肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。肺癌的早期診斷及預后判斷有助于改善治療效果。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）幾乎參與了所有細胞生物學行為的調控，并在腫瘤的發生、發展中發揮重要的作用，同時miRNA被釋放入血后會穩定存在，這都使miRNAs有望成為新型的臨床生物標志物用于肺癌的診斷及預后判斷。本文就血清miRNA對肺癌的診斷、預后及潛在臨床應用價值的研究進展予以綜述。
引用本文： 孫超, 史宏燦. 血清microRNA在肺癌診斷及預后中的研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(5): 481-485. doi: 10.7507/1007-4848.20150125 復制
據WHO報道，肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位于惡性腫瘤的首位，2012年，全球有820萬患者死于癌癥，其中159萬患者死于原發性肺癌[1]。目前僅有30%的肺癌患者能夠獲得較早的診斷并獲得手術治療的機會，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）ⅠA期患者手術后5年生存率可以達到81.9%，而ⅡB期則降至45.2% [2]，對于失去手術機會的晚期患者5年生存率僅有2.8% [3]。
適用于早期肺癌篩查的分子標志物有助于肺癌早期發現早期治療。最理想的生物標志物應該能夠在體液中穩定存在并利于檢測。近年來，大量研究[4-5]發現微小RNA（microRNA，miRNA）幾乎參與了所有細胞生物學行為的調控，并在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。研究發現miRNA被釋放入血后會穩定存在而不被RNA酶降解，而且不同的腫瘤可能具有不同的miRNA表達譜，這提示miRNA有望成為適用于腫瘤診斷、靶向治療及預后的分子標志物。因此，miRNA逐漸成為眾多科學家研究的熱點之一，miRNA與肺癌的相關性研究也越來越多見。
miRNA是一類長度為19～22個核苷酸的內源性非編碼RNA，成熟miRNA結合到RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）上，導致信使RNA（mRNA）的降解或者翻譯抑制[6-7]。初步研究[8]顯示在多數慢性淋巴細胞白血病患者中，miR-15和miR-16基因出現缺失或者下調，并且miRNA的表達譜具有高度的組織特異性，對于人類癌癥的分類遠勝于mRNA的表達譜[9]，這一研究引起了眾多科學家對miRNA在癌癥生物學中作用的巨大關注，當miRNA上調或下調時，可能作為癌基因或者抑癌基因在腫瘤的發生、發展過程中起到重要作用。同時，miRNA的表達有時空特異性，不同類型腫瘤在不同時期有不同的miRNA表達譜，這使miRNA可能成為新興的扭轉癌癥表型的治療靶向標志物，并且可以為腫瘤選擇敏感化療藥物提供依據[6, 10]。此外，它們還可能作為生物標志物來判斷癌癥的進展情況及對療效的反應[11]。2008年，三個獨立的研究[12-14]表明，miRNA被釋放至血液中后可以穩定存在，從而使其成為可能的理想的生物標志物。本文就近年來關于血清miRNA對肺癌的診斷、預后及潛在臨床應用價值的研究進展予以綜述。
1 血清miRNA的來源
miRNA無論是在高溫、驟冷，還是在強酸、強堿條件下均能在血液中以非常穩定的形式存在，并能夠抵抗內源性和外源性RNA的降解，這提示細胞外miRNA不可能以裸露的RNA分子形式從死亡的腫瘤細胞中釋放出來。Mitchell等[14]發現合成的miRNA或者純化血漿中的miRNA進入人體血漿中會迅速降解。相反，多項研究[15-17]報道血清miRNAs存在于各種膜結構的囊泡中，如外來體（exosome）、微泡和凋亡小體，并與蛋白質或高密度脂蛋白復合物關聯[18-19]。
