引用本文： 秦超毅, 古君, 錢宏, 石應康, 蒙煒. 體外循環圍手術期血液中線粒體DNA濃度變化. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(3): 241-244. doi: 10.7507/1007-4848.20150066 復制
體外循環（cardiopulmonary bypass，CPB）是心內直視手術中不可或缺的技術環節，目前許多研究顯示CPB導致的短暫缺血/再灌注過程可能引起循環系統中大量炎性介質釋放，其機制尚未完全知曉[1]。最新研究表明，線粒體DNA（mtDNA）作為一種損傷相關分子模式，在引起炎性介質釋放過程中起到重要作用[2-3]。本研究旨在分析CPB手術圍術期血漿中的mtDNA濃度變化，為進一步研究mtDNA對于CPB術后大量炎性介質釋放的作用機制提供基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
連續納入在2014年7～12月間四川大學華西醫院心臟大血管外科行主動脈瓣+二尖瓣置換術（雙瓣膜置換術）的患者共40例，其中男16例、女14例，平均年齡（48.7±11.0）歲，平均體重（59.0±6.9）kg。患者均行心臟彩色超聲診斷為風濕性心臟病或心瓣膜病。排除合并其他心血管疾病以及感染性疾病、肝、腎、凝血功能異常的患者。所有患者均簽署知情同意書，本研究經四川大學華西醫院倫理委員會批準。
1.2 方法
1.2.1 觀察指標
全組患者均在以下6個時間點使用EDTA抗凝管采集靜脈血樣本：麻醉誘導后（T1）、CPB前1 min（T2）、升主動脈開放后1 min（T3）、雙瓣膜置換術后6 h（T4）、雙瓣膜置換術后24 h（T5）、雙瓣膜置換術后48 h（T6）。全部靜脈血樣本在4°C下以1 000 rpm/min離心15 min，取上清液獲得血漿，并置于-80°C冰箱保存。觀察不同時間點mtDNA濃度變化。
1.2.2 血漿DNA的制備
使用DNA提取試劑盒（#69504，Qiagen，USA）提取血漿樣本中的DNA。取50μl血漿樣本加入50μl磷酸鹽緩沖液（PBS），充分混合均勻后在4°C離心機中以16 100 g離心15 min，后取90μl上清液置于1.5 ml EP管中。按照試劑盒說明書獲取血漿中DNA：將血漿樣本與裂解液、蛋白酶K混合，在56°C下放置15 min。經多次DNA層析柱過濾后，將DNA溶解于200μl DNA溶解液中，用于下一步熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）。
1.2.3 熒光定量PCR測定mtDNA濃度
血漿中mtDNA濃度測定使用基于SYBR-Green染色的熒光定量PCR技術分析。人類mtDNA（human NADH dehydrogenase 1 gene）引物上游為：CGAGCAGTAG-CCCAAACAAT；下游為：TGTGATAAGGGTGGAG-AGGTT。
熒光定量PCR檢測mtDNA濃度步驟為：初始階段2 min，50°C；第一步變性溫度為95°C，3 min；進行95°C 10 s、55°C 15 s和72°C 10 s循環，共39個循環。擴增曲線和融解曲線見圖 1。
圖1
擴增曲線和融解曲線
注：A為擴增曲線；B為融解曲線
標準曲線為攜帶有人類mtDNA的質粒（SC101172，ORIGENE，USA）10倍梯度稀釋獲得。mtDNA濃度使用標準的轉換系統轉換成拷貝數（copies）（http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html）。血漿mtDNA濃度的計算公式為：
| $ {\rm{c}} = {\rm{Q \times }}{{\rm{V}}_{{\rm{DNA}}}}{\rm{/}}{{\rm{V}}_{{\rm{PCR}}}}{\rm{ \times 1/}}{{\rm{V}}_{{\rm{EXT}}}} $ |
