兩種去細胞人心臟瓣膜的免疫原性分析_《中國胸心血管外科臨床雜志》

作者：

 崔彬 , 劉重陽

中國醫學科學院?北京協和醫學院?國家心臟病中心?心血管病研究所?阜外心血管病醫院（北京?100037）;

關鍵詞：

同種心臟瓣膜免疫原性去細胞鈣化人

DOI：

10.7507/1007-4848.20150123

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的應用組織工程學方法去除人同種心臟瓣膜（HV）的內皮細胞成分或全部細胞成分，比較兩種去細胞HV的免疫原性變化。方法采用低滲液-去污劑（1% Triton）-核酸酶[1μg/ml核糖核酸酶（RNase）和10μg/ml去氧核糖核酸酶（DNase）[去細胞法去除HV表面的內皮細胞成分，保留間質細胞及細胞外基質結構的完整性；采用低滲液-去污劑（1%去氧膽酸）-核酸酶[20μg/ml RNase和200μg/ml DNase]去細胞法去除HV組織中所有細胞成分，保留完整的細胞外基質。免疫組織化學方法測定HLA-DR抗原在HV組織中的表達；行大鼠皮下移植試驗，組織學評價及定性、定量分析組織的鈣化程度。結果免疫組織化學結果證實HV去內皮細胞和去全部細胞后組織中HLA-DR抗原表達均下降，但去全部細胞HV的HLA-DR抗原表達下降更為顯著。大鼠皮下移植實驗結果表明深低溫液氮保存HV和去內皮細胞HV組織中有大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為著，管壁組織更為顯著；去全部細胞HV炎性反應較輕，僅組織邊緣有少量炎性細胞浸潤。鈣鹽染色深低溫液氮保存HV和去內皮細胞HV組織中可見鈣鹽沉積，呈現大量黑色顆粒，管壁組織更為顯著；而去全部細胞HV組織中鈣鹽沉積極少。原子吸收光譜法定量分析結果表明去全部細胞HV組織中鈣離子含量明顯低于去內皮細胞HV和深低溫液氮保存HV（P＜0.05），后兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。結論去全部細胞HV組織免疫原性顯著下降，移植后炎性反應和組織鈣化程度顯著減輕。去內皮細胞HV組織免疫原性及移植后炎性反應有所下降，但移植后組織鈣化程度仍顯著增高，且管壁組織鈣鹽含量增高較瓣葉組織更加顯著，提示組織中大量的間質細胞可能是參與HV移植后免疫反應、導致HV移植后鈣化毀損的主要組織成份。

引用本文： 崔彬, 劉重陽. 兩種去細胞人心臟瓣膜的免疫原性分析. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(5): 471-475. doi: 10.7507/1007-4848.20150123 復制

同種心臟瓣膜（homograft valve，HV）及其帶瓣管道是目前理想的人工心臟瓣膜，已廣泛應用于瓣膜置換術及矯治嬰幼兒復雜先天性心臟病術中，但遠期隨訪發現瓣膜仍有鈣化和毀損，需要再次置換^[1-2]。研究表明HV移植于體內可激發免疫反應，供體特異性的白細胞抗原（HLA-Ⅰ抗原、HLA-Ⅱ抗原）抗體、特異性的高親和性細胞毒性T淋巴細胞前體（CTLp）、外周血中輔助性T淋巴細胞（HTLP）的表達均顯著增高，在嬰幼兒患者更為顯著^[3-5]。我們采用深低溫液氮保存人HV，應用組織工程學方法去除HV瓣膜及管壁組織中的內皮細胞成分或全部細胞成分，比較兩種去細胞HV免疫原性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料制備

1.1.1 去內皮細胞HV的制備

取深低溫液氮保存健康成年男性腦死亡6 h內志愿捐獻者的人同種主動脈帶瓣管道。將同種主動脈帶瓣管道置于pH 8.0的Tris低滲緩沖液中[（含10 U/ml抑肽酶和0.1%EDTA）]，4℃靜置1 h；在1%Triton的pH 8.0的Tris等滲緩沖液[（10 U/ml抑肽酶和0.1%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）]中，37℃持續振蕩2 h；在pH 7.6的Tris等滲緩沖液中[核糖核酸酶（RNase）1μg/ml、去氧核糖核酸酶（DNase）10μg/ml]中37℃持續振蕩0.5 h；在pH 7.6的Tris等滲緩沖液中37℃持續振蕩1 h。組織學證實完整去除HV表面的內皮細胞成分，保留間質細胞及細胞外基質結構的完整性。