2011年Arroyo等[18]采用體積排阻色譜法分餾人血漿miRNA并對其含量進行定量分析，發現大多數血液中miRNA與核糖核蛋白復合物結合，只有小部分特殊的miRNA存在于囊泡中，而且不同群體的miRNA存在方式并不相同，大約66%的miRNA與核糖核蛋白復合物結合，約15%的miRNA存在于囊泡中，其余的可以以兩種形式存在。此外，該研究還顯示這些核糖核蛋白復合物含有Ago2（Argonaute 2）蛋白，從而提高了功能性miRNA效應器復合物（miRNA-RISC，miRISC）被釋放到血液循環的可能性，但是至于miRNA/Ago2復合體如何脫離細胞、被受體細胞攝取的具體機制仍有待進一步研究。Vickers等[19]證明了人血漿中的miRNA是通過高密度脂蛋白被輸送至受體細胞，并發現這個過程受到中性鞘磷脂酶2的抑制，中性鞘磷脂酶2是調節神經酰胺生物合成的酶，而Mittelbrunn等[20]此前已證實中性鞘磷脂酶2會觸發外來體分泌miRNA，這進而表明，中性鞘磷脂酶2在這兩種miRNA分泌機制中所起的作用是相反的。就目前報道而言，miRNA釋放入血的途徑、穩定存在的機制以及腫瘤衍生的細胞外miRNA的功能及作用等仍有待進一步研究來闡明。
2 血清miRNA在肺癌診斷中的應用
Chen等[12]在2008年首先采用Solexa測序技術對NSCLC患者血清中的miRNA序列進行了全面分析，在這項研究中，包括11例NSCLC患者、11例健康男性以及10例健康女性，結果顯示，63種存在于NSCLC患者血清中的miRNA沒有在健康個體血清中被發現，而28種正常血清中存在的miRNA在NSCLC患者中缺失。除此之外，健康人血清和血細胞miRNA表達譜基本相同，而NSCLC患者的血清miRNA表達譜與血細胞miRNA表達譜明顯不同，有76種miRNA僅存在于NSCLC患者血清中，這有可能是從癌細胞和/或腫瘤微環境中衍生出來。進一步研究采用一個獨立的樣品組，包括152例NSCLC患者血清及75例健康個體，對miR-25和miR-223檢測，研究結果證明NSCLC患者血清中的這兩種miRNA含量顯著高于對照組，但其對肺癌的診斷價值仍有待確定。隨后，大量的研究對細胞外miRNA進行了檢測分析，如血漿、血清、痰液、胸腔積液等，旨在發現其是否與肺癌的診斷存在相關性。
Rabinowits等[21]對成對腫瘤組織及血漿來源的外來體樣本內的12種miRNA的表達水平進行了研究，發現這些miRNA的表達水平在兩種樣本內高度相關，從而表明血漿內的miRNA表達譜可以反映腫瘤的存在，這提示miRNA可以作為生物標志物用于檢測腫瘤復發、對治療的反應及預后的發展。而后通過研究胃癌、卵巢癌、乳頭狀甲狀腺癌的癌組織及血漿中相關miRNA的表達水平得到了類似的結論[22-24]。Mittelbrunn等[20]通過對免疫細胞及其外來體中的miRNA表達譜進行分析后發現存在巨大差異，這意味著特定的miRNA有選擇性地分布在外來體中。Shen等[25]選擇了前期研究中發現的在早期NSCLC癌組織及相鄰正常組織內表達水平差異的12種miRNA，對其在成對的癌組織及血漿樣品中的表達進行分析，發現有5種miRNA的表達在兩種樣本內高度相關（miR-21、miR-210、miR-182過表達，miR-126和miR486-5p的表達下調），并且它們在NSCLC血漿中的表達水平與健康人群對照組中的表達有顯著差異，而其余7種miRNA并沒有這種相關性存在。同時，Zheng等[26]根據公布的微陣列數據選擇了在肺癌組織中最常見的過度表達的15種miRNA，并在NSCLC和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）患者血漿中檢測其表達水平，發現只有3種miRNA的水平較對照組顯著升高。這表明只有特定的miRNA可以從過表達的腫瘤細胞分泌或釋放，而關于miRNA的分泌機制仍需要進一步的研究來闡明。Chen等[27] 2012年通過對400例NSCLC患者和220例健康人群的血清中的91種miRNA對比研究，最后明確了由10種miRNA構成的生物標志物模型，受試者工作特征（receiver opera-ting characteristic，ROC）曲線分析表明，這10種miRNA構成的表達譜能以高達92.5%的敏感度和90%的特異性正確區分NSCLC患者及對照組，這是迄今為止報道的對肺癌診斷最有價值的生物標志物。