其中c為血漿中mtDNA的濃度；Q為熒光定量PCR檢測的樣本中mtDNA的拷貝數；VDNA為每個血漿樣本中提取DNA的總體積，本研究中為200μl；VPCR代表熒光定量PCR時加入DNA的體積，本研究中為1μl；VEXT代表提取DNA時使用的血漿的量，本實驗中為50μl。
1.3 統計學分析
采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 臨床早期結果
全組主動脈阻斷時間為（118.0±15.8）min，平均CPB時間為（134.1±14.4）min，平均住ICU時間（1.9±2.2）d。全組術后無死亡，術后發生低心排血量綜合征3例，腎功能衰竭1例，未見其他并發癥。
2.2 血漿mtDNA濃度變化
麻醉誘導后（T1）和CPB前1 min（T2）的血漿mtDNA濃度差異無統計學意義（P > 0.05），升主動脈開放后1 min（T3）、雙瓣膜置換術后6 h（T4）、雙瓣膜置換術后24 h（T5）的血漿mtDNA濃度均較T1升高（P < 0.05），而雙瓣膜置換術后48 h（T6）的血漿mtDNA濃度較T5時間點降低（P < 0.05），但仍未恢復至正常水平（與T1比較，P < 0.05）。見表 1、圖 2。
表1
血漿mtDNA濃度變化（
圖2
血漿mtDNA濃度變化曲線
3 討論
CPB手術會引起不同程度的全身炎癥反應，多項研究顯示在CPB術后的血樣本中TNF-α、IL-6等促炎因子濃度明顯升高[4-5]，而各種促炎因子的釋放會引發進一步大規模炎癥介質釋放，從而影響術后恢復，對預后也起到關鍵作用[6]。急性腎衰竭、急性肺損傷等作為CPB手術后主要的并發癥，正是由于術后TNF-α、IL-1β等促炎因子大量升高引起[7-9]。mtDNA作為另一種促炎因子在循環系統中濃度升高會影響患者病情的轉歸和預后。有研究[10]顯示，創傷手術后患者血漿mtDNA含量較健康人血漿中明顯升高，并且復雜手術明顯高于簡單手術。另外，mtDNA同樣可以作為一種分子標志物來預測住ICU患者的預后以及28 d死亡率[11]。
人類mtDNA是含有16 569個核苷酸堿基對的環狀雙鏈分子，共包含有37個基因，包含2個rRNA基因、22個tRNA基因、13個結構蛋白基因，共編碼約3%線粒體蛋白質[12-13]。由于在進化中溶酶體重復利用胞質中的物質，損傷的線粒體在細胞自噬過程中會降解，含有暴露的未甲基化的炎性序列（CpG序列）的mtDNA就會釋放進入循環系統，引起機體的炎性反應[14]。
本研究的結果說明CPB手術后，循環血液中mtDNA濃度隨時間推移而逐漸增高，并在術后24 h達到一個高峰，之后逐漸回落。本研究發現在心臟手術CPB后循環血中mtDNA濃度隨術后時間推移而先升高后降低，其他研究結果表明，CPB術后TNF-α、IL-6、IL-10均在術后6 h內達到峰值[15-18]，因此推測mtDNA可能作為一種在相對較晚時間出現或者繼發的促炎因子影響機體的炎性反應。
相較于mtDNA在創傷及重癥監護病人的研究來說，在體外循環下心臟手術圍手術期的mtDNA變化及其在術后炎性反應作用機制方面尚缺乏大量研究。心臟手術后急性腎功能損傷等并發癥多數與全身炎癥反應有關，而有研究提示mtDNA與急性腎功能衰竭、動脈粥樣硬化等炎性反應有密切關聯，甚至在癌癥、老齡化過程中都起到重要作用[19-22]。
綜上所述，本研究首次發現了CPB手術后mtDNA在循環血中濃度逐漸升高，并且于術后24 h到達最高峰后緩慢回落。本研究現階段仍存在不足：第一，本研究探討CPB圍手術期循環血中mtDNA變化，未設置對照組（未進行CPB的心臟手術患者）研究，僅采取病例的前后對照。第二，本研究旨在揭示循環血中mtDNA在CPB圍手術期的變化，為進一步研究提供臨床證據，尚未進行mtDNA在CPB術后的炎性反應的具體作用機制以及影響mtDNA釋放入血原因的研究分析。目前針對循環血中mtDNA在炎性反應中作用機制的研究較少，有研究顯示mtDNA主要刺激中性粒細胞及內皮細胞的激活從而影響機體的炎性反應，通過激活TLR9受體而激活細胞內的炎性分子通路而影響不同器官組織的炎性反應[23-25]。我們將進一步研究mtDNA引起炎性反應的作用機制，明確mtDNA與術后炎性反應以及預后的關系。
