃
2.3 miR-155在巨噬細胞M1型、M2型及TAMs中的表達
miR-155在巨噬細胞M1型中的表達量為6.580±0.637，在巨噬細胞M2型中的表達量為1.830±0.337，miR-155在TAMs中的表達量為1.600±0.233。單因素方差分析結果顯示組間差異有統計學意義（F=1.238，P=0.000）。其中M2型（P=0.000）及TAMs（P=0.000）巨噬細胞中miR-155的表達量顯著低于M1型；TAMs與巨噬細胞M2型中間miR-155的表達差異無統計學意義（P=0.546）。
3 討論
miRNA是近年來發現于真核細胞中的一類長21～22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA的3-末端的非翻譯區近乎完全互補結合在轉錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而實現了對靶基因的轉錄后調控，參與多種病理生理過程[16]。Has-miR-155位于染色體21q21.3，定位于GRCh37。miR-155由一個非編碼基因BIC（B-cell integration cluster，BIC）轉錄而成，位于BIC的第3個外顯子[17]。
巨噬細胞作為一種具有較強可塑性和多能性的細胞群體，在體內外不同的微環境影響下，可表現出明顯的功能性差異[14, 18]；根據活化狀態和發揮功能的不同，巨噬細胞主要可分為M1型即經典活化的巨噬細胞（classically activated macrophage）及M2型即替代性活化的巨噬細胞（alternatively activated macrophage）[8, 19]。M1型巨噬細胞通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子，并專職提呈抗原，參與正向免疫應答，發揮免疫監視的功能，具有殺菌、抗腫瘤作用；M2型巨噬細胞可分泌IL-10、CCL2、CCL17、CCL22及TGF-β等，僅有較弱抗原提呈能力，并通過分泌抑制性細胞因子IL-10和/或TGF-β等對免疫應答進行負向調節[15, 20]。
本實驗結果發現巨噬細胞M1型中miR-155高表達，miR-155在巨噬細胞M2型中的表達顯著低于巨噬細胞M1型中的表達。miR-155在巨噬細胞M1型及M2型中表達的差異可能與其不同的細胞功能有關。研究發現，miR-155在炎癥及免疫的病理生理過程中發揮著重要的作用，多種炎癥遞質可誘導使巨噬細胞中miRNA-155表達增加[21]。Vigorito等[4]證實miRNA-155在淋巴細胞免疫反應及生發中心的形成中發揮重要作用。Rodriguez等[5]發現miRNA-155基因敲除鼠樹突狀細胞的抗原提呈功能受限。另外，miRNA-155基因敲除鼠生發中心的功能、T細胞依賴的抗體反應及細胞因子產生均減低[6]。
TAMs是浸潤至腫瘤組織內的巨噬細胞，目前研究顯示TAMs可以促進腫瘤發生、生長、侵襲和轉移[22]。有學者將TAMs與部分腫瘤細胞進行共培養，發現TAMs可分泌多種細胞因子，如表皮生長因子（EGF）、血小板源性生長因子（PDGF）、肝細胞生長因子（HGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和重組人轉錄生長因子B（TGFB）等，這些生長因子能明顯促進腫瘤細胞增殖，同時已在多種腫瘤中證實TAMs與腫瘤血管生成和淋巴管生成密切相關[23]。
Dorsett等[7]證實miRNA-155是通過減少AID（activation-induced cytidine deaminase）產生的潛在癌基因轉位從而起到抑制腫瘤的作用，miR-155的表達缺失可能引起腫瘤的進展。本實驗結果發現TAMs中的miR-155表達較巨噬細胞M1型顯著降低；TAMs表型與巨噬細胞M2型表型相似；TAMs與巨噬細胞M2型中間miR-155的表達差異無統計學意義。我們推測TAMs與巨噬細胞M2型具有相同的細胞功能，這與Murray等[24]研究結果相同。
綜上所述，我們推測miR-155在巨噬細胞M1型、M2型中的差異性表達可能與其分化和/或細胞功能相關；TAMs的表型特征可能向巨噬細胞M2型轉化，同時可能具有與巨噬細胞M2型相同的細胞功能。至于miR-155在不同巨噬細胞中發揮作用的詳細機制，還需要進一步研究。