作為血清中腫瘤生物標志物的另一個重要方面就是miRNA在血清中穩定存在的時間周期以及在癌癥發生及發展過程中是否可以早期進行檢測。Keller等[28]收集了8例癌癥患者在明確診斷前的兩個時間點、診斷后及6例無癌對照組患者的共29個血清樣本，并對樣本中的904種miRNA進行檢測分析，結果表明，miRNA大致可以穩定幾年時間，但最明顯的變化發生在接近診斷的時間點，然而，研究還發現miRNA表達水平的變化與癌癥的發展過程無明確相關性。Chen等[27]對2004～2005年影像學普查的20 000個血清樣本進行了回顧性研究分析，并對其中沒有癌癥病史的人群進行隨訪至2008年，其中共7例患上NSCLC。對這7例患者及50例隨機選擇的健康人群血清樣本的10種與肺癌相關的miRNA進行評估，發現其中6例患者風險評分明顯增高，時間最長的1例是在腫瘤發生前33.37個月，有趣的是，另外風險評分較低的1例患者在發現肺癌時為Ⅰ期NSCLC，其標本是在診斷前22.17個月留取，這提示有可能在留取標本時該患者并沒有患上肺癌。Boeri等[29]對參與了兩個獨立的CT篩查試驗的41例患者明確診斷前的血漿標本miRNA表達譜進行了檢測，發現可以通過檢測診斷前1～2年的血漿樣本中的miRNA判斷無癌吸煙者罹患癌癥的風險（敏感度為80%，特異性為90%）。Bianchi等[30]通過研究確定了34種miRNA可以在無癥狀人群中進行早期NSCLC診斷，準確率可達到80%。這些研究強烈支持了與癌癥相關的miRNA可能在肺癌出現臨床癥狀前幾年就被釋放到血液中的觀點。
在目前的眾多研究中，除了miR-21外，其余的miRNA檢測在對肺癌診斷的價值篩選上存在不同的結果和爭議。出現這種變化的一個主要原因可能是對定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）結果歸一化方法的選擇。與分析組織標本的基因表達不同，目前對血清/血漿中可以被作為標準化內部控制的看家基因并沒有達成共識，這導致眾多研究所得到的結果并不一致。非編碼RNA（如U6小核RNA）、核仁以及核糖體rRNA已被證明在等離子體微泡中高度可變，在血清中易分解，因此不適合作為內部對照組[12, 31]。另一個問題是大部分研究的樣本數量相對較少，容易出現假陽性。此外，Wang等[32]及Reid等[33]研究發現一些生理疾病，如妊娠和各種常見疾病，如急性或慢性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病等均有miRNA釋放到血液中，但大多數研究進行癌癥的對照組匹配時通常按年齡、性別和吸煙狀況，而沒有考慮到他們的既往疾病史。
關于與診斷相關的血液中的miRNA是從哪種類型的細胞中釋放目前并不完全清楚。Mitchell等[14]的研究提供了miRNA是從實體腫瘤釋放至血液中的證據，這項研究利用異種移植模型系統，在裸鼠體內接種人源前列腺癌細胞，發現在人前列腺癌細胞中高表達的miRNA可在異種移植裸鼠的血漿中被檢測出。Chen等[12]研究顯示在健康個體中，血清和血細胞miRNA表達譜幾乎是相同的，但是在不同的疾病狀態下，相關miRNA在血液中存在而在血細胞中并沒有，這表明，健康個體的大部分血清miRNA是從血液細胞衍生的，而該疾病特異性miRNA有可能從受疾病影響的組織中產生，但尚無確鑿證據證明所有與癌癥相關的循環miRNA是由癌細胞自身釋放。Shen等[25]及Zheng等[26]研究發現腫瘤組織和血漿中的miRNA表達水平存在一致性，這為腫瘤細胞釋放miRNA入血提供了又一間接證據。然而，不能排除循環miRNA從受腫瘤影響或者干擾腫瘤生長的各種細胞中釋放的可能，如腫瘤微環境中的血管內皮細胞、腫瘤相關成纖維細胞以及各種免疫細胞。Yang等[34]最近的一項研究就表明腫瘤相關巨噬細胞分泌的微泡中含有能促進乳腺癌細胞侵襲的miRNA，由非腫瘤細胞分泌的miRNA是否具有診斷意義仍有待確定。