體外循環（cardiopulmonary bypass，CPB）是心內直視手術中不可或缺的技術環節，目前許多研究顯示CPB導致的短暫缺血/再灌注過程可能引起循環系統中大量炎性介質釋放，其機制尚未完全知曉[1]。最新研究表明，線粒體DNA（mtDNA）作為一種損傷相關分子模式，在引起炎性介質釋放過程中起到重要作用[2-3]。本研究旨在分析CPB手術圍術期血漿中的mtDNA濃度變化，為進一步研究mtDNA對于CPB術后大量炎性介質釋放的作用機制提供基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
連續納入在2014年7～12月間四川大學華西醫院心臟大血管外科行主動脈瓣+二尖瓣置換術（雙瓣膜置換術）的患者共40例，其中男16例、女14例，平均年齡（48.7±11.0）歲，平均體重（59.0±6.9）kg。患者均行心臟彩色超聲診斷為風濕性心臟病或心瓣膜病。排除合并其他心血管疾病以及感染性疾病、肝、腎、凝血功能異常的患者。所有患者均簽署知情同意書，本研究經四川大學華西醫院倫理委員會批準。
1.2 方法
1.2.1 觀察指標
全組患者均在以下6個時間點使用EDTA抗凝管采集靜脈血樣本：麻醉誘導后（T1）、CPB前1 min（T2）、升主動脈開放后1 min（T3）、雙瓣膜置換術后6 h（T4）、雙瓣膜置換術后24 h（T5）、雙瓣膜置換術后48 h（T6）。全部靜脈血樣本在4°C下以1 000 rpm/min離心15 min，取上清液獲得血漿，并置于-80°C冰箱保存。觀察不同時間點mtDNA濃度變化。
1.2.2 血漿DNA的制備
使用DNA提取試劑盒（#69504，Qiagen，USA）提取血漿樣本中的DNA。取50μl血漿樣本加入50μl磷酸鹽緩沖液（PBS），充分混合均勻后在4°C離心機中以16 100 g離心15 min，后取90μl上清液置于1.5 ml EP管中。按照試劑盒說明書獲取血漿中DNA：將血漿樣本與裂解液、蛋白酶K混合，在56°C下放置15 min。經多次DNA層析柱過濾后，將DNA溶解于200μl DNA溶解液中，用于下一步熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）。
1.2.3 熒光定量PCR測定mtDNA濃度
血漿中mtDNA濃度測定使用基于SYBR-Green染色的熒光定量PCR技術分析。人類mtDNA（human NADH dehydrogenase 1 gene）引物上游為：CGAGCAGTAG-CCCAAACAAT；下游為：TGTGATAAGGGTGGAG-AGGTT。
熒光定量PCR檢測mtDNA濃度步驟為：初始階段2 min，50°C；第一步變性溫度為95°C，3 min；進行95°C 10 s、55°C 15 s和72°C 10 s循環，共39個循環。擴增曲線和融解曲線見圖 1。
圖1
擴增曲線和融解曲線
注：A為擴增曲線；B為融解曲線
標準曲線為攜帶有人類mtDNA的質粒（SC101172，ORIGENE，USA）10倍梯度稀釋獲得。mtDNA濃度使用標準的轉換系統轉換成拷貝數（copies）（http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html）。血漿mtDNA濃度的計算公式為：
| $ {\rm{c}} = {\rm{Q \times }}{{\rm{V}}_{{\rm{DNA}}}}{\rm{/}}{{\rm{V}}_{{\rm{PCR}}}}{\rm{ \times 1/}}{{\rm{V}}_{{\rm{EXT}}}} $ |
其中c為血漿中mtDNA的濃度；Q為熒光定量PCR檢測的樣本中mtDNA的拷貝數；VDNA為每個血漿樣本中提取DNA的總體積，本研究中為200μl；VPCR代表熒光定量PCR時加入DNA的體積，本研究中為1μl；VEXT代表提取DNA時使用的血漿的量，本實驗中為50μl。