1.1.2 去全部細胞HV的制備

將同種主動脈帶瓣管道置于pH 8.0的Tris低滲緩沖液中（含有10 U/ml抑肽酶和EDTA）4℃靜置12 h；在1%去氧膽酸（1%DOA）的pH 8.0的Tris等滲緩沖液（10 U/ml抑肽酶和0.1%EDTA）中，37℃持續振蕩24 h；最后在pH7.6的Tris等滲緩沖液中（RNase 20μg/ml、DNase 200μg/ml）中37℃持續振蕩2 h。組織學證實完整去除HV組織中的全部細胞成分，細胞外基質結構完整^[6]。

1.2 觀察指標和方法

1.2.1 兩種去細胞HV的抗原標記免疫學特性

采用大鼠抗人HLA-DR單克隆抗體（北京中山生物技術有限公司）分別標記深低溫保存HV、去內皮細胞HV及去全部細胞HV，兩步法免疫組織化學法評價兩種去細胞HV瓣葉及管壁組織免疫學特性變化。

1.2.2 兩種去細胞HV在體實驗免疫學特性

將SD清潔級雄性大鼠18只（體重250～300 g，北京動物實驗中心提供）分為深低溫保存HV組、去內皮細胞HV組和去全部細胞HV組，每組6只。1%戊巴比妥腹腔麻醉（50 mg/kg），大鼠背部正中切口約0.8～1.0 cm，游離皮下組織，分別對稱性放入1 cm×1 cm大小組織，間斷縫合皮膚，喂養8周。所有大鼠順利康復，無死亡及傷口感染。8周后，應用頸椎脫臼法處死大鼠，仔細游離皮下組織，完整取出組織。10%中性甲醛固定，HE染色觀察兩種去細胞HV瓣葉及管壁組織結構及免疫反應變化。

組織鈣化程度評價：定性分析（鈣鹽染色）：Van Kosaa銀染色法定性評價各組瓣葉及管壁組織鈣化程度。定量分析（原子吸收光度計法）：①干燥；②加入王水（HCl∶HNO3=3∶1）加熱使樣品分解；③高氯酸完全溶解樣品；④加熱至溶液冒煙，冷卻至室溫；⑤加入5%氯化鑭溶液；⑥用去離子水稀釋，搖勻；⑦原子吸收光譜儀（Z80，日立公司）測量，激發鈣離子，測量鈣離子含量，同時做空白對照。定量分析兩種去細胞HV瓣葉及管壁組織鈣化程度。

1.3 統計學分析

用SPSS18.0統計軟件進行統計處理。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩樣本均數比較采用配對t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種去細胞HV的抗原標記免疫學特性

深低溫液氮保存HV瓣膜及其管壁組織的內皮細胞、間質細胞及細胞外基質HLA-DR抗原表達均呈陽性，尤以內皮細胞表達顯著，間質細胞次之，細胞外基質表達呈弱陽性；去內皮細胞，瓣葉及管壁組織HLA-DR抗原表達下降，但組織中間質細胞仍表達較強的免疫原性，且組織中間質細胞數量顯著多于內皮細胞；去全部細胞后，瓣葉及管壁組織HLA-DR抗原表達顯著下降，僅細胞外基質呈弱陽性，見圖 1和圖 2。

圖1 不同HV瓣葉抗原標記的免疫學變化免疫組織化學染色×100

注：A為深低溫保存HV；B為去內皮細胞HV；C為去全部細胞HV

圖選項

組別	瓣葉	管壁
未移植組	0.61±0.12	?1.55±0.44
深低溫保存組	1.39±0.26^*	42.66±7.46^*
去內皮細胞組	1.27±0.56^*	41.66±8.38^*
去全部細胞組	0.83±0.17	?2.35±2.58
????注：與去全部細胞HV比較^* P < 0.05

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《中國胸心血管外科臨床雜志》

兩種去細胞人心臟瓣膜的免疫原性分析

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

1 材料與方法

1.1 材料制備

1.1.1 去內皮細胞HV的制備

1.1.2 去全部細胞HV的制備

1.2 觀察指標和方法

1.2.1 兩種去細胞HV的抗原標記免疫學特性

1.2.2 兩種去細胞HV在體實驗免疫學特性

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩種去細胞HV的抗原標記免疫學特性

2.2 兩種去細胞HV在體實驗免疫學特性

2.2.1 兩種去細胞HV在體實驗免疫反應

2.2.2 兩種去細胞HV在體實驗組織鈣化程度

3 討論

1 材料與方法

1.1 材料制備

1.1.1 去內皮細胞HV的制備

1.1.2 去全部細胞HV的制備

1.2 觀察指標和方法

1.2.1 兩種去細胞HV的抗原標記免疫學特性

1.2.2 兩種去細胞HV在體實驗免疫學特性

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩種去細胞HV的抗原標記免疫學特性

2.2 兩種去細胞HV在體實驗免疫學特性

2.2.1 兩種去細胞HV在體實驗免疫反應

2.2.2 兩種去細胞HV在體實驗組織鈣化程度

3 討論

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