3 血清miRNA與肺癌預后及治療預測
多項研究[35-38]顯示miRNA通過參與多種生物過程的信號轉導途徑影響腫瘤的侵襲及對化療藥物的敏感性，包括細胞分化、增殖、遷移、上皮-間質轉化、DNA損傷修復、細胞凋亡等。這些研究提出了組織miRNA表達譜可以作為提供有關疾病自然病程信息的預后標志物及對治療反應的預測生物標志物的想法。目前已有多項研究發現miRNA表達譜的變化可以預測肺癌的臨床療效。Yu等[39]對112例NSCLC腫瘤標本的miRNA表達譜進行研究，發現miR-221、let-7a、miR-137、miR-372和miR-182*可以比較準確地預測總生存期（overall survival，OS）和無復發生存率。Ranade等[40]分析了34例SCLC腫瘤標本的miRNA表達譜，顯示miR-92a-2*、miR-147和miR-574-5p與化療耐藥和OS顯著相關。Raponi等[41]對54例肺鱗狀細胞癌患者的研究分析顯示20種miRNA與OS顯著相關，并且miR-146b對癌癥的預后判斷準確率可以達到78%。
然而，腫瘤組織標本miRNA尤其是在手術后無法用于顯示疾病的進展和轉移癌細胞克隆期間的分子變化。因此，眾多學者們期望血液中的miRNA表達譜可以為癌癥的預后、治療反應的預測、疾病發展過程的監測及療效的判斷提供信息，并進行了相關研究。Hu等[42]通過Solexa深度測序比較了30例長期生存和30例短期生存的NSCLC患者血清miRNA表達譜，發現miR-486、miR-30d、miR-1和miR-499表達水平在兩組患者中存在顯著差異，然后在243例Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者血清中檢測這4種miRNA的表達水平，研究其與生存時間的相關性。結果顯示miR-486、miR-30d的高表達和miR-1、miR-499的低表達與較低的中位生存時間（median survival time，MST）顯著相關，并增加了癌癥死亡的概率。具有這4種miRNA組合特性的癌癥患者的死亡風險提高了9.31%，并顯著縮短患者的MST，這可能有助于早期判斷輔助化療是否有效及對病程和預測復發的監測。
Wang等[43]、Wei等[44]及Liu等[45]三組幾乎同時報道，在血清或血漿中高表達的miR-21與NSCLC患者的淋巴結轉移、較晚的臨床分期和存活率顯著相關。miR-21在多種癌癥中過度表達并與疾病的侵襲性密切相關，包括細胞去分化、增殖、凋亡、遷移及侵襲[46]，這就很容易讓人推測血液中的miR-21的高表達反映了它在腫瘤細胞中的高表達。但是，Liu等[45]研究顯示血清中miR-21的水平與腫瘤組織并不相關。Hu等[42]的研究也發現先前報道的作為腫瘤組織生物標志物的miRNA在血清組織中無法通過深度測序檢測出。這些研究提示我們具有診斷或預后意義的血清miRNA表達譜至少是部分地獨立于腫瘤組織中的miRNA。
4 結語
自從發現癌癥患者血液中存在與腫瘤相關的miRNA后，科學家們進行了大量的研究致力于尋找可以作為肺癌早期診斷及療效判斷的生物標志物的miRNA。但大部分的研究是就NSCLC患者進行的，涉及SCLC的研究較少。目前已有研究發現特定的miRNA表達譜對肺癌而言具有顯著的特異性及敏感性，但尚不能判定這些標志物可以作為臨床診斷的工具。但毫無疑問，miRNA表達譜的價值遠高于單一miRNA。
用于預測或監測治療反應的非侵入性生物標志物的發現對于改善肺癌的治療非常重要。已有少量研究發現了血液中的miRNA在癌癥預后及療效預測上的重大意義，并發現與腫瘤的轉移、臨床分期及生存時間顯著相關，并有證據表明，與癌癥相關的miRNA在疾病臨床表現出現之前就已釋放至血液循環中。但到目前為止，僅有miR-21被證明與以鉑類為主的化療敏感性相關聯，但其預測價值對于其作為一個獨立的生物標志物而言并不高。