1.3 統計學分析
采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 臨床早期結果
全組主動脈阻斷時間為（118.0±15.8）min，平均CPB時間為（134.1±14.4）min，平均住ICU時間（1.9±2.2）d。全組術后無死亡，術后發生低心排血量綜合征3例，腎功能衰竭1例，未見其他并發癥。
2.2 血漿mtDNA濃度變化
麻醉誘導后（T1）和CPB前1 min（T2）的血漿mtDNA濃度差異無統計學意義（P > 0.05），升主動脈開放后1 min（T3）、雙瓣膜置換術后6 h（T4）、雙瓣膜置換術后24 h（T5）的血漿mtDNA濃度均較T1升高（P < 0.05），而雙瓣膜置換術后48 h（T6）的血漿mtDNA濃度較T5時間點降低（P < 0.05），但仍未恢復至正常水平（與T1比較，P < 0.05）。見表 1、圖 2。
表1
血漿mtDNA濃度變化（
圖2
血漿mtDNA濃度變化曲線
3 討論
CPB手術會引起不同程度的全身炎癥反應，多項研究顯示在CPB術后的血樣本中TNF-α、IL-6等促炎因子濃度明顯升高[4-5]，而各種促炎因子的釋放會引發進一步大規模炎癥介質釋放，從而影響術后恢復，對預后也起到關鍵作用[6]。急性腎衰竭、急性肺損傷等作為CPB手術后主要的并發癥，正是由于術后TNF-α、IL-1β等促炎因子大量升高引起[7-9]。mtDNA作為另一種促炎因子在循環系統中濃度升高會影響患者病情的轉歸和預后。有研究[10]顯示，創傷手術后患者血漿mtDNA含量較健康人血漿中明顯升高，并且復雜手術明顯高于簡單手術。另外，mtDNA同樣可以作為一種分子標志物來預測住ICU患者的預后以及28 d死亡率[11]。
人類mtDNA是含有16 569個核苷酸堿基對的環狀雙鏈分子，共包含有37個基因，包含2個rRNA基因、22個tRNA基因、13個結構蛋白基因，共編碼約3%線粒體蛋白質[12-13]。由于在進化中溶酶體重復利用胞質中的物質，損傷的線粒體在細胞自噬過程中會降解，含有暴露的未甲基化的炎性序列（CpG序列）的mtDNA就會釋放進入循環系統，引起機體的炎性反應[14]。
本研究的結果說明CPB手術后，循環血液中mtDNA濃度隨時間推移而逐漸增高，并在術后24 h達到一個高峰，之后逐漸回落。本研究發現在心臟手術CPB后循環血中mtDNA濃度隨術后時間推移而先升高后降低，其他研究結果表明，CPB術后TNF-α、IL-6、IL-10均在術后6 h內達到峰值[15-18]，因此推測mtDNA可能作為一種在相對較晚時間出現或者繼發的促炎因子影響機體的炎性反應。
相較于mtDNA在創傷及重癥監護病人的研究來說，在體外循環下心臟手術圍手術期的mtDNA變化及其在術后炎性反應作用機制方面尚缺乏大量研究。心臟手術后急性腎功能損傷等并發癥多數與全身炎癥反應有關，而有研究提示mtDNA與急性腎功能衰竭、動脈粥樣硬化等炎性反應有密切關聯，甚至在癌癥、老齡化過程中都起到重要作用[19-22]。
綜上所述，本研究首次發現了CPB手術后mtDNA在循環血中濃度逐漸升高，并且于術后24 h到達最高峰后緩慢回落。本研究現階段仍存在不足：第一，本研究探討CPB圍手術期循環血中mtDNA變化，未設置對照組（未進行CPB的心臟手術患者）研究，僅采取病例的前后對照。第二，本研究旨在揭示循環血中mtDNA在CPB圍手術期的變化，為進一步研究提供臨床證據，尚未進行mtDNA在CPB術后的炎性反應的具體作用機制以及影響mtDNA釋放入血原因的研究分析。目前針對循環血中mtDNA在炎性反應中作用機制的研究較少，有研究顯示mtDNA主要刺激中性粒細胞及內皮細胞的激活從而影響機體的炎性反應，通過激活TLR9受體而激活細胞內的炎性分子通路而影響不同器官組織的炎性反應[23-25]。我們將進一步研究mtDNA引起炎性反應的作用機制，明確mtDNA與術后炎性反應以及預后的關系。