血清miRNA與肺癌關系的研究起步較晚，分泌miRNA的細胞類型、分泌機制尚不明確，血清miRNA應用于臨床仍需大量研究，但對上述問題的深入研究將有助于肺癌的早期診斷及治療方案的選擇，以及針對血清miRNA的新的治療策略的出現。
據WHO報道，肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位于惡性腫瘤的首位，2012年，全球有820萬患者死于癌癥，其中159萬患者死于原發性肺癌[1]。目前僅有30%的肺癌患者能夠獲得較早的診斷并獲得手術治療的機會，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）ⅠA期患者手術后5年生存率可以達到81.9%，而ⅡB期則降至45.2% [2]，對于失去手術機會的晚期患者5年生存率僅有2.8% [3]。
適用于早期肺癌篩查的分子標志物有助于肺癌早期發現早期治療。最理想的生物標志物應該能夠在體液中穩定存在并利于檢測。近年來，大量研究[4-5]發現微小RNA（microRNA，miRNA）幾乎參與了所有細胞生物學行為的調控，并在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。研究發現miRNA被釋放入血后會穩定存在而不被RNA酶降解，而且不同的腫瘤可能具有不同的miRNA表達譜，這提示miRNA有望成為適用于腫瘤診斷、靶向治療及預后的分子標志物。因此，miRNA逐漸成為眾多科學家研究的熱點之一，miRNA與肺癌的相關性研究也越來越多見。
miRNA是一類長度為19～22個核苷酸的內源性非編碼RNA，成熟miRNA結合到RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）上，導致信使RNA（mRNA）的降解或者翻譯抑制[6-7]。初步研究[8]顯示在多數慢性淋巴細胞白血病患者中，miR-15和miR-16基因出現缺失或者下調，并且miRNA的表達譜具有高度的組織特異性，對于人類癌癥的分類遠勝于mRNA的表達譜[9]，這一研究引起了眾多科學家對miRNA在癌癥生物學中作用的巨大關注，當miRNA上調或下調時，可能作為癌基因或者抑癌基因在腫瘤的發生、發展過程中起到重要作用。同時，miRNA的表達有時空特異性，不同類型腫瘤在不同時期有不同的miRNA表達譜，這使miRNA可能成為新興的扭轉癌癥表型的治療靶向標志物，并且可以為腫瘤選擇敏感化療藥物提供依據[6, 10]。此外，它們還可能作為生物標志物來判斷癌癥的進展情況及對療效的反應[11]。2008年，三個獨立的研究[12-14]表明，miRNA被釋放至血液中后可以穩定存在，從而使其成為可能的理想的生物標志物。本文就近年來關于血清miRNA對肺癌的診斷、預后及潛在臨床應用價值的研究進展予以綜述。
1 血清miRNA的來源
miRNA無論是在高溫、驟冷，還是在強酸、強堿條件下均能在血液中以非常穩定的形式存在，并能夠抵抗內源性和外源性RNA的降解，這提示細胞外miRNA不可能以裸露的RNA分子形式從死亡的腫瘤細胞中釋放出來。Mitchell等[14]發現合成的miRNA或者純化血漿中的miRNA進入人體血漿中會迅速降解。相反，多項研究[15-17]報道血清miRNAs存在于各種膜結構的囊泡中，如外來體（exosome）、微泡和凋亡小體，并與蛋白質或高密度脂蛋白復合物關聯[18-19]。
2011年Arroyo等[18]采用體積排阻色譜法分餾人血漿miRNA并對其含量進行定量分析，發現大多數血液中miRNA與核糖核蛋白復合物結合，只有小部分特殊的miRNA存在于囊泡中，而且不同群體的miRNA存在方式并不相同，大約66%的miRNA與核糖核蛋白復合物結合，約15%的miRNA存在于囊泡中，其余的可以以兩種形式存在。此外，該研究還顯示這些核糖核蛋白復合物含有Ago2（Argonaute 2）蛋白，從而提高了功能性miRNA效應器復合物（miRNA-RISC，miRISC）被釋放到血液循環的可能性，但是至于miRNA/Ago2復合體如何脫離細胞、被受體細胞攝取的具體機制仍有待進一步研究。Vickers等[19]證明了人血漿中的miRNA是通過高密度脂蛋白被輸送至受體細胞，并發現這個過程受到中性鞘磷脂酶2的抑制，中性鞘磷脂酶2是調節神經酰胺生物合成的酶，而Mittelbrunn等[20]此前已證實中性鞘磷脂酶2會觸發外來體分泌miRNA，這進而表明，中性鞘磷脂酶2在這兩種miRNA分泌機制中所起的作用是相反的。就目前報道而言，miRNA釋放入血的途徑、穩定存在的機制以及腫瘤衍生的細胞外miRNA的功能及作用等仍有待進一步研究來闡明。
2 血清miRNA在肺癌診斷中的應用
Chen等[12]在2008年首先采用Solexa測序技術對NSCLC患者血清中的miRNA序列進行了全面分析，在這項研究中，包括11例NSCLC患者、11例健康男性以及10例健康女性，結果顯示，63種存在于NSCLC患者血清中的miRNA沒有在健康個體血清中被發現，而28種正常血清中存在的miRNA在NSCLC患者中缺失。除此之外，健康人血清和血細胞miRNA表達譜基本相同，而NSCLC患者的血清miRNA表達譜與血細胞miRNA表達譜明顯不同，有76種miRNA僅存在于NSCLC患者血清中，這有可能是從癌細胞和/或腫瘤微環境中衍生出來。進一步研究采用一個獨立的樣品組，包括152例NSCLC患者血清及75例健康個體，對miR-25和miR-223檢測，研究結果證明NSCLC患者血清中的這兩種miRNA含量顯著高于對照組，但其對肺癌的診斷價值仍有待確定。隨后，大量的研究對細胞外miRNA進行了檢測分析，如血漿、血清、痰液、胸腔積液等，旨在發現其是否與肺癌的診斷存在相關性。
Rabinowits等[21]對成對腫瘤組織及血漿來源的外來體樣本內的12種miRNA的表達水平進行了研究，發現這些miRNA的表達水平在兩種樣本內高度相關，從而表明血漿內的miRNA表達譜可以反映腫瘤的存在，這提示miRNA可以作為生物標志物用于檢測腫瘤復發、對治療的反應及預后的發展。而后通過研究胃癌、卵巢癌、乳頭狀甲狀腺癌的癌組織及血漿中相關miRNA的表達水平得到了類似的結論[22-24]。Mittelbrunn等[20]通過對免疫細胞及其外來體中的miRNA表達譜進行分析后發現存在巨大差異，這意味著特定的miRNA有選擇性地分布在外來體中。Shen等[25]選擇了前期研究中發現的在早期NSCLC癌組織及相鄰正常組織內表達水平差異的12種miRNA，對其在成對的癌組織及血漿樣品中的表達進行分析，發現有5種miRNA的表達在兩種樣本內高度相關（miR-21、miR-210、miR-182過表達，miR-126和miR486-5p的表達下調），并且它們在NSCLC血漿中的表達水平與健康人群對照組中的表達有顯著差異，而其余7種miRNA并沒有這種相關性存在。同時，Zheng等[26]根據公布的微陣列數據選擇了在肺癌組織中最常見的過度表達的15種miRNA，并在NSCLC和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）患者血漿中檢測其表達水平，發現只有3種miRNA的水平較對照組顯著升高。這表明只有特定的miRNA可以從過表達的腫瘤細胞分泌或釋放，而關于miRNA的分泌機制仍需要進一步的研究來闡明。Chen等[27] 2012年通過對400例NSCLC患者和220例健康人群的血清中的91種miRNA對比研究，最后明確了由10種miRNA構成的生物標志物模型，受試者工作特征（receiver opera-ting characteristic，ROC）曲線分析表明，這10種miRNA構成的表達譜能以高達92.5%的敏感度和90%的特異性正確區分NSCLC患者及對照組，這是迄今為止報道的對肺癌診斷最有價值的生物標志物。
作為血清中腫瘤生物標志物的另一個重要方面就是miRNA在血清中穩定存在的時間周期以及在癌癥發生及發展過程中是否可以早期進行檢測。Keller等[28]收集了8例癌癥患者在明確診斷前的兩個時間點、診斷后及6例無癌對照組患者的共29個血清樣本，并對樣本中的904種miRNA進行檢測分析，結果表明，miRNA大致可以穩定幾年時間，但最明顯的變化發生在接近診斷的時間點，然而，研究還發現miRNA表達水平的變化與癌癥的發展過程無明確相關性。Chen等[27]對2004～2005年影像學普查的20 000個血清樣本進行了回顧性研究分析，并對其中沒有癌癥病史的人群進行隨訪至2008年，其中共7例患上NSCLC。對這7例患者及50例隨機選擇的健康人群血清樣本的10種與肺癌相關的miRNA進行評估，發現其中6例患者風險評分明顯增高，時間最長的1例是在腫瘤發生前33.37個月，有趣的是，另外風險評分較低的1例患者在發現肺癌時為Ⅰ期NSCLC，其標本是在診斷前22.17個月留取，這提示有可能在留取標本時該患者并沒有患上肺癌。Boeri等[29]對參與了兩個獨立的CT篩查試驗的41例患者明確診斷前的血漿標本miRNA表達譜進行了檢測，發現可以通過檢測診斷前1～2年的血漿樣本中的miRNA判斷無癌吸煙者罹患癌癥的風險（敏感度為80%，特異性為90%）。Bianchi等[30]通過研究確定了34種miRNA可以在無癥狀人群中進行早期NSCLC診斷，準確率可達到80%。這些研究強烈支持了與癌癥相關的miRNA可能在肺癌出現臨床癥狀前幾年就被釋放到血液中的觀點。
在目前的眾多研究中，除了miR-21外，其余的miRNA檢測在對肺癌診斷的價值篩選上存在不同的結果和爭議。出現這種變化的一個主要原因可能是對定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）結果歸一化方法的選擇。與分析組織標本的基因表達不同，目前對血清/血漿中可以被作為標準化內部控制的看家基因并沒有達成共識，這導致眾多研究所得到的結果并不一致。非編碼RNA（如U6小核RNA）、核仁以及核糖體rRNA已被證明在等離子體微泡中高度可變，在血清中易分解，因此不適合作為內部對照組[12, 31]。另一個問題是大部分研究的樣本數量相對較少，容易出現假陽性。此外，Wang等[32]及Reid等[33]研究發現一些生理疾病，如妊娠和各種常見疾病，如急性或慢性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病等均有miRNA釋放到血液中，但大多數研究進行癌癥的對照組匹配時通常按年齡、性別和吸煙狀況，而沒有考慮到他們的既往疾病史。
關于與診斷相關的血液中的miRNA是從哪種類型的細胞中釋放目前并不完全清楚。Mitchell等[14]的研究提供了miRNA是從實體腫瘤釋放至血液中的證據，這項研究利用異種移植模型系統，在裸鼠體內接種人源前列腺癌細胞，發現在人前列腺癌細胞中高表達的miRNA可在異種移植裸鼠的血漿中被檢測出。Chen等[12]研究顯示在健康個體中，血清和血細胞miRNA表達譜幾乎是相同的，但是在不同的疾病狀態下，相關miRNA在血液中存在而在血細胞中并沒有，這表明，健康個體的大部分血清miRNA是從血液細胞衍生的，而該疾病特異性miRNA有可能從受疾病影響的組織中產生，但尚無確鑿證據證明所有與癌癥相關的循環miRNA是由癌細胞自身釋放。Shen等[25]及Zheng等[26]研究發現腫瘤組織和血漿中的miRNA表達水平存在一致性，這為腫瘤細胞釋放miRNA入血提供了又一間接證據。然而，不能排除循環miRNA從受腫瘤影響或者干擾腫瘤生長的各種細胞中釋放的可能，如腫瘤微環境中的血管內皮細胞、腫瘤相關成纖維細胞以及各種免疫細胞。Yang等[34]最近的一項研究就表明腫瘤相關巨噬細胞分泌的微泡中含有能促進乳腺癌細胞侵襲的miRNA，由非腫瘤細胞分泌的miRNA是否具有診斷意義仍有待確定。
3 血清miRNA與肺癌預后及治療預測
多項研究[35-38]顯示miRNA通過參與多種生物過程的信號轉導途徑影響腫瘤的侵襲及對化療藥物的敏感性，包括細胞分化、增殖、遷移、上皮-間質轉化、DNA損傷修復、細胞凋亡等。這些研究提出了組織miRNA表達譜可以作為提供有關疾病自然病程信息的預后標志物及對治療反應的預測生物標志物的想法。目前已有多項研究發現miRNA表達譜的變化可以預測肺癌的臨床療效。Yu等[39]對112例NSCLC腫瘤標本的miRNA表達譜進行研究，發現miR-221、let-7a、miR-137、miR-372和miR-182*可以比較準確地預測總生存期（overall survival，OS）和無復發生存率。Ranade等[40]分析了34例SCLC腫瘤標本的miRNA表達譜，顯示miR-92a-2*、miR-147和miR-574-5p與化療耐藥和OS顯著相關。Raponi等[41]對54例肺鱗狀細胞癌患者的研究分析顯示20種miRNA與OS顯著相關，并且miR-146b對癌癥的預后判斷準確率可以達到78%。
然而，腫瘤組織標本miRNA尤其是在手術后無法用于顯示疾病的進展和轉移癌細胞克隆期間的分子變化。因此，眾多學者們期望血液中的miRNA表達譜可以為癌癥的預后、治療反應的預測、疾病發展過程的監測及療效的判斷提供信息，并進行了相關研究。Hu等[42]通過Solexa深度測序比較了30例長期生存和30例短期生存的NSCLC患者血清miRNA表達譜，發現miR-486、miR-30d、miR-1和miR-499表達水平在兩組患者中存在顯著差異，然后在243例Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者血清中檢測這4種miRNA的表達水平，研究其與生存時間的相關性。結果顯示miR-486、miR-30d的高表達和miR-1、miR-499的低表達與較低的中位生存時間（median survival time，MST）顯著相關，并增加了癌癥死亡的概率。具有這4種miRNA組合特性的癌癥患者的死亡風險提高了9.31%，并顯著縮短患者的MST，這可能有助于早期判斷輔助化療是否有效及對病程和預測復發的監測。
Wang等[43]、Wei等[44]及Liu等[45]三組幾乎同時報道，在血清或血漿中高表達的miR-21與NSCLC患者的淋巴結轉移、較晚的臨床分期和存活率顯著相關。miR-21在多種癌癥中過度表達并與疾病的侵襲性密切相關，包括細胞去分化、增殖、凋亡、遷移及侵襲[46]，這就很容易讓人推測血液中的miR-21的高表達反映了它在腫瘤細胞中的高表達。但是，Liu等[45]研究顯示血清中miR-21的水平與腫瘤組織并不相關。Hu等[42]的研究也發現先前報道的作為腫瘤組織生物標志物的miRNA在血清組織中無法通過深度測序檢測出。這些研究提示我們具有診斷或預后意義的血清miRNA表達譜至少是部分地獨立于腫瘤組織中的miRNA。
4 結語
自從發現癌癥患者血液中存在與腫瘤相關的miRNA后，科學家們進行了大量的研究致力于尋找可以作為肺癌早期診斷及療效判斷的生物標志物的miRNA。但大部分的研究是就NSCLC患者進行的，涉及SCLC的研究較少。目前已有研究發現特定的miRNA表達譜對肺癌而言具有顯著的特異性及敏感性，但尚不能判定這些標志物可以作為臨床診斷的工具。但毫無疑問，miRNA表達譜的價值遠高于單一miRNA。
用于預測或監測治療反應的非侵入性生物標志物的發現對于改善肺癌的治療非常重要。已有少量研究發現了血液中的miRNA在癌癥預后及療效預測上的重大意義，并發現與腫瘤的轉移、臨床分期及生存時間顯著相關，并有證據表明，與癌癥相關的miRNA在疾病臨床表現出現之前就已釋放至血液循環中。但到目前為止，僅有miR-21被證明與以鉑類為主的化療敏感性相關聯，但其預測價值對于其作為一個獨立的生物標志物而言并不高。
血清miRNA與肺癌關系的研究起步較晚，分泌miRNA的細胞類型、分泌機制尚不明確，血清miRNA應用于臨床仍需大量研究，但對上述問題的深入研究將有助于肺癌的早期診斷及治療方案的選擇，以及針對血清miRNA的新的治療策略的出現